KR101622491B1 - L-메티오닌의 제조 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 생합성 공정 및 특수한 효소 공정을 사용하는 L-메티오닌 생산 방법에 관한 것이다. 더욱 특히, 본 발명은 메틸 메르캅탄 (CH₃SH) 의 존재하에 효소 전환 반응에 의해 L-메티오닌 전구체로부터 L-메티오닌을 고수율로 생산하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법은 다양한 산업 분야에서, 예컨대 사료 및 식품 첨가제로, 의료용품, 의약품의 원료로 사용될 수 있는 L-메티오닌의 선택적 생산을 가능하게 해준다.

Description

L-메티오닌의 제조 방법 {PREPARATION PROCESS OF L-METHIONINE}

본 발명은 생합성 공정 및 특수한 효소 공정을 사용하는 L-메티오닌 생산 방법에 관한 것이다. 더욱 특히, 본 발명은 메틸 메르캅탄 (CH₃SH) 의 존재하에 효소 전환 반응에 의해 L-메티오닌 전구체로부터 L-메티오닌을 고수율로 생산하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 L-메티오닌 생산 방법은 선행 기술에서 공지된 종래의 방법보다 환경 친화적이고, 다양한 산업 분야에서, 예컨대 사료 및 식품 첨가제로, 의료용품, 의약품의 원료로 사용될 수 있는 L-메티오닌의 선택적 생산을 가능하게 해준다.

메티오닌은 인간 신체의 필수 아미노산 중 하나이고, 사료 및 식품 첨가제로 널리 사용되며, 의료 용액, 의료용품, 뿐만 아니라 의약품의 합성 원료로도 사용된다. 메티오닌은 콜린 (레시틴) 및 크레아틴과 같은 화합물의 전구체로서 작용하며, 시스테인 및 타우린의 합성 원료로도 사용된다. 또한 메티오닌은 황을 제공할 수 있다.

S-아데노실-L-메티오닌은 L-메티오닌으로부터 유래되며, 인간 신체 내에서 메틸 기를 제공하는 역할을 하고, 또한 뇌의 다양한 신경전달물질의 합성에 관여한다. L-메티오닌 (L-Met) 및/또는 S-아데노실-L-메티오닌 (SAM) 은 간에서 지방 축적을 저해하고, 동맥 촉진성 지질 대사를 저해한다. 그것은 또한 뇌, 심장 및 신장의 혈액 순환을 개선하고, 따라서 항우울제, 염증, 근육통, 및 간질환을 완화하는 물질로서 사용되고, 특히 알코올에 의해 야기되는 간질환에 효과적이다.

그것은 또한 소화, 독성 물질의 해독 및 배설 및 납과 같은 중금속의 배설을 촉진하기 위해 사용될 수 있다. 그것은 골관절 질환에 대해 항염증 효과를 갖고, 관절회복을 촉진하고, 또한 모발의 필수 영양소로서 작용하여 탈모를 방지한다.

메티오닌은 이미 화학 합성 및/또는 생물학적 합성에 따라 제조되는 것으로 알려져 있으며, 이들 합성은 더욱 효율적, 선택적, 환경 친화적인 제조 방법을 제공하는 것을 주된 목적으로 하는 다수의 작업 및 연구의 주제가 되어 왔다.

화학 합성에서, 메티오닌은 대개 5-(β-메틸메르캅토에틸)히단토인의 가수분해에 의해 생산된다. 화학 합성된 메티오닌은 L-형 및 D-형의 혼합 형태로만 생산된다는 단점이 있다.

생물학적 합성에서, 메티오닌은 메티오닌 합성에 관여하는 단백질을 사용하는 방법에 의해 생산된다. L-메티오닌은 다양한 유전자 예컨대 metA, metB, metC, metE 및 metH 에 의해 발현되는 효소의 작용에 의해 호모세린으로부터 생합성된다. 특히, metA 는 메티오닌 생합성에 필수적인 첫번째 효소인, 호모세린을 O-숙시닐-L-호모세린으로 전환시키는 호모세린-O-숙시닐 트랜스퍼라아제를 코딩하는 유전자이다. metB 유전자에 의해 코딩되는 O-숙시닐호모세린 리아제 또는 시스타티오닌-γ-신타아제는 O-숙시닐-L-호모세린을 시스타티오닌으로 전환한다.

