CN112779200B - 高产l-甲硫氨酸的基因工程菌及其构建与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及高产L‑甲硫氨酸的基因工程菌及其构建方法与应用。本发明改造了大肠杆菌的L‑甲硫氨酸合成网络，通过强化大肠杆菌L‑甲硫氨酸合成途径的一碳模块中的metF和GCV，增强大肠杆菌对亚甲基四氢叶酸的利用能力；通过用来源于pTrc99A的Trc启动子置换fliY、malY的原有启动子，增强半胱氨酸/胱氨酸内运途径和半胱氨酸利用途径，解除大肠杆菌因半胱氨酸生成而产生的代谢抑制；通过敲除大肠杆菌本身的glyA和引入来源于Arthrobacter sp.FB24的glyA在质粒上过表达，解除了大肠本身丝氨酸羟甲基转移酶的限制，最后得到含有质粒的高产菌，L‑甲硫氨酸产量从2.8g/L提高到3.83g/L。

Description

高产L-甲硫氨酸的基因工程菌及其构建与应用
(一)技术领域
本发明涉及一种高产L-甲硫氨酸的基因工程菌及其构建方法，以及其在微生物发酵制备L-甲硫氨酸中的应用。
(二)背景技术
甲硫氨酸，又名蛋氨酸，英文名Methionine，全称2-氨基-4-甲巯基丁酸。一种含硫的非极性α-氨基酸，与苏氨酸、赖氨酸等同属于天冬氨酸家族Ⅲ，是哺乳动物的必需氨基酸和生酮氨基酸。1922年由Mueller首次从酪蛋白中分离出来。甲硫氨酸在坚果、肉类及部分植物中大量存在，而动物和人体内却不能自行，缺乏蛋氨酸会引起人类毒血症、肌肉麻痹、精神分裂及发育不良。L-甲硫氨酸目前被广泛应用于医药、食品、饲料等各个领域。
目前蛋氨酸的生产方法主要分为化学合成法、生物发酵法、酶法。蛋氨酸工业化生产方法主要以化学合成法为主，以甲硫醇与丙烯醛加成后经Strecker反应得到D，L型甲硫氨酸混合物。但由于其原料都是有毒物质，比如丙烯醛、甲硫醇、氨和氰化物等，且对环境污染严重，蛋氨酸的大规模化学生产受到了限制。而蛋氨酸的生物发酵方法与其他常规的发酵过程如乳酸发酵等有着本质差别。如乳酸发酵途径中通常会产生能量，而蛋氨酸的合成却需要能量。微生物如果过量合成蛋氨酸会消耗过多的能量，因此微生物仅能生产满足自身需要的蛋氨酸。多年来，科学工作者一直探索利用微生物发酵法生产甲硫氨酸，但由于其合成途径调控过于复杂引，目前还没有适用于甲硫氨酸的工业生产菌株。
目前报道的蛋氨酸的工程菌株包括谷氨酸棒杆菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和百合棒杆菌。诱变筛选抗结构类似物菌株和营养缺陷型菌株是最常用的育种方法。Kumar等采用紫外和亚硝基胍诱变技术处理百合属棒杆菌，筛选获得M-128菌株，其甲硫氨酸产量可以达到2.3g/L。闵伟红，程丽等通过抗结构类似物的筛选以及复合诱变和青霉素浓缩法筛选获得12株赖氨酸和苏氨酸双重营养缺陷型突变株北京棒杆菌，其甲硫氨酸产量最高可以达到3.55g/L。这些传统的改造方法机理难以阐明，工作量大。随着基因技术的发展，开始通过对代谢途径的分析，精准地对关键位点基因进行改造，来获得高产菌株。Usuda等在大肠杆菌中过表达metA基因，敲除metJ，thrBC基因并弱化metK基因使蛋氨酸产量达到0.24g/L。Schneider等通过基因改造大肠杆菌硫代硫酸钠盐的转硫酶的活性，并添加适当硫源的到蛋氨酸产量0.55g/L。
现今我国对蛋氨酸需求量很大，但国内蛋氨酸的生产能力有限，所需的蛋氨酸绝大部分依赖进口。因此通过基因改造得到高产菌株对蛋氨酸的生产对环境问题有很大的帮助，对蛋氨酸的工业化生产有极大的促进作用。
(三)发明内容
本发明目的本发明目的是高产L-甲硫氨酸的基因工程菌及其构建方法，以及其在微生物发酵制备L-甲硫氨酸中的应用。
本发明采用的技术方案是：
一种高产L-甲硫氨酸的基因工程菌，由如下方法构建：
(1)以E.coli W3110 M2/pAm(E.coli W3110 IJAHFEBC/pAm)(Jian-Feng Huanget al 2018Systematic Analysis of Bottlenecks in a Multibranched andMultilevel Regulated Pathway:The Molecular Fundamentals of L-MethionineBiosynthesis in Escherichia coli)为出发菌株，在质粒上过表达metF基因，得到工程菌E.coli W3110 M2/pAm metF；
(2)将工程菌E.coli W3110 M2/pAm metF基因组中fliY基因的启动子替换为trc启动子，得到工程菌E.coli W3110 M2(trc-fliY)/pAm metF；
(3)将工程菌E.coli W3110 M2(trc-fliY)/pAm metF基因组中malY基因的启动子替换为trc启动子，得到工程菌E.coli W3110 M2(trc-fliY malY)/pAm metF；
