CN109355326A - 一种提高l-蛋氨酸产量的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种提高L‑蛋氨酸产量的方法，属于发酵技术领域。所述方法包括：以重组大肠杆菌E.coli W3110ΔIJAHFEBC/pAm为生产菌株，将其接种于发酵培养基中，培养至OD600＝0.6‑1.0时，添加诱导剂IPTG，继续培养至发酵结束，获得含有L‑蛋氨酸的发酵液，将发酵液分离纯化得到L‑蛋氨酸；所述发酵培养基包括基础培养基和辅因子，所述辅因子包括VB12。本发明通过在发酵培养过程中，优化培养基的碳源浓度、添加前体氨基酸和辅因子以及发酵条件，提高了L‑蛋氨酸的发酵产量，并且多种辅因子同时加入可以显著提高L‑蛋氨酸的发酵产量。

Description

一种提高L-蛋氨酸产量的方法
技术领域
本发明涉及发酵技术领域，具体涉及利用重组大肠杆菌发酵提高L-蛋氨酸产量的方法。
背景技术
蛋氨酸(methionine)是一种重要的含硫氨基酸，是人体内必须氨基酸之一。分子式为C5H11NO2S，相对分子质量为149.21，性状为白色薄片状结晶或结晶型粉末，有特殊气味，味微甜，溶于水(3.3g/100mL，25℃)、稀酸或稀碱。蛋氨酸对于人体的机能平衡有很重要的作用，缺乏蛋氨酸会导致很多疾病，如：肝脏病变，影响怀孕以及帕金森病。蛋氨酸用途广泛，目前被广泛的应用于医药、食品、饲料等各个领域中。在家禽的玉米-豆粕型饲粮中适当添加，能有效改善家禽的免疫状况、生长性能、血液生化指标状况及繁殖性能。
目前蛋氨酸的生产方法主要为化学法，合成的是D型和L型混合蛋氨酸，故其应用受到限制。蛋氨酸的化学生产过程还涉及丙烯醛、甲硫醇、氨、氰化物等危险化学品，且容易造成环境污染，因此也限制了蛋氨酸的大规模化学生产。
研究人员正积极探索采用发酵法合成蛋氨酸。诱变是常用的提高菌株合成蛋氨酸能力的方法，Kase等通过在培养基中添加硒代蛋氨酸来筛选谷氨酸棒杆菌的乙硫氨酸抗性突变菌株，蛋氨酸产量为0.25g/L。Chattopadhyay等用亚硝基胍诱变大肠杆菌，筛选出抗苏氨酸和蛋氨酸的突变型菌株，蛋氨酸产量为2g/L。Nakamori等使用TN1对大肠杆菌诱变处理，使metJ基因发生突变，得到的蛋氨酸产量为0.91g/L。
在对大肠杆菌蛋氨酸合成的代谢调控机理研究的基础上，Usuda等在大肠杆菌中过表达metA基因，敲除metJ、thrBC基因并弱化metK基因使蛋氨酸产量达到0.24g/L。Schneider等通过基因改造增加大肠杆菌硫代硫酸盐的转硫酶活性，并添加适当的硫源得到蛋氨酸产量0.55g/L。
目前，研究使用的L-蛋氨酸生产菌株主要是传统诱变菌株和基因工程改造菌株。印度学者Chattopadhyay等首先筛选到一株E.coli K12抗5BU的突变菌，该菌能以葡萄糖为底物，合成1g/L的L-蛋氨酸。随后他们又通过对该菌株进行NTG连续诱变，得到一株能抗苏氨酸结构类似物和L-蛋氨酸结构类似物突变菌，该菌能以葡萄糖为底物，过量合成L-蛋氨酸和苏氨酸(均为2g/L)。日本学者Nakamori等用NTG处理E.coli JM109，得到数株能够抗乙硫氨酸的突变株，其中E.coli JM109-TNI在添加1％酵母粉的培养基上，以葡萄糖为底物合成0.91g/L的L-蛋氨酸。闵伟红等重点考察了发酵过程中的碳源种类及浓度、pH及发酵时间等因素对北京棒杆菌AS1.299的影响，结果表明以葡萄糖浓度为10％作为碳源进行发酵产L-蛋氨酸量为最高，菌体浓度为最大，pH6.5有利于菌体生长和L-蛋氨酸生成。