metC 유전자에 의해 코딩되는 시스타티오닌-β-리아제는 시스타티오닌을 L-호모시스테인으로 전환한다. MetE 는 코발라민-독립 메티오닌 신타아제를 코딩하고, metH 는 코발라민-의존 메티오닌 신타아제를 코딩하고, 이들은 둘다 L-호모시스테인을 L-메티오닌으로 전환한다. 이 때, metF 에 의해 코딩되는 5,10-메틸렌테트라히드로폴레이트 리덕타아제 및 glyA 에 의해 코딩되는 세린 히드록시메틸트랜스퍼라아제가 함께 작용하여 L-메티오닌 합성에 필수적인 메틸기를 제공하는 N(5)-메틸테트라히드로폴레이트를 합성한다. L-메티오닌은 상기 효소들에 의한 일련의 유기 반응에 의해 합성된다.

종래의 생물학적 공정으로 생산되는 메티오닌은 L-형이라는 장점이 있으나, 그 생산량이 매우 미량이다. 이는 메티오닌 생합성 경로가 매우 타이트한 피드백 조절 시스템이기 때문이다. 일단 메티오닌이 일정 수준으로 합성되면, 최종 산물인 메티오닌이 메티오닌 생합성을 개시하는 1 차 단백질을 코딩하는 metA 유전자의 전사를 저해한다. metA 유전자는 전사 단계에서는 메티오닌에 의해 억제되고, 그 후 번역 단계에서는 세포내 프로테아제에 의해 분해되기 때문에, metA 유전자의 과발현만으로는 메티오닌 생산을 증가시킬 수 없다.

종래의 메티오닌 생합성 공정은 시스타티오닌 신타아제 대사 경로를 사용하여 메티오닌을 생산하며, 따라서 이러한 효소 반응 공정은 설파이드 독성 및 부산물 생성으로 인해 비효율적이다. 또한, 메티오닌 합성 경로의 피드백 조절은 메티오닌의 대량 생산을 저해한다.

상기 문제점들을 극복하는 대안적인 L-메티오닌 생산 방법이 국제 출원 공개 번호 WO 2008/013432 에 개시되어 있다. 이러한 대안적 방법은 발효에 의해 L-메티오닌 전구체를 생산하는 단계, 및 효소에 의해 상기 L-메티오닌 전구체를 L-메티오닌으로 선택적으로 전환하는 단계로 이루어지는 2 단계 공정이다.

더욱 정확하게는 WO 2008/013432 는 1) L-메티오닌 전구체 생산 균주를 제조하고, 균주의 발효에 의해 L-메티오닌 전구체를 생산하는 단계, 및 2) L-메티오닌 전구체와의 효소 반응에 의해 L-메티오닌 및 유기산을 생산하는 단계를 포함하는 L-메티오닌 생산 방법을 개시한다.

단계 2) 공정은 시스타티오닌 신타아제 또는 O-숙시닐 호모세린 설프히드릴라아제 또는 O-아세틸 호모세린 설프히드릴라아제의 활성을 갖는 효소 또는 이들 효소 활성을 보유하는 균주를 사용하며, 상기 L-메티오닌 전구체 생산 균주로부터 생산되는 O-숙시닐 호모세린 또는 O-아세틸 호모세린, 및 메틸 메르캅탄을 기질로서 사용하는 효소 반응에 의해 L-메티오닌 및 유기산을 생산하는 공정을 포함한다.

WO 2008/013432 는 메틸 메르캅탄의 존재 하에 효소 반응에 의해 L-메티오닌 전구체를 L-메티오닌으로 전환하는 것으로 이루어지는 단계 2) 에 대한 일반적 정보를 제공한다.

L-메티오닌의 총 수율이 만족스럽긴 하지만, 여전히 L-메티오닌의 생합성을 더욱더 개선할 필요가 존재하며, 특히 L-메티오닌 전구체와 메틸 메르캅탄의 효소 전환 단계를 개선하여 특히 L-메티오닌을 개선된 수율로 수득할 필요가 존재한다.

그러므로, 본 발명의 첫번째 목적은 L-메티오닌 전구체와 메틸 메르캅탄의 효소 전환으로 L-메티오닌을 개선된 수율로 수득하는 개선된 방법을 제공하는 것이다.