(4)将工程菌E.coli W3110 M2(trc-fliY malY)/pAm metF基因组中GCV基因的启动子替换为trc启动子，得到E.coli W3110 M2(trc-fliY malY GCV)/pAm metF；
(5)将工程菌E.coli W3110 M2(trc-fliY malY)基因组中glyA基因敲除，得到E.coli W3110 M2(trc-fliY malY GCV△glyA)，在质粒上过表达来自Arthrobactersp.FB24的GlyA基因然后转化到E.coli W3110 M2(trc-fliY malY GCV)中得到E.coliW3110 M2(trc-fliY malY GCV△glyA)/pAm glyA metF，即为所述高产L-甲硫酸的基因工程菌。
具体的，所述基因工程菌为大肠杆菌ZJBSSC362(Escherichia coli ZJBSSC362)，保存于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址：中国武汉武汉大学，邮编：430072，保藏日期：2020年12月4日，保藏编号：CCTCC NO：M 2020846。
本发明通过(1)强化大肠杆菌L-甲硫氨酸合成途径的一碳模块，增强大肠杆菌对亚甲基四氢叶酸的利用能力；(2)强化半胱氨酸/胱氨酸内运途径，解除大肠杆菌因半胱氨酸生成而产生的代谢抑制；(3)强化大肠杆菌L-甲硫氨酸合成途径的硫模块，增强大肠杆菌对半胱氨酸的利用能力；(4)引入外源的丝氨酸羟甲基转移酶，解除大肠本身丝氨酸羟甲基转移酶的限制。
本发明还涉及构建所述基因工程菌的方法，包括如下步骤：
(1)以菌株E.coli W3110 M2/pAm为底盘菌株，在质粒上过表达大肠杆菌的metF基因，将质粒转化到E.coli W3110 M2中得到工程菌E.coli W3110 M2/pAm metF；
(2)应用CRISPR-Cas9基因编辑技术将将工程菌E.coli W3110 M2/pAm metF基因组中fliY基因的启动子替换为trc启动子，得到工程菌E.coli W3110 M2(trc-fliY)/pAmmetF；
(3)应用CRISPR-Cas9基因编辑技术将工程菌E.coli W3110 M2(trc-fliY)/pAmmetF基因组中malY基因的启动子替换为trc启动子，得到工程菌E.coli W3110 M2(trc-fliY malY)/pAm metF；
(4)应用CRISPR-Cas9基因编辑技术将工程菌E.coli W3110 M2(trc-fliY malY)/pAm metF基因组中GCV基因的启动子替换为trc启动子，得到E.coli W3110M2(trc-fliYmalY GCV)/pAm metF；
(5)应用CRISPR-Cas9基因编辑技术将工程菌E.coli W3110 M2(trc-fliY malY)基因组中glyA基因敲除，得到E.coli W3110 M2(trc-fliY malY GCV△glyA)，在质粒上过表达来自Arthrobacter sp.FB24的glyA基因然后转化到E.coli W3110 M2(trc-fliY malYGCV)中得到E.coli W3110 M2(trc-fliY malY GCV△glyA)/pAm glyA metF，即为所述高产L-甲硫酸的基因工程菌。
具体的，所述trc启动子核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述Arthrobactersp.FB24的glyA基因核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明还涉及所述基因工程菌在微生物发酵制备L-甲硫氨酸中的应用。
所述应用为：将所述基因工程菌菌株接种至发酵培养基中进行发酵培养，发酵结束后取发酵液上清分离纯化得到所述L-甲硫氨酸。
所述发酵培养基组成如下：葡萄糖10g/L、(NH4)2SO4 16g/L、KH2PO4 1g/L、Na2S2O32g/L、酵母提取物2g/L，1ml/L微量元素溶液，溶剂为去离子水，pH值自然，接种时补加CaCO33g/L，VB12 20g/L，赖氨酸10μg/L；微量元素溶液组成为：500g/L MgSO4·7H20，5g/L FeSO4·7H2O，5g/L MnSO4·8H20，5g/L ZnSO4，溶剂为去离子水。
本发明有益效果主要体现在：本发明强化L-甲硫氨酸生物生成途径中metF的表达，加强蛋氨酸合成途径中的一碳模块的亚甲基四氢叶酸转化为甲基四氢叶酸能力；通过加强fliY的表达，加强了半胱氨酸的内运，降低因半胱氨酸生成而产生的代谢压力；通过加强malY、GCV，降低了蛋氨酸合成途径中的硫模块的反馈抑制和加强了一碳模块中甘氨酸的裂解；通过敲除大肠杆菌本身的glyA并引入外源的Arthrobacter sp.FB24的glyA，解除大肠本身丝氨酸羟甲基转移酶的限制，最后得到含有质粒的高产菌，L-甲硫氨酸产量从2.8g/L提高到3.83g/L。