现今对于蛋氨酸的需求量较大，但是国内蛋氨酸的发酵制备水平仍然处于较低水平，因此除基因改造外，利用发酵优化来提高蛋氨酸的产量，对于蛋氨酸的生产方面有着极大的促进作用，在国内工业化生产蛋氨酸起着极其重要的作用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种提高L-蛋氨酸产量的方法，通过对发酵培养基的优化选择，提高重组大肠杆菌发酵合成L-蛋氨酸的产量。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种提高L-蛋氨酸产量的方法，包括：以重组大肠杆菌E.coli W3110ΔIJAHFEBC/pAm为生产菌株，将其接种于发酵培养基中，培养至OD600＝0.6-1.0时，添加诱导剂IPTG，继续培养至发酵结束，获得含有L-蛋氨酸的发酵液，将发酵液分离纯化得到L-蛋氨酸；
所述发酵培养基包括基础培养基和辅因子，以终浓度计，所述基础培养基组成包括：葡萄糖20-40g/L、(NH4)2SO4 12-18g/L、KH2PO4 0.5-2.5g/L、酵母提取物1-4g/L、Na2S2O31-4g/L、赖氨酸1-15mg/L、金属离子混合溶液1mL/L，溶剂为蒸馏水；所述辅因子包括：VB120.2-2mg/L；pH值为5.5-7.0。
所述重组大肠杆菌E.coli W3110ΔIJAHFEBC/pAm由E.coli W3110ΔmetJΔmetIΔlysA/pTrc99A/metA*/yjeH(公布号为CN 105886449 A的专利文献中公开)改造得到，2018年10月发表于ACS Synthetic Biology(Jian-Feng Huang,et al.SystematicAnalysis of Bottlenecks in a Multibranched and Multilevel Regulated Pathway:The Molecular Fundamentals of L-Methionine Biosynthesis in Escherichiacoli..DOI:10.1021/acssynbio.8b00249)。
碳源作为菌体生长必需，其浓度对生物量及L-蛋氨酸产量影响较大，作为优选，所述葡萄糖的终浓度为30g/L。
本发明研究表明，利用重组大肠杆菌E.coli W3110ΔIJAHFEBC/pAm在L-蛋氨酸发酵培养时，添加辅因子可以显著提高L-蛋氨酸的发酵产量，所述辅因子为VB1、VB3、VB6、VB7、VB12、甘氨酸(Gly)或柠檬酸钠(Cit-Na)中的多种，其中VB12不可或缺，在此基础上选择1-2种，优选为VB1、VB6。
作为优选，所述的辅因子还包括VB1 2-15mg/L。
作为优选，在添加辅因子VB12和VB1的基础上，还包括VB6 0.04-4.0mg/L。
更为优选，以终浓度计，所述发酵培养基组成为：葡萄糖30g/L、(NH4)2SO4 14g/L、KH2PO4 1g/L、酵母提取物2g/L、Na2S2O3 2g/L、赖氨酸10mg/L、金属离子混合溶液1mL/L、VB122mg/L、VB1 10mg/L、VB6 0.4mg/L，溶剂为蒸馏水；所述金属离子混合溶液组成为：MgSO4·7H2O 500g/L，MnSO4·8H2O 5g/L，FeSO4·7H2O 5g/L，ZnSO4 5g/L，溶剂为蒸馏水。
作为优选，在添加辅因子VB12和VB1的基础上，所述的发酵培养基还包括终浓度为2.0-20.0mg/L的甘氨酸。