더욱 특히, 본 발명은 L-메티오닌 전구체 및 메틸 메르캅탄의 효소 반응에 의한 L-메티오닌 생산 방법을 제공한다.

본 발명의 방법에서, L-메티오닌 전구체는 메틸 메르캅탄과의 효소 반응에 의해 L-메티오닌으로 전환될 수 있는 당업계에 공지된 임의의 전구체일 수 있으며, 예를 들어 WO 2008/013432 에 개시되어 있다. 본 발명의 바람직한 양상에 따르면, L-메티오닌 전구체의 전환에 사용되는 효소는 바람직하게는 기질로서 축적된 호모세린, O-포스포-호모세린, O-숙시닐 호모세린 또는 O-아세틸 호모세린을 사용하는 시스타티오닌 신타아제 또는 O-숙시닐 호모세린 설프히드릴라아제 또는 O-아세틸 호모세린 설프히드릴라아제로부터 선택된다.

더욱 바람직하게는, 본 발명의 방법에 사용되는 L-메티오닌 전구체는 O-숙시닐 호모세린 (OSH) 및 O-아세틸 호모세린 (OAH) 으로부터 선택된다. 더욱더 바람직하게는, L-메티오닌 전구체는 OAH 이다.

본 발명의 방법에서, O-아세틸 호모세린이 L-메티오닌 전구체로서 사용되는 경우, 바람직하게는 렙토스피라 속 (Leptospira sp.), 크로모박테리움 속 (Chromobacterium sp.), 또는 하이포모나스 속 (Hyphomonas sp.) 으로부터 유래된, 더욱 바람직하게는 렙토스피라 메에리 (Leptospira meyeri), 슈도모나스 애루기노사 (Pseudomonas aurogenosa), 하이포모나스 넵튜니움 (Hyphomonas Neptunium) 또는 크로모박테리움 비오라슘 (Chromobacterium Violaceum) 으로부터 유래된, 시스타티오닌-γ-신타아제 또는 O-숙시닐 호모세린 설프히드릴라아제 또는 O-아세틸 호모세린 설프히드릴라아제 (OAHS) 가 사용될 수 있다.

본 발명의 효소 반응 공정은 하기 반응식으로 나타낼 수 있다:

O-숙시닐-L-호모세린 + CH₃SH ↔ L-메티오닌 + 숙시네이트

O-아세틸-L-호모세린 + CH₃SH ↔ L-메티오닌 + 아세테이트

상기 반응은 효소 반응이고, 메틸 메르캅탄 (CH₃SH) 의 특정 압력 범위로 작업된다.

상기 반응에서, 메틸 메르캅탄의 CH₃S- 잔기가 O-숙시닐 호모세린 또는 O-아세틸 호모세린의 숙시네이트 또는 아세테이트 잔기와 치환되어 L-메티오닌을 생성하게 된다. 본 발명에 따르면, 메틸 메르캅탄은 정확한 압력 범위에서 첨가되며, 이는 본 명세서에서 추가로 설명된다.

위에 기재된 메틸 메르캅탄의 존재 하에 L-메티오닌 전구체를 L-메티오닌으로 전환하는 반응은 효소 반응이며, 예를 들어 WO 2008/013432 에 개시되어 있다.

WO 2008/013432 는 메틸 메르캅탄의 존재 하에 L-메티오닌 전구체를 L-메티오닌으로 전환하는 적합한 활성을 갖는, 사용될 수 있는 효소의 성질 및 제조에 대한 세부사항을 제공한다. 그러한 적당한 효소는 예를 들어 생명공학적 방법에 따른 유전자 발현을 사용하여 제조될 수 있다.

비제한적 예로서, 상기 효소 활성을 갖는 효소를 코딩하는 유전자의 서열은 NCBI (미국), 및 DNA 데이타 뱅크 (KEGG) (일본) 의 데이타베이스로부터 수득될 수 있다.

생물학적 전환 반응을 위해, 수득된 유전자 서열로부터 유전자가 클로닝된 후, 발현 벡터 내로 도입된다. 재조합 균주로부터 효소가 활성 형태로 발현된다. 효소 발현 균주 및 발현된 효소는 둘다 반응에 직접 사용될 수 있다.