(四)附图说明
图1为L-甲硫氨酸代谢途径图和改造位点；
图2为E.coli W3110 M2/pAm metF记为M2F的OD600和L-甲硫氨酸效价变化；
图3为E.coli W3110 M2(trc-fliY)/pAm metF记为FLF的OD600和L-甲硫氨酸效价变化；
图4为E.coli W3110 M2(trc-fliY malY)/pAm metF记为FMF的OD600和L-甲硫氨酸效价变化；
图5为E.coli W3110 M2(trc-fliY malY GCV)/pAm metF记为FMGF的OD600和L-甲硫氨酸效价变化；
图6为E.coli W3110 M2(trc-fliY malY△glyA)/pAm glyA metF记为M3GA的OD600和L-甲硫氨酸效价变化；
图7为pAm质粒质粒图谱。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例中，所述卡那霉素在培养基中终浓度为0.05mg/L，所述壮观霉素在培养基中终浓度为0.05mg/L。
本发明亲本E.coli菌株W3110 M2/pAm(E.coli W3110 IJAHFEBC/pAm)来自Jian-Feng Huang et al 2018Systematic Analysis of Bottlenecks in a Multibranchedand Multilevel Regulated Pathway:The Molecular Fundamentals of L-MethionineBiosynthesis in Escherichia coli。
菌株E.coli W3110来自耶鲁大学CGSC保藏中心(Coli Genetic Stock Center)，保藏日期1975年8月5日，保藏编号CGSC#4474，已在专利US 2009/0298135A1，US2010/0248311A1中公开。
表1：基因编辑涉及的基因及相应途径
Figure BDA0002894409540000051
Figure BDA0002894409540000061
表2:引物序列
Figure BDA0002894409540000062
Figure BDA0002894409540000071
Figure BDA0002894409540000081
实施例1：L-甲硫氨酸高产菌株的发酵方法以及含量的测定
发酵方法如下：
将构建的菌株接种到10mL含50mg/L的Kan的LB培养基中，8-12h后将所述基因工程菌菌株转接至20mL含有Kan的MS发酵培养基中，接种时补加CaCO3 0.3g/L，VB12母液20μl/mL，赖氨酸母液20μl/mL，28℃、180rpm条件下进行发酵培养培养至48h。
所述MS发酵培养基组成如下：葡萄糖20g/L、(NH4)2SO4 16g/L、KH2PO4 1g/L、Na2S2O32g/L、酵母提取物2g/L，1ml/L微量元素溶液，溶剂为去离子水，pH值自然；微量元素溶液组成为：500g/L MgSO4·7H20，5g/L FeSO4·7H2O，5g/L MnSO4·8H20，5g/L ZnSO4，溶剂为去离子水。
VB12母液组成为0.2g/L VB12，赖氨酸母液组成为10g/L的赖氨酸。
LB培养基：10g/L蛋白胨，5g/L酵母提取物，5g/L NaCl，溶剂为去离子水，pH值自然。
检测方法如下：
发酵结束后取1mL发酵液，12000rpm室温离心10min。沉淀用百分之三十的乙酸溶解去除多余CaCO3，测定OD600；将上清稀释100倍，用全自动氨基酸分析仪(SYKAM S-433D，德国)分析氨基酸分析仪效价。
实施例2：构建有效菌株E.coli W3110 M2/pAm metF及其摇瓶发酵
(1)构建pAm metF质粒：以之前构建的pAm质粒(质粒图谱见图7)为模板，以pAm-line-F/pAm-line-R为引物获得PCR线性扩增产物pAm-line质粒，PCR产物经过DpnI在37℃保温消化3h后用Clean up试剂盒回收DNA片段；再以E.coli W3110的基因组为模板，以pmetF-F/pmetF-R为引物获得PCR扩增产物metF，Clean up试剂盒回收DNA片段；按照ClonExpress(One step clone kit，Vazyme Biotech，Nanjing，China)说明书将线性化pAm-line质粒、片段metF连接在一起，将连接产物通过化学转化法转化到DH5α感受态中；最后挑选克隆子，通过测序验证得到pAm metF质粒。