更为优选，以终浓度计，所述发酵培养基组成为：葡萄糖30g/L、(NH4)2SO4 14g/L、KH2PO4 1g/L、酵母提取物2g/L、Na2S2O3 2g/L、金属离子混合溶液1mL/L、VB12 2mg/L、VB110mg/L、甘氨酸10mg/L，溶剂为蒸馏水；所述金属离子混合溶液组成为：MgSO4·7H2O 500g/L，MnSO4·8H2O 5g/L，FeSO4·7H2O 5g/L，ZnSO4 5g/L，溶剂为蒸馏水。
作为优选，所述发酵培养基的pH为6.4-6.8。
作为优选，所述发酵培养基中包括终浓度为10g/L的CaCO3，发酵过程中，添加氨水分段控制pH：第0-12小时，pH6.4；第12-48小时，pH6.8。
发酵培养基中添加终浓度为10g/L的CaCO3，调节pH在5.5-7.0，在此基础上，利用40％的氨水精确调节pH，并分段控制。
作为优选，重组大肠杆菌E.coli W3110ΔIJAHFEBC/pAm接种至含有抗生素Kan的发酵培养基中，37℃、180r/min下培养至OD600＝0.6-1.0，添加终浓度为0.1mM的IPTG，再于28℃、180r/min下培养48h至发酵结束。
发酵前先进行种子扩大培养，再将种子液以体积浓度10％的接种量接种至发酵培养基，所述种子扩大培养为：将重组大肠杆菌E.coli W3110ΔIJAHFEBC/pAm接种至含50mg/L kan种子培养基，在37℃、180r/min培养12h，获得种子液；所述种子培养基组成如下：蛋白胨10g/L，NaCl10g/L，酵母提取物5g/L，溶剂为蒸馏水，pH自然。
本发明具备的有益效果：
本发明利用重组大肠杆菌E.coli W3110ΔIJAHFEBC/pAm，通过在发酵培养过程中，优化碳源浓度、添加前体氨基酸和辅因子，提高了L-蛋氨酸的发酵产量，并且多种辅因子同时加入可以显著提高L-蛋氨酸的发酵产量。
附图说明
图1为原始发酵培养基中添加VB12及其浓度对L-蛋氨酸产量的影响。
图2为在原始发酵培养基中添加VB12的基础上再添加VB1及其浓度对L-蛋氨酸产量的影响。
图3为在原始发酵培养基中同时添加VB1，VB12的基础上再添加VB6对L-蛋氨酸产量的影响。
图4为在原始发酵培养基中同时添加VB1，VB12的基础上再添加甘氨酸及其浓度对L-蛋氨酸产量的影响。
图5为在原始发酵培养基中同时添加VB1，VB12时葡萄糖浓度对L-蛋氨酸产量的影响。
图6为葡萄糖浓度对OD和pH的影响。
图7为pH对于L-蛋氨酸产量的影响。
图8为分段调控pH对于L-蛋氨酸产量的影响。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此。
实施例中采用的重组大肠杆菌E.coli W3110ΔIJAHFEBC/pAm为课题组前期研究构建获得，发表于ACS Synthetic Biology(Jian-Feng Huang,Zhen-Yang Shen,Qiao-LiMao,Xiao-Ming Zhang,Bo Zhang,Jia-Shu Wu,Zhi-Qiang Liu,and Yu-GuoZheng.Systematic Analysis of Bottlenecks in a Multibranched and MultilevelRegulated Pathway:The Molecular Fundamentals of L-Methionine Biosynthesis inEscherichia coli.DOI:10.1021/acssynbio.8b00249)。