상기 유전자로부터 발현된 효소 또는 그러한 효소를 발현하는 미생물 균주가 직접, 일부 또는 전부, L-메티오닌 전구체가 축적된 발효 상청액 또는 발효 브로쓰와 혼합되어 반응이 개시될 수 있다. 본 발명의 바람직한 구현예에서, 발효액에 축적된 O-숙시닐 호모세린 또는 O-아세틸 호모세린은 슈도모나스 속 (Pseudomonas sp.), 크로모박테리움 속 (Chromobacterium sp.), 렙토스피라 속 (Leptospira sp.) 또는 하이포모나스 속 (Hyphomonas sp.) 으로부터 유래된 시스타티오닌-γ-신타아제 또는 O-아세틸 호모세린 설프히드릴라아제 또는 O-숙시닐 호모세린 설프히드릴라아제에 의해 L-메티오닌으로 전환될 수 있다.

더욱 바람직하게는, 발효액에 축적된 O-숙시닐 호모세린은 슈도모나스 애루기노사 (Pseudomonas aurogenosa), 슈도모나스 푸티다 (Pseudomonas putida) 또는 크로모박테리움 비오라슘 (Chromobacterium Violaceum) 으로부터 유래된 시스타티오닌-γ-신타아제 또는 O-아세틸 호모세린 설프히드릴라아제 또는 O-숙시닐 호모세린 설프히드릴라아제에 의해 메티오닌으로 전환된다. 발효액에 축적된 O-아세틸 호모세린은 렙토스피라 메에리 (Leptospira meyeri), 하이포모나스 넵튜니움 (Hyphomonas Neptunium) 또는 크로모박테리움 비오라슘 (Chromobacterium Violaceum) 으로부터 유래된 시스타티오닌-γ-신타아제 또는 O-아세틸 호모세린 설프히드릴라아제 또는 O-숙시닐 호모세린 설프히드릴라아제에 의해 메티오닌으로 전환된다.

각각의 유전자는 대장균 (E. coli) 용 발현 벡터인 pCL-CJI 벡터 (CJ, 대한민국) 에서 발현되고, 발현된 단백질은 초음파처리를 이용하는 세포 용해로 제조된 효소 용액으로부터 수득된다. O-숙시닐 호모세린 또는 O-아세틸 호모세린이 축적된 발효액에 효소 용액이 첨가되고, 거기에 또한 메틸 메르캅탄이 첨가되어 반응이 개시된다.

반응이 DTNB [5,5-디티오비스(2-니트로-벤조산, Sigma, 미국] 을 사용하여 확인되고, 반응 산물이 HPLC 로 분석된다. 본 발명에서, 숙신산 또는 아세트산과 같은 부산물이, 별도의 생산 공정 없이, 각각 메틸 메르캅탄과 O-숙시닐 호모세린 및 O-아세틸 호모세린의 반응에 의해 부가적으로 수득될 수 있다.

L-메티오닌 전구체와 CH₃SH 의 효소 반응은 하기 반응식으로 나타낼 수 있다:

위에 기재된 바와 같이, L-메티오닌 전구체의 효소 전환은 메틸 메르캅탄 (CH₃SH) 의 존재 하에, 본 발명에 따라, CH₃SH 압력 하에 실시되며, 더욱 구체적으로는 반응 매질 위의 CH₃SH 분압이 특정 압력 범위 내이다.

WO 2008/013432 에 기재된 방법은 이와 같이 메틸 메르캅탄의 존재 하에 L-메티오닌 전구체를 L-메티오닌으로 효소 전환하는 것에 관한 상세한 작업 조건을 제공하지 않으며, 특히 메틸 메르캅탄을 투여 방식에 대한 지시 없이 사용한다. 또한 L-메티오닌 전구체의 전환율에 대한 정보도 없다.

본 발명자들은 이제 L-메티오닌 전구체의 전환율이 메틸 메르캅탄을 반응 매질에 투여하는 방식, 특히 이러한 반응에 사용되는 전환 반응 용기에 존재하는 CH₃SH 분압에 크게 의존함을 발견했다.

더욱 정확하게는, 전환율이 압력의 유익한 효과에서부터 강한 저해 효과까지 이동하는, 0 에서부터 반응 온도에서의 CH₃SH 포화 증기압까지 좁은 구간 (thin window) 이 존재하는 것이 분명해 보인다.