(2)制备E coli W3110 M2化学转化感受态，详细过程见(Molecular Cloning:ALaboratory Manual，3ed Edition，99-102)的描述。
(3)将构建好的pAm metF质粒，通过化学转化法转化到E coli W3110 M2化学转化感受态中得到E.coli W3110 M2/pAm metF。
(4)将构建的生产菌株E.coli W3110 M2/pAm metF以E.coli W3110 M2/pAm为对照组，按照实施例1方法进行药瓶测试和检测。OD600及发酵液上清中的L-甲硫氨酸含量如图2所示，图中M2F即菌株E.coli W3110 M2/pAm metF，M2即菌株E.coli W3110 M2/pAm。
由图2可见，在质粒上过表达metF，L-甲硫氨酸产量从2.8g/L增加到3.1g/L，这说明过表达metF有利于大肠杆菌L-甲硫氨酸的合成。
实施例3：构建有效菌株E.coli W3110 M2(Trc-fliy)/pAm metF及其摇瓶发酵
以Escherichia coli W3110 M2/pAm metF为出发菌株，使用CRISPR-Cas9介导的基因编辑技术(Yu Jiang et al.2015Multigene Editing in the Escherichia coliGenome via the CRISPR-Cas9 System.Applied Environmental Microbiology.81:2506-2514)，用来源于pTrc99A的trc启动子(核苷酸序列如SEQ ID No.1所示)，在基因组替换fliY的原有启动子，以增强fliY的表达强度。
(1)构建pTarget-fliY质粒：以pTarget F质粒(Addgene Plasmid#62226)为模版，以pT-fliY-F/pT-fliY-R为引物PCR扩增，PCR产物经过Dpn I在37℃保温消化3h，再转化到E.coli DH5α，壮观酶素平板筛选，测序验证获得正确的pTarget-fliY质粒，用于后续连接DonorDNA。
(2)构建pTD-fliY含Donor质粒：以E.coli W3110基因组为模版，pTD-fliY-up-F与pTD-fliY-up-R为引物扩增获得上游部分donor DNA(F1)，以pTD-fliY-down-F和pTD-fliY-down-R为引物扩增获得下游部分donor DNA(F2)，胶回收纯化PCR片段得到F1和F2；以pTfliY质粒为模板，以pTD-line-F/pTD-line-R为引物扩增质粒线性化片段，PCR产物经过DpnI在37℃保温消化3h，Clean up试剂盒回收DNA片段；按照(One step clonekit，VazymeBiotech，Nanjing，China)说明书将线性化pTarget-fliY质粒、片段F1和F2连接在一起，通过测序验证得到pTD-fliY质粒。
(3)将pCas质粒(Addgene Plasmid#62225)导入Escherichia coli W3110 M2/pAmmetF中，挑选单克隆到含0.05mg/L卡那霉素的LB试管中，30℃过夜培养；再以体积浓度1％的接种量接种到含50mL LB培养基的250mL摇瓶中，并加入500μl 1mol/L的L-阿拉伯糖，150rpm、30℃培养至OD600 0.4～0.6；4000rpm，4℃离心10min收集细胞，制备电转化感受态，详细过程见(Molecular Cloning:A Laboratory Manual，3ed Edition，99-102)的描述。
(4)取150ng pTD-fliY质粒与100μl电转感受态细胞混合，转入预冷的2mm电击杯中，冰浴1min左右，用电穿孔仪(MicroPluserTM，BIO-RAD)进行电击转化，电击完成后立即加入1mL LB培养基并立即轻柔吸出，转移到1.5mL离心管中，30℃复苏2～3h后涂布含0.05mg/L卡那霉素和0.05mg/L壮观霉素的LB平板，30℃倒置培养18-20h，以pfliY-VF和Trc-down为引物进行菌落PCR验证，若能成功克隆出一段600bp左右的片段，则证明是E.coli W3110 M2(Trc-fliY)阳性菌落。
(5)pTarget和pCas质粒消除：挑取阳性单菌落接种到含1mM IPTG和0.05mg/L卡那霉素的LB试管，30℃培养过夜，次日菌液划线于含0.05mg/L卡那霉素的LB平板，30℃培养24h，挑取单菌落划线于含0.05mg/L壮观霉素的LB平板，不能在含0.05mg/L壮观霉素的LB平板的单菌落其pTarget-fliY质粒成功消除，挑取pTarget-fliY质粒成功消除的单菌落于LB试管，42℃培养过夜，次日菌液划线于LB平板，42℃培养12h，挑取单菌落划线于含0.05mg/L卡那霉素的LB平板，不能在含0.05mg/L卡那霉素的LB平板的单菌落其pCas质粒成功消除，最终得到无质粒E.coli W3110 M2(trc-fliY)。