具体地：将丝氨酸到半胱氨酸途径中编码丝氨酸乙酰转移酶的基因cysE(GeneID:948126)、编码高半胱氨酸-N5-甲基四氢叶酸转甲基酶基因metH(Gene ID:948522)、编码5-亚甲基叶酸还原酶基因metF(Gene ID:948432)、编码高胱氨酸合成基因metBL(GeneID:948433,948434)启动子均替换为trc启动子后，导入宿主菌构建而成；所述宿主菌是将大肠杆菌E.coli W3110中metJ、metI和lysA基因敲除(即赖氨酸合成支路、蛋氨酸摄取系统和合成蛋氨酸的全局阻遏蛋白)后导入pTrc99A/metA*/yjeH质粒构建而成的E.coli W3110ΔmetJΔmetIΔlysA/pTrc99A/metA*/yjeH，其中pTrc99A/metA*/yjeH质粒添加了蛋氨酸外分泌蛋白yieH，过表达了编码催化高丝氨酸和琥珀酰-CoA合成琥珀酰高丝氨酸的高丝氨酸O-琥珀酰转移酶metA以及过表达了serA、serB、serC，并对serA,serB进行脱敏处理构建获得。
实施例1
重组大肠杆菌E.coli W3110ΔIJAHFEBC/pAm的培养
(1)扩大培养：
从含kan抗性的LB平板培养基上挑取一个重组E.coli W3110单菌落接入至含50mg/L kan种子培养基，于摇床转速180r/min，37℃下培养12h，获得种子液；所述种子培养基组成如下：蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L，酵母提取物5g/L，溶剂为水，pH自然，115℃灭菌30min；
(2)发酵培养：
将培养12h的种子液以体积浓度10％的接种量接入含10g/L CaCO3和50mg/L kan的原始发酵培养基中，28℃，摇床转速180r/min条件下培养发酵到OD600＝0.6～1.0时，添加终浓度为0.1mM的IPTG，继续培养至48h后发酵结束。发酵培养基中添加的10g/L CaCO3控制pH5.5-7。
原始发酵培养基的组成如下：葡萄糖20g/L，(NH4)2SO4 14g/L，KH2PO4 1g/L，酵母提取物2g/L，Na2S2O3 1g/L，赖氨酸10mg/L，10g/L CaCO3，金属离子混合溶液1mL/L，溶剂为蒸馏水，pH自然；所述金属离子混合溶液组成为：MgSO4·7H2O 500g/L，MnSO4·8H2O 5g/L，FeSO4·7H2O 5g/L，ZnSO4 5g/L，溶剂为蒸馏水。
(3)L-蛋氨酸含量检测
发酵液中L-蛋氨酸含量检测采用GC法。
样品预处理：取1mL发酵液置于2mL离心管中，12000r/min离心1min，弃沉淀、收集上清液；取200μL上清液于60℃烘箱烘干，采用MSTFA柱前衍生气相色谱法检测上清液中的蛋氨酸含量，烘干上清液用乙酸乙酯溶解、衍生化试剂MSTFA(含5％TMCS)按体积15％混合，70℃，350rpm/min反应1h，冷却至室温后12000r/min离心1min，收集上清液采用0.45μm微滤膜过滤，滤液采用安捷伦GC分析。
GC检测方法：处理的样品在配备有DB-5毛细管柱(30m，250μm和0.25μm，AgilentJ&W Scientific，Folsom，CA和USA)的Agilent 7890A和5975C GC-MS系统上进行。通过安捷伦自动进样器将1μL衍生物样品注入GC-MS系统，并通过DB-5毛细管柱以不分流模式分离。