그러므로 메티오닌 전구체 (예를 들어 OAHS) 가 메티오닌으로 최대로 전환되는 최적 CH₃SH 분압이 존재한다. CH₃SH 압력이 높을수록, 용해되는 CH₃SH 의 양이 더 많아지고, 결과적으로 전환 반응의 속도가 빨라지므로, 메티오닌으로의 전환율이 높아질 것으로 예상되었다.

그러나 CH₃SH 압력을 크게 증가시키는 것은 상기 전환에 유해한 것으로 관찰되었다. 이론에 구속되지 않으면서, 이러한 현상에 대한 하나의 설명은 너무 큰 CH₃SH 압력은 반응 매질에 너무 많은 양의 CH₃SH 가 존재하게 한다는 것이다. 이러한 과잉량의 CH₃SH 는 효소의 활성 자리를 차단하여, 반응의 저해를 초래할 것이다. 그러므로 반응 속도와 효소의 반응 자리에 대한 접근 사이에 경쟁이 존재할 것이다.

본 발명의 방법에 따르면, 반응 온도에서 반응 용기 내의 반응 매질 위의 최적 CH₃SH 분압은 10 ㎪ ~ 180 ㎪, 바람직하게는 51 ㎪ ~ 180 ㎪, 더욱 바람직하게는 51 ㎪ ~ 160 ㎪, 더욱더 바람직하게는 약 80 ㎪ ~ 약 160 ㎪, 유리하게는 약 90 ㎪ ~ 약 150 ㎪ 이고, 예를 들어 CH₃SH 분압은 약 100 ㎪ ~ 150 ㎪ 이다.

이들 특정 조건은 빠른 전환 속도 뿐만 아니라 높은 L-메티오닌 전구체 전환율을 허용하며, 예를 들어 2 시간의 반응 시간 후에 100% 전환율이 수득될 수 있다.

반응은 일반적으로 L-메티오닌 전구체를 L-메티오닌으로 효소 전환하는데 적합화된 적당한 온도에서 실시되며, 예를 들어 WO 2008/013432 에 개시되어 있다. 유리하게는, 반응 온도는 20℃ ~ 45℃, 바람직하게는 25℃ ~ 40℃, 더욱더 바람직하게는 30℃ ~ 40℃ 이다.

더욱 정확하게는, 메틸 메르캅탄은 딥 튜브 (dip-tube) 를 통해 반응기 내에 반응 매질 내로 도입된다. 메틸 메르캅탄은 외부 메틸 메르캅탄 용기에 질소 압력을 가함으로써 도입된다. 메틸 메르캅탄 유량은 질소 압력을 변화시킴으로써, 그리고 배출 밸브 (exhaust valve) 로 제어된다. 도입된 메틸 메르캅탄 중 일부는 반응 매질에 용해되지만, 나머지 일부는 반응 매질 위에 기체 형태로 존재한다.

반응 매질 중 메틸 메르캅탄의 용해도는 메틸 메르캅탄과 디메틸 설파이드 (DMS) 를 적당한 비율로 혼합함으로써 증가될 수 있다. DMS 의 사용은 L-메티오닌 전구체로부터 L-메티오닌 및 유기산으로의 전환율, 뿐만 아니라 L-메티오닌 생산 수율을 개선한다.

DMS 가 메틸 메르캅탄과 혼합되는 경우, 메틸 메르캅탄/DMS 몰비는 바람직하게는 1:0.05 ~ 1:1, 더욱 바람직하게는 1:0.20 ~ 1:1, 더욱더 바람직하게는 1:0.25 ~ 약 1:0.50 이다. 예를 들어, DMS 는 메틸 메르캅탄 및 DMS 의 총합에 대해 약 5% ~ 25%, 바람직하게는 20% ~ 25% 의 비율로 혼합될 수 있다.

요구량의 메틸 메르캅탄을 반응기 내로 도입하고, 액체상과 기체상 사이의 평형 상태에 도달된 후, 메틸 메르캅탄이 첨가 또는 제거될 수 있고, 반응 매질 위의 분압이 임의의 공지된 방법으로, 예를 들어 압력계로 체크된다. 메틸 메르캅탄 분압은 반응 완료시까지 반응 내내 제어된다.