(6)将pAm metF质粒导入E.coli W3110 M2(trc-fliY)感受态中，得到E.coliW3110 M2(trc-fliY)/pAm metF，E.coli W3110 M2(trc-fliY)感受态制备方法同实施例2(2)。
(7)将E.coli W3110 M2(trc-fliY)/pAm metF，以E.coli W3110 M2/pAm metF为对照组，根据实施例1进行检测，OD600及发酵液上清中的L-甲硫氨酸含量如图3所示，图中M2F即菌株E.coli W3110 M2/pAm metF，FLF即E.coli W3110 M2(trc-fliY)/pAm metF。
由图3可见，基因组替换fliY基因启动子，L-甲硫氨酸产量从3.1g/L增加到3.52g/L，这说明fliY表达的增强可有效增加前体物质半胱氨酸的内运，从而有利于大肠杆菌L-甲硫氨酸的合成。
实施例4：构建有效菌株E.coli W3110 M2(trc-fliY malY)/pAm metF及其摇瓶发酵
(1)构建pTarget-malY质粒：以pTarget F质粒(Addgene Plasmid#62226)为模版，以pT-malY-F/pT-malY-R为引物PCR扩增，PCR产物经过Dpn I在37℃保温消化3h，再转化到E.coli DH5α，壮观酶素平板筛选，测序验证获得正确的pTarget-malY质粒，用于后续连接DonorDNA。
(2)构建pTD-malY质粒：以E.coli W3110基因组为模版，pTD-malY-up-F、pTD-malY-up-R、pTD-malY-down-F和pTD-malY-down-R为引物，构建步骤同实施例2。
(3)将pCas质粒(Addgene Plasmid#62225)导入实施例3获得的E.coli W3110 M2(trc-fliY)感受态中，得到E.coli W3110 M2(Trc-fliY malY)。
(4)构建得到E.coli W3110 M2(Trc-fliY malY)阳性菌落，构建方法同实施例3(4)。
(5)质粒消除：实施方法同实施例2(5)，获得无质粒E.coli W3110 M2(trc-fliYmalY)。
(6)将pAm metF质粒导入E.coli W3110 M2(trc-fliY malY)感受态中，得到E.coli W3110 M2(trc-fliY malY)/pAm metF，E.coli W3110 M2(trc-fliY malY)感受态制备方法同实施例2(2)。
(7)将E.coli W3110 M2(trc-fliY malY)/pAm metF，以E.coli W3110 M2(trc-fliY)/pAm metF为对照组，根据实施例1进行检测，OD600及发酵液上清中的L-甲硫氨酸含量如图4所示，图中MFM即E.coli W3110 M2(trc-fliY malY)/pAm metF。
由图4可见，基因组替换malY基因启动子，L-甲硫氨酸产量从3..52g/L增加到3.63g/L，这说明malY表达的增强可有效增加前体物质L-高半胱氨酸的合成，从而有利于大肠杆菌L-甲硫氨酸的合成。
实施例5：构建有效菌株E.coli W3110 M2(trc-fliY malY GCV)/pAm metF及其摇瓶发酵
(1)构建pTarget-GCV质粒：以pTarget F质粒(Addgene Plasmid#62226)为模版，以pT-GCV-F/pT-GCV-R为引物PCR扩增，PCR产物经过DpnI在37℃保温消化3h，再转化到E.coli DH5α，壮观酶素平板筛选，测序验证获得正确的pTarget-GCV质粒，用于后续连接DonorDNA。
(2)构建pTD-GCV质粒：以E.coli W3110基因组为模版，pTD-GCV-up-F、pTD-GCV-up-R、pTD-GCV-down-F和pTD-GCV-down-R为引物，构建步骤同实施例2。
(3)将pCas质粒(Addgene Plasmid#62225)导入实施例4获得的E.coli W3110 M2(trc-fliY malY)感受态中。
(4)构建得到E.coli W3110 M2(trc-fliY malY GCV)阳性菌落，构建方法同实施例3(4)。
(5)质粒消除：实施方法同实施例2(5)，获得无质粒E.coli W3110 M2(trc-fliYmalY GCV)。
(6)将pAm metF导入E.coli W3110 M2(trc-fliY malY GCV)感受态中，E.coliW3110 M2(trc-fliY malY GCV)感受态制备方法同实施例2(2)。