氦气用作载气，其流速保持在1.1mL/min。检测器温度和进样器设定在280℃，离子源温度设定在200℃。柱箱温度从100℃开始，以4℃/分钟的速率升至320℃，在此温度下保持1.56分钟。MS检测以电子电离模式进行。质谱记录为35至300m/z，扫描时间为0.3s。在运行样品之前，使用相同的运行程序在系统中运行1μL乙酸乙酯，以避免交叉污染。
实施例2
为了提高L-蛋氨酸的产量，实验考察了辅因子VB12及其浓度对L-蛋氨酸产量的影响，考察不同的VB12浓度对L-蛋氨酸产量的影响。
将实施例1步骤(2)原始发酵培养基中添加VB12，其中VB12终浓度分别为0.5、1.0、1.5、2.0、2.5mg/L，以不添加为对照，采用相同的条件进行发酵培养，发酵48h后测定发酵液中L-蛋氨酸的含量，结果如图1。
由实验结果总结可得，通过添加VB12能有效的提高L-蛋氨酸的合成，但是VB12的量不宜过多，多则浪费，在代谢中利用不完全，由图1可知，增加VB12 2mg/L，L-蛋氨酸产量为1.82g/L，比对照组提高约65.4％。
实施例3
由于L-蛋氨酸代谢涉及多个模块的代谢，从碳骨架，一碳单位以及硫途径，只VB12一种辅因子不及代谢需要，从辅因子处考虑VB1能够促进途径中一些有机酸的分解代谢，从而提高L-蛋氨酸的产量，因此实验考察了VB1及其浓度L-蛋氨酸产量的影响。
将实施例2的原始发酵培养基增加VB12的基础上增加辅因子VB1，VB1的浓度为2、4、8、10、15mg/L，采用相同的条件进行发酵反应，考察不同的VB1浓度对L-蛋氨酸产量和菌体生长的影响，发酵48h后测定发酵液中L-蛋氨酸的含量，以实例2添加VB12，不添加VB1为对照，结果如图2。
由实验结果总结可得，过高浓度的VB1(>10m g/L)不再提高L-蛋氨酸的产量，且生物量也不再增加。说明10mg/L的VB1能促进菌体生长和产L-蛋氨酸。10mg/L时，蛋氨酸产量为2.45g/L，较对照组提高了约34.6％。
实施例4
由于L-蛋氨酸为含硫氨基酸，代谢途径中从半胱氨酸途径获得硫，从辅因子处考虑得VB6能够促进半胱氨酸途径的代谢，因此实验考察了VB6及其浓度L-蛋氨酸产量的影响。将实施例3的原始发酵培养基增加VB12，VB1的基础上增加辅因子VB6，VB6的浓度为0.04、0.1、0.4、0.8、2、4mg/L，采用相同的条件进行发酵反应，考察不同的VB6浓度对L-蛋氨酸产量和菌体生长的影响，发酵48h后测定发酵液中L-蛋氨酸的含量，以实例3添加VB12、VB1不添加VB6为对照，结果如图3。
由实验结果总结可得，过高浓度的VB6(>0.8m g/L)不再提高L-蛋氨酸的产量，反而会使地蛋氨酸的产量下降，且生物量也下降。说明0.4mg/L的VB6能促进菌体生长和产L-蛋氨酸。且硫途径对L-蛋氨酸产量的影响较大。0.4mg/L时，蛋氨酸产量为3.25g/L，较对照组提高了约32.6％。
实施例5
由于代谢蛋氨酸以及实例4发酵液检测获得结果为代谢途径中一碳单位仍不足，因此导致产量不增长，结合代谢途径分析，除基因改造行为增加一碳单位外，在发酵途径中外加一碳单位以探寻代谢途径中具体该改造的部分。分析得到，外加甘氨酸作为一碳单位的来源，因此，在实施例3的原始发酵培养基的基础上增加VB12、VB1辅因子的基础上添加甘氨酸并优化其浓度，甘氨酸终浓度分别为2mg/L、4mg/L、8mg/L、10mg/L、15mg/L和20mg/L，以不添加甘氨酸的实例3为对照，考察甘氨酸的添加及浓度对L-蛋氨酸和菌体生长的影响，实验条件同实施例1步骤(2)，结果如图4所示。