바람직한 구현예에 따르면, 메틸 메르캅탄의 도입은 화학량론적 양이 도입되었을 때 중단되고, 이 시점에서부터 반응 완료시까지 메틸 메르캅탄 분압이 감소한다.

반응의 효소 전환 반응은 또한 산성 부산물을 초래하므로, 반응 매질의 pH 는 유리하게는 대략 중성 또는 약산성 값으로 제어 및 유지될 수 있고, 바람직하게는 전환 동안 반응 매질의 pH 는 6 ~ 7 로 유지된다.

pH 값을 6 ~ 7 로 조정하기 위해, 1 종 이상의 염기성 화합물이 반응 매질에 첨가될 수 있고, 상기 염기성 화합물은, 예를 들어 수산화 암모늄, 수산화 칼륨, 암모니아 등으로부터 선택되는, WO 2008/013432 에 개시된, 수성 염기이고, 예를 들어 암모니아 수용액이다.

또한 전환 반응은 유리하게는 당업계에 공지된 기술에 따라 조효소의 존재 하에 실시되며, 예를 들어 WO 2008/013432 에 개시되어 있다. 그러한 조효소의 예는 피리독살-5'-포스페이트 (PLP) 이다.

본 발명의 방법을 실시하면서, CH₃SH 분압을 위에 정의된 바람직한 값으로 설정하면, L-메티오닌 전구체의 전환율은 CH₃SH 분압이 본 발명의 방법의 범위 밖에 있을 때보다 10% ~ 20% 더 높다. 이들 특정 조건 하에, L-메티오닌 전구체 전환율이 이르게는 0.5 시간 후에 80% 초과이고, 2 시간의 반응 시간 후에 100% 일 수 있음이 또한 관찰되었다.

이렇게 특히 빠른 완전한 전환율은 L-메티오닌의 전체적 제조 (overall preparation) 를 초래하므로 (이때 L-메티오닌 전구체의 효소 전환은 제한 단계가 아님), L-메티오닌의 전체적 생합성 수율은 이제까지 선행기술에서 알려진 수율보다 높다.

따라서, 본 발명의 두번째 양상은 하기 단계를 포함하는 L-메티오닌의 제조 방법에 관한 것이다:

1) L-메티오닌 전구체-생산 균주를 제조하고, 균주의 발효에 의해 L-메티오닌 전구체를 생산하는 단계,

2) 10 ㎪ ~ 180 ㎪, 바람직하게는 50 ㎪ ~ 160 ㎪, 더욱 바람직하게는 약 80 ㎪ ~ 약 150 ㎪ 분압의 CH₃SH 의 존재 하에 효소 반응에 의해 상기 L-메티오닌 전구체를 L-메티오닌으로 전환하는 단계, 및

3) 수득된 L-메티오닌을 수집하는 단계.

이와 같은 L-메티오닌의 생합성 제조의 전체적 과정은 하기 반응식으로 나타낼 수 있다:

상기 L-메티오닌 전구체는 글루코스의 발효로부터, 유전자 발현을 통해 제조된, OAHS 이다.

단계 1 의 발효 방법은 당업계에 공지된 임의의 발효 방법일 수 있으며, 예를 들어 WO 2008/013432 에 개시되어 있다.

특히, 방법의 단계 1) 에서, L-메티오닌 전구체 생산 균주가 생성되고 발효되어 배양 배지에 L-메티오닌 전구체가 축적된다.

본 발명의 L-메티오닌 전구체는 바람직하게는 O-아세틸 호모세린 또는 O-숙시닐 호모세린이다. 본원에서 사용되는 "L-메티오닌 전구체-생산 균주" 는 본 발명에 따른 조작에 의해 L-메티오닌 전구체를 축적할 수 있는 원핵 또는 진핵 미생물 균주를 언급한다.

예를 들어, 균주는 에스케리치아 속 (Escherichia sp.), 에르비니아 속 (Erwinia sp.), 세라티아 속 (Serratia sp.), 프로비덴시아 속 (Providencia sp.), 코리네 박테리아 속 (Coryne bacteria sp.), 슈도모나스 속 (Pseudomonas sp.), 렙토스피라 속 (Leptospira sp.), 살모넬라 속 (Salmonellar sp.), 브레비박테리아 속 (Brevibacteria sp.), 히포모노나스 속 (Hypomononas sp.), 크로모박테리움 속 (Chromobacterium sp.) 및 노르카디아 속 (Norcardia sp.) 미생물 또는 진균 또는 효모로 이루어지는 군으로부터 선택될 수 있다.