(7)将E.coli W3110 M2(trc-fliY malY GCV)/pAm metF，以E.coli W3110 M2(trc-fliY malY)/pAm metF为对照组，根据实施例1进行检测，OD600及发酵液上清中的L-甲硫氨酸含量如图5所示，图中FMGF即E.coli W3110 M2(trc-fliY malY GCV)/pAm metF。
由图5可见，基因组替换GCV基因启动子，L-甲硫氨酸产量从3.63g/L增加到3.70g/L，这说明GCV表达的增强可有效加强甘氨酸裂解，从而有利于大肠杆菌L-甲硫氨酸的合成。
实施例6：构建有效菌株E.coli W3110 M2(trc-fliY malY GCV△glyA)
(1)构建pTarget-△glyA质粒：以pTarget F质粒(Addgene Plasmid#62226)为模版，以pT-△glyA -F/pT-△glyA -R为引物PCR扩增，PCR产物经过DpnI在37℃保温消化3h，再转化到E.coli DH5α，壮观酶素平板筛选，测序验证获得正确的pTarget-△glyA质粒，用于后续连接DonorDNA。
(2)构建pTD-GCV质粒：以E.coli W3110基因组为模版，pTD-△glyA-up-F、pTD-△glyA -up-R、pTD-△glyA -down-F和pTD-△glyA-down-R为引物，构建步骤同实施例2。
(3)将pCas质粒(Addgene Plasmid#62225)导入实施例5获得的E.coli W3110 M2(trc-fliY malY GCV)感受态中。
(4)构建得到E.coli W3110 M2(trc-fliY malY GCV△glyA)阳性菌落，构建方法同实施例3(4)。
(5)质粒消除：实施方法同实施例2(5)，获得无质粒E.coli W3110 M2(Trc-fliYmalY GCV△glyA)。
实施例7：构建有效菌株E.coli W3110 M2(trc-fliY malY GCV△glyA)/pAm GlyAmetF及其摇瓶发酵。
(1)构建pAm GlyA metF质粒：在以之前构建的pAm metF质粒为模板，以pAm metF-line-F/pAm metF-line-R为引物获得PCR线性扩增产物pAm metF-line质粒，PCR产物经过DpnI在37℃保温消化3h后用Clean up试剂盒回收DNA片段；在以GlyA的质粒为模板，以pglyA-F/p glyA -R为引物获得PCR扩增产物GlyA，Clean up试剂盒回收DNA片段；按照ClonExpress(One step clone kit，Vazyme Biotech，Nanjing，China)说明书将线性化pAmmetF-line质粒、片段GlyA连接在一起，将连接产物通过化学转化法转化到DH5α感受态中；最后挑选克隆子，通过测序验证得到pAm metF GlyA质粒。
(2)制备E.coli W3110 M2(trc-fliY malY GCV△glyA)化学转化感受态，详细过程见(Molecular Cloning:A Laboratory Manual，3ed Edition，99-102)的描述。
(3)将构建好的pAm metF GlyA质粒，通过化学转化法转化到E.coli W3110 M2(trc-fliY malY GCV△glyA)感受态中，获得E.coli W3110 M2(trc-fliY malY GCV△glyA)/pAm GlyA metF。
(4)将构建的生产菌株E.coli W3110 M2(trc-fliY malY GCV△glyA)/pAm GlyAmetF以E.coli W3110 M2(trc-fliY malY GCV)/pAm metF为对照组，按照实施例1方法进行药瓶测试和检测。OD600及发酵液上清中的L-甲硫氨酸含量如图6所示，图中M3GA即E.coliW3110 M2(trc-fliY malY GCV△glyA)/pAm GlyA metF(即CCTCC NO：M 2020846)。
由图6可见，在质粒上过表达Arthrobacter sp.FB24的GlyA基因，L-半胱氨酸产量从3.70g/L增加到3.83g/L，这说明质粒上异源表达Arthrobacter sp.FB24的GlyA基因，有利于大肠杆菌L-半胱氨酸的合成。
序列表
<110> 浙江工业大学
<120> 高产L-甲硫氨酸的基因工程菌及其构建与应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 66
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 1
ttgacaatta atcatccggc tcgtataatg tgtagaccac aacggttttc acacaggaaa 60
cagacc 66
<210> 2
<211> 1385
<212> DNA
<213> 未知(Arthrobacter sp.)