结果表明甘氨酸对L-蛋氨酸产量有明显的促进作用，在2～20mg/L范围内，L-蛋氨酸的产量随甘氨酸浓度的增加而增加。当甘氨酸浓度为10mg/L时，L-蛋氨酸的产量为2.95g/L，较对照组提高了约20.4％，但从生物量来看，甘氨酸浓度的增加并未使生物量明显增加，但是L-蛋氨酸的产量有一定的提高，说明甘氨酸在一定程度上确实在一定程度上以甘氨酸为首要的提供了一碳单位，同时还促进了其他途径从而使得L-蛋氨酸的前体物质增加，使L-蛋氨酸的产量增加，从产量生物量以及成本来算，最终优选10mg/L甘氨酸的添加量为最优。
实施例6
生长因子及其氨基酸前体物质对L-蛋氨酸发酵产量的影响
大肠杆菌代谢合成L-蛋氨酸的途径较为复杂，其中涉及多种辅酶与氨基酸前体，因此，本实验在上述实验的基础上考察了几种生长因子及其氨基酸前体物质对L-蛋氨酸发酵产量的影响。
将实施例1步骤(2)原始发酵培养基改为对照发酵培养基，组成为：葡萄糖20g/L，(NH4)2SO4 14g/L，KH2PO4 1g/L，酵母提取物2g/L，Na2S2O32g/L，金属离子混合溶液1mL/L，赖氨酸10mg/L，溶剂为蒸馏水，pH自然；金属离子混合溶液组成为：MgSO4·7H2O 500g/L，MnSO4·8H2O 5g/L，FeSO4·7H2O 5g/L，ZnSO4 5g/L，溶剂为蒸馏水。
向上述对照发酵培养基中添加VB1 10mg/L、VB6 0.4mg/L、VB12 2mg/L，根据实例5中以添加甘氨酸为一碳单位外源添加物，在此培养基基础上以实例5中10mg/L甘氨酸添加，以不添加甘氨酸为对照。
结果表明，在同时含有VB12、VB1、VB6的培养基中再以添加甘氨酸，与对照组相比，生物量不曾提高，L-蛋氨酸的产量提高也不明显，同时为成本考虑，可在原始培养基中添加VB12、VB1、VB6，而不再添加甘氨酸。
实施例7
葡萄糖浓度优化：将实例2中经优化过的发酵培养基为基础，优化碳源葡萄糖的浓度，优化碳源浓度从20、25、30、35、40g/L几个梯度中优化，在发酵培养结束后测定L-蛋氨酸的含量，pH及OD600，48h时L-蛋氨酸产量及生物量如图5,6所示。
由结果可以看出，葡萄糖浓度对L-蛋氨酸产量和生物量影响较大，其中30g/L和35g/L时，其L-蛋氨酸产量较高，35g/L的葡萄糖已有不明显的抑制，当40g/L的葡萄糖时已经开始抑制菌体生长和L-蛋氨酸的代谢了。而25g/L和30g/L时L-蛋氨酸的产量较好，其中30g/L葡萄糖时，产量达到3.16g/L。
之后以实例6的培养基，将葡萄糖从20g/L优化为30g/L，L-蛋氨酸产量达到4.15g/L，与实例6葡萄糖优化前提高了24.9％。后续实验考虑碳源成本、生物量及L-蛋氨酸的产量，可选取30g/L葡萄糖为碳源。
实施例8
pH对L-蛋氨酸的影响
将实施例3中优化发酵培养基在1L发酵罐上进行放大验证试验。培养基如实施例3，接种量为10％，并向发酵培养基中添加50mg/L Kan，不添加10g/L CaCO3，在发酵罐中采用40％氨水水溶液控制pH，搅拌转速400r/min，28℃下培养50h，为验证最适的pH，设置四批除pH不同外其他参数均相同，pH分别为6.4、6.8、7.2、7.6，检测其过程的OD以及蛋氨酸的变化情况。
结果如图7所示，实验发现产L-蛋氨酸的最适pH为6.8，L-蛋氨酸产量为2.29g/L，最适菌体生长的pH6.4；pH7.2能够加快菌体代谢L-蛋氨酸的速率，缩短L-蛋氨酸的发酵时间。相较于摇瓶中使用碳酸钙简单的调控pH，使用氨水调控pH能够更加的精准，从而能从多方面考量来控制发酵的情况。
根据上述pH的结果，整理分析，可通过分段调控pH来控制发酵的趋势。分段控pH分别选取了以下两种：
pH6.4-pH6.8，0-12小时pH6.4，12-48小时pH6.8；