바람직하게는, 슈도모나스 속 (Pseudomonas sp.), 노르카디아 속 (Norcardia sp.) 및 에스케리치아 속 (Escherichia sp.) 의 미생물이 사용되어 O-숙시닐 호모세린을 생산할 수 있고, 에스케리치아 속 (Escherichia sp.), 코리네박테리움 속 (Coryne bacteria sp.), 렙토스피라 속 (Leptospira sp.) 의 미생물 및 효모가 사용되어 O-아세틸 호모세린을 생산할 수 있다. 더욱 바람직하게는, 에스케리치아 속 (Escherichia sp.) 의 미생물이 사용될 수 있고, 가장 바람직하게는 에스케리치아 콜라이 (Escherichia coli) (이후 "대장균 (E. coli)" 으로 언급됨) 가 사용될 수 있다. 또한, 외래 유전자가 에스케리치아 속 (Escherichia sp.) 미생물 내로 도입되어 O-숙시닐 호모세린 및 O-아세틸 호모세린을 선택적으로 생산할 수 있다.

L-메티오닌 전구체 생산 균주는 L-라이신, L-트레오닌 또는 L-이소류신 생산 균주로부터 제조될 수 있다. 바람직하게는, 그것은 L-트레오닌 생산 균주를 사용하여 제조될 수 있다. 이 균주의 경우, 호모세린 합성이 이미 더 높으므로, 결과적으로 메티오닌 전구체의 생산이 증가될 수 있다.

따라서, 메티오닌 전구체는 L-트레오닌 생산 균주를 사용하여 트레오닌 생합성 경로에 관여하는 유전자 및 그 후 metA 또는 metY 또는 MetZ 유전자를 결실 또는 약화시킴으로써 축적될 수 있다. 먼저 thrB 유전자를 그리고 그 후 metB, metY 또는 metZ 를 결실 또는 약화시켜 메티오닌 전구체를 합성하는 것이 더욱 바람직하다. 한편, metA 또는 metX 유전자 발현의 증강은 메티오닌 전구체 합성의 증가를 초래한다.

본원에서 이전에 기재된, 본 발명의 "L-트레오닌-생산 균주" 는 생체 내에서 L-트레오닌을 생산할 수 있는 원핵 또는 진핵 미생물 균주를 언급한다. 예를 들어, 균주는 에스케리치아 속 (Escherichia sp.), 에르비니아 속 (Erwinia sp.), 세라티아 속 (Serratia sp.), 프로비덴시아 속 (Providencia sp.), 코리네박테리움 속 (Corynebacterium sp.) 및 브레비박테리움 속 (Brevibacterium sp.) 에 속하는 L-트레오닌 생산 미생물 균주일 수 있다. 이들 중에서, 에스케리치아 속 (Escherichia sp.) 미생물이 바람직하고, 에스케리치아 콜라이 (Escherichia coli) 가 더욱 바람직하다.

L-트레오닌 생산 균주는 천연 미생물 뿐만 아니라 그의 변이체를 포함하며, 예를 들어 이소류신 리키형 요구성 (leaky requirement) 및 L-라이신 유사체 및 α-아미노부티르산에 대한 내성을 갖는 미생물; 내재적 포스포에놀 피루베이트 카르복실라아제 (ppc) 유전자가 추가로 1 카피 이상 부가적으로 도입된 변이 미생물; L-메티오닌 합성의 중간체인 옥살로아세테이트 (OAA) 를 포스포에놀 피루베이트 (PEP) 로 전환하는 과정에 관여하는 pckA 유전자가 불활성화된 미생물; L-메티오닌 생합성에 관여하는 tyrB 유전자의 발현을 저해하는 tyrR 유전자가 불활성화된 미생물; 글루코스 수송에 관여하는 galP 유전자의 발현을 저해하는 galR 유전자가 불활성화된 미생물이다.