<400> 2
atgaccacca gcccgaccag cgttagcacc agcagcaccg ttagcaacct gccgctgacc 60
gaactggatc cggaaattgc cgccgttctg gatcaggaac tgggtcgcca gcgtggtacc 120
ctggaaatga tcgcatcaga aaactttgca ccgcgcgcag taatggaagc acagggcagc 180
gttctgacca ataaatatgc agaaggttat cctggtcgtc gttattatgg tggttgtgaa 240
tatgttgata tcgccgaaca gctggcaatt gatcgtgtga aagatctgtt tggtgcagaa 300
tatgcaaatg ttcagccgca tagtggcgct caggcaaatg ccgcagcact gagtgcaatg 360
attaccccgg gtgataaaat tctgggtctg agcctggcac atggtggtca tctgacccat 420
ggtatgaaac tgaattttag cggtaaactg tatcaggttg cagcatatca ggtagaacag 480
gataattttc gtgttgatat ggataaactg cgtgaacagg cgattgcaga aaaaccgcag 540
gttattattg ccggttggag tgcatatccg cgtcatctgg attttgcagc atttcgtagc 600
attgctgatg aagttggtgc actgctgtgg acggatatgg cacattttgc aggtctggtt 660
gccgccggtc tgcatccgtc accggttcct cattctgatg ttgttaccag taccgttcat 720
aaaacactgg ccggtccgcg ttctggtgtt attctggcaa aacaggaatg ggcaaaaaaa 780
ctgaatagca atgtttttcc gggtcagcag ggtggtccgc tgatgcatgt tattgcagca 840
aaagcagttg catttaaaat tgcaggtacc gcagaattta aagaacgtca ggaacgtgtt 900
ctggaaggtg caaaaattat tgcagatcgt ctgaatcagg cagatgttgc agaagcaggt 960
gttagcgttc tgaccggtgg taccgatgtt catctggttc tggttgatct gcgtaatagc 1020
cagctggatg gtcagcaggc agaagatctg ctgcatagcg ttggtattac cgttaatcgt 1080
aatgcagttc cgtttgatcc gcgtccgccg atggttacca gcggtctgcg tattggtacc 1140
ccggcactgg caacccgtgg ttttggtgca gaagaattta ccgaagttgc agaaattatt 1200
gcaaccgcac tgaaagcagg tagcgcaacc gatgttgaag cactgcaggc acgtgttgat 1260
aaactggcag cagattttcc gctgtatccg cagcatgaac agtggtaaca aaatttccgg 1320
tttatggtgc ataagaccga tgcatttctg ctgtattaac aaaatttccg gtttatggtg 1380
cataa 1385

Claims (6)

1.一种高产L-甲硫氨酸的基因工程菌，由如下方法构建：
(1)以E. coli W3110 M2/pAm为出发菌株，在质粒上过表达metF基因，得到工程菌E.coli W3110 M2/pAm metF；
(2)将工程菌E. coli W3110 M2/pAm metF基因组中fliY基因的启动子替换为trc启动子，得到工程菌E. coli W3110 M2（trc-fliY）/pAm metF；
(3)将工程菌E. coli W3110 M2（trc-fliY）/pAm metF基因组中malY基因的启动子替换为trc启动子，得到工程菌E. coli W3110 M2（trc-fliY malY）/pAm metF；
(4)将工程菌E. coli W3110 M2（trc-fliY malY）/pAm metF基因组中GCVT基因的启动子替换为trc启动子，得到E. coli W3110 M2 （trc-fliY malY GCVT）/pAm metF；
(5)将工程菌E. coli W3110 M2（trc-fliY malY）基因组中glyA基因敲除，得到E.coli W3110 M2（trc-fliY malY GCVT △glyA），在质粒上过表达来自Arthrobacter sp.FB24的GlyA基因然后转化到E. coli W3110 M2（trc-fliY malY GCVT）中得到E. coliW3110 M2 （trc-fliY malY GCVT△glyA）/pAm GlyA metF，即为所述高产L-甲硫酸的基因工程菌；
其中，所述trc启动子核苷酸序列如SEQ ID NO .1所示；所述Arthrobacter sp. FB24的glyA基因核苷酸序列如SEQ ID NO .2所示。
2.如权利要求1所述的工程菌，其特征在于所述基因工程菌为大肠杆菌ZJBSSC362（Escherichia coli ZJBSSC362），保存于中国典型培养物保藏中心（CCTCC），地址：中国武汉武汉大学，邮编：430072，保藏日期：2020年12月4日，保藏编号：CCTCC NO：M 2020846。
3.构建权利要求1所述基因工程菌的方法，包括如下步骤：
(1) 以菌株E. coli W3110 M2/pAm为底盘菌株，在质粒上过表达大肠杆菌的metF基因，将质粒转化到E. coli W3110 M2中得到工程菌E. coli W3110 M2/pAm metF；
(2) 应用CRISPR-Cas9基因编辑技术将工程菌E. coli W3110 M2/pAm metF基因组中fliY基因的启动子替换为trc启动子，得到工程菌E. coli W3110 M2（trc-fliY）/pAmmetF；
(3) 应用CRISPR-Cas9基因编辑技术将工程菌E. coli W3110 M2（trc-fliY）/pAmmetF基因组中malY基因的启动子替换为trc启动子，得到工程菌E. coli W3110 M2（trc-fliY malY）/pAm metF；