pH6.4-pH7.2-pH6.8，0-12小时pH6.4，12-24小时pH7.2，24-48小时pH6.8。
结果如图8，pH6.4-pH6.8，L-蛋氨酸产量达2.56g/L，与不分段pH6.8提高13.77％，pH6.4-pH7.2-pH6.8，L-蛋氨酸产量为2.29，与pH6.8没有多大差别。

Claims (9)

1.一种提高L-蛋氨酸产量的方法，其特征在于，所述方法包括：以重组大肠杆菌E.coliW3110ΔIJAHFEBC/pAm为生产菌株，将其接种于发酵培养基中，培养至OD600＝0.6-1.0时，添加诱导剂IPTG，继续培养至发酵结束，获得含有L-蛋氨酸的发酵液，将发酵液分离纯化得到L-蛋氨酸；
所述发酵培养基包括基础培养基和辅因子，以终浓度计，所述基础培养基组成包括：葡萄糖20-40g/L、(NH4)2SO4 12-18g/L、KH2PO4 0.5-2.5g/L、酵母提取物1-4g/L、Na2S2O3 1-4g/L、赖氨酸1-15mg/L、金属离子混合溶液1mL/L，溶剂为蒸馏水；所述辅因子包括：VB12 0.2-2mg/L；pH值为5.5-7.0。
2.如权利要求1所述的提高L-蛋氨酸产量的方法，其特征在于，所述葡萄糖的终浓度为30g/L。
3.如权利要求1或2所述的提高L-蛋氨酸产量的方法，其特征在于，所述的辅因子还包括VB1 2-15mg/L。
4.如权利要求3所述的提高L-蛋氨酸产量的方法，其特征在于，所述的辅因子还包括VB60.04-4.0mg/L。
5.如权利要求4所述的提高L-蛋氨酸产量的方法，其特征在于，以终浓度计，所述发酵培养基组成为：葡萄糖30g/L、(NH4)2SO4 14g/L、KH2PO4 1g/L、酵母提取物2g/L、Na2S2O3 2g/L、赖氨酸10mg/L、金属离子混合溶液1mL/L、VB12 2mg/L、VB1 10mg/L、VB6 0.4mg/L，溶剂为蒸馏水；所述金属离子混合溶液组成为：MgSO4·7H2O 500g/L，MnSO4·8H2O 5g/L，FeSO4·7H2O 5g/L，ZnSO4 5g/L，溶剂为蒸馏水。
6.如权利要求3所述的提高L-蛋氨酸产量的方法，其特征在于，所述的发酵培养基还包括终浓度为2.0-20.0mg/L的甘氨酸。
7.如权利要求6所述的提高L-蛋氨酸产量的方法，其特征在于，以终浓度计，所述发酵培养基组成为：葡萄糖30g/L、(NH4)2SO4 14g/L、KH2PO4 1g/L、酵母提取物2g/L、Na2S2O3 2g/L、金属离子混合溶液1mL/L、VB12 2mg/L、VB1 10mg/L、甘氨酸10mg/L，溶剂为蒸馏水；所述金属离子混合溶液组成为：MgSO4·7H2O 500g/L，MnSO4·8H2O 5g/L，FeSO4·7H2O 5g/L，ZnSO45g/L，溶剂为蒸馏水。
8.如权利要求1所述的提高L-蛋氨酸产量的方法，其特征在于，所述发酵培养基中包括终浓度为10g/L的CaCO3，发酵过程中，添加氨水分段控制pH：第0-12小时，pH为6.4；第12-48小时，pH为6.8。
9.如权利要求1所述的提高L-蛋氨酸产量的方法，其特征在于，重组大肠杆菌E.coliW3110ΔIJAHFEBC/pAm接种至含有抗生素Kan的发酵培养基中，37℃、180r/min下培养至OD600＝0.6-1.0，添加终浓度为0.1mM的IPTG，再于28℃、180r/min下培养48h至发酵结束。
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