(4) 应用CRISPR-Cas9基因编辑技术将工程菌E. coli W3110 M2（trc-fliY malY）/pAm metF基因组中GCVT基因的启动子替换为trc启动子，得到E. coli W3110 M2（trc-fliYmalY GCVT）/pAm metF；
(5) 应用CRISPR-Cas9基因编辑技术将工程菌E. coli W3110 M2（trc-fliY malY）基因组中glyA基因敲除，得到E. coli W3110 M2（trc-fliY malY GCVT △glyA），在质粒上过表达来自Arthrobacter sp. FB24的GlyA基因然后转化到E. coli W3110 M2（trc-fliYmalY GCVT）中得到E. coli W3110 M2（trc-fliY malY GCVT △glyA）/pAm GlyA metF，即为所述高产L-甲硫酸的基因工程菌；
其中，所述trc启动子核苷酸序列如SEQ ID NO .1所示；所述Arthrobacter sp. FB24的glyA基因核苷酸序列如SEQ ID NO .2所示。
4.权利要求1所述基因工程菌在微生物发酵制备L-甲硫氨酸中的应用。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于所述应用为：将所述基因工程菌菌株接种至发酵培养基中进行发酵培养，发酵结束后取发酵液上清分离纯化得到所述L-甲硫氨酸。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于所述发酵培养基组成如下：葡萄糖 10g/L、（NH4）2SO4 16g/L、KH2PO4 1g/L、Na2S2O3 2g/L、酵母提取物 2g/L，1ml/L微量元素溶液，溶剂为去离子水，pH值自然，接种时补加CaCO30.3μg/L，VB12 0.2μg/L，赖氨酸10μg/L；微量元素溶液组成为：500g/L MgSO4·7H2O，5g/L FeSO4·7H2O，5g/L MnSO4·8H2O, 5g/L ZnSO4，溶剂为去离子水。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114606253B (zh) * 2022-03-14 2024-03-26 浙江工业大学 一种无外源氨基酸作用下高产l-甲硫氨酸的重组大肠杆菌及其应用

Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101356272A (zh) * 2005-08-18 2009-01-28 巴斯夫欧洲公司 甲硫氨酸合成效率增高的微生物
WO2012090021A1 (en) * 2010-12-30 2012-07-05 Metabolic Explorer Recombinant microorganism for the fermentative production of methionine
JP2012196222A (ja) * 2012-06-11 2012-10-18 Metabolic Explorer 硫酸透過酵素の発現が増強された微生物を用いてメチオニンおよびその前駆体ホモセリンまたはスクシニルホモセリンを製造するための方法
CN103849639A (zh) * 2014-03-27 2014-06-11 中国药科大学 一种提高半胱氨酸利用率生物合成谷胱甘肽的方法
CN106906176A (zh) * 2010-10-25 2017-06-30 代谢探索者公司 提高nadph可用性用于甲硫氨酸产生
CN109055289A (zh) * 2018-07-27 2018-12-21 浙江工业大学 一种高产l-甲硫氨酸的重组大肠杆菌及其应用
CN109207534A (zh) * 2018-08-29 2019-01-15 浙江工业大学 一种提高l-蛋氨酸产量的方法
CN109355326A (zh) * 2018-11-21 2019-02-19 浙江工业大学 一种提高l-蛋氨酸产量的方法

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100651220B1 (ko) * 2004-06-29 2006-11-29 씨제이 주식회사 Ｌ-메씨오닌 생산 균주 및 상기 균주를 이용한ｌ-메씨오닌의 생산방법
WO2009043372A1 (en) * 2007-10-02 2009-04-09 Metabolic Explorer Increasing methionine yield
KR101915819B1 (ko) * 2009-12-30 2018-11-06 에보니크 데구사 게엠베하 메티오닌 생산을 위한 균주 및 방법

Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101356272A (zh) * 2005-08-18 2009-01-28 巴斯夫欧洲公司 甲硫氨酸合成效率增高的微生物
CN106906176A (zh) * 2010-10-25 2017-06-30 代谢探索者公司 提高nadph可用性用于甲硫氨酸产生
WO2012090021A1 (en) * 2010-12-30 2012-07-05 Metabolic Explorer Recombinant microorganism for the fermentative production of methionine
JP2012196222A (ja) * 2012-06-11 2012-10-18 Metabolic Explorer 硫酸透過酵素の発現が増強された微生物を用いてメチオニンおよびその前駆体ホモセリンまたはスクシニルホモセリンを製造するための方法
CN103849639A (zh) * 2014-03-27 2014-06-11 中国药科大学 一种提高半胱氨酸利用率生物合成谷胱甘肽的方法
CN109055289A (zh) * 2018-07-27 2018-12-21 浙江工业大学 一种高产l-甲硫氨酸的重组大肠杆菌及其应用
CN109207534A (zh) * 2018-08-29 2019-01-15 浙江工业大学 一种提高l-蛋氨酸产量的方法
CN109355326A (zh) * 2018-11-21 2019-02-19 浙江工业大学 一种提高l-蛋氨酸产量的方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
gscherichia coli cis. and trans-acting mutations that increase;Eva Lorenz;《Mol Gen Genet》;19961231;第250卷;第81-88页 *

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