본원에서 L-라이신 유사체는 S-(2-아미노에틸)-L-시스테인 및 δ-메틸-L-라이신으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1 종 이상의 화합물일 수 있다. 본 발명의 바람직한 구현예에서, L-트레오닌을 생산하는 대장균 변이 균주 TF4076 (KFCC 10718, 대한민국 특허 공고 92-8365) 을 변이시킨 L-트레오닌 생산 및 L-메티오닌-비요구성 균주 CJM002 가 사용되었다. TF4076 은 메티오닌 요구성, 및 메티오닌 유사체 (예를 들어, α-아미노-β-히드록시 발레르산, AHV), 라이신 유사체 (예를 들어, S-(2-아미노에틸)-L-시스테인, AEC), 및 이소류신 유사체 (예를 들어, α-아미노부티르산) 에 대한 내성을 갖는다.

상기 제조된 L-메티오닌 전구체 생산 균주의 배양은 당업계에 공지된 적합한 배지 및 조건에 의해 실시될 수 있다. 당업자는 선택된 균주에 따라 배양 방법을 용이하게 조절하여 사용할 수 있음을 잘 이해한다. 예를 들어, 배양 방법은 배치식 (batch) 배양, 연속식 배양 및 유가식 (fed-batch) 배양을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 다양한 배양 방법이 예를 들어 "Biochemical Engineering", J. M. Lee, Prentice-Hall International Editions, pp 138-176 에 기재되어 있다.

배지는 특정 균주에 대한 배양 조건을 충족시켜야 한다. 다양한 미생물 배양 배지가 예를 들어 "Manual of Methods for General Bacteriology", American Society for Bacteriology, Washington D.C., USA, 1981 에 기재되어 있다. 이들 배지는 다양한 탄소 공급원, 질소 공급원 및 미량 원소를 포함한다. 탄소 공급원은 예를 들어 탄수화물 예컨대 글루코스, 수크로스, 락토스, 프룩토스, 말토스, 전분, 셀룰로스; 지방 예컨대 대두유, 해바라기유, 피마자유 및 코코넛 오일; 지방산 예컨대 팔미트산, 스테아르산, 및 리놀레산; 알코올 예컨대 글리세롤 및 에탄올; 및 유기산 예컨대 아세트산이다.

이들 화합물 중 하나 또는 이들의 혼합물이 탄소 공급원으로서 사용될 수 있다. 질소 공급원은 예를 들어 유기 질소 공급원 예컨대 펩톤, 효모 추출물, 그레이비, 맥아 추출물, 옥수수 침지액 (CSL) 및 콩가루 및 무기 질소 공급원 예컨대 요소, 암모늄 설페이트, 암모늄 클로라이드, 암모늄 포스페이트, 암모늄 카르보네이트 및 암모늄 니트레이트이다. 이들 화합물 중 하나 또는 이들의 혼합물이 질소 공급원으로서 사용될 수 있다.

본원에서 배지는 칼륨 이수소 포스페이트, 이칼륨 수소 포스페이트 및 상응하는 나트륨-함유 염을 포스페이트 공급원으로서 부가적으로 포함할 수 있다. 또한 배지는 금속 염 예컨대 마그네슘 설페이트 또는 철 설페이트를 포함할 수 있다. 또한, 아미노산, 비타민 및 적절한 전구체가 첨가될 수 있다. 배지 또는 전구체는 배양물에 배치식 또는 연속식으로 첨가될 수 있다.

배양물의 pH 는 배양 동안 암모늄 수산화물, 칼륨 수산화물, 암모니아, 인산 및 황산과 같은 화합물을 적당한 방식으로 첨가함으로써 조정될 수 있다. 배양물의 호기 상태를 유지하기 위해, 산소 또는 산소-함유 기체 (예를 들어 공기) 가 배양물 내로 주입될 수 있다. 배양물의 온도는 통상적으로 20℃ ~ 45℃, 바람직하게는 25℃ ~ 40℃ 이다.

배양 기간은 L-메티오닌 전구체의 생산이 원하는 수준에 도달할 때까지 지속될 수 있고, 바람직한 배양 시간은 10 시간 ~ 160 시간 이다.

본 발명의 방법은 L-메티오닌의 선택적 생산 (이는, D-메티오닌 및 L-메티오닌을 함께 생산하는 종래의 화학 합성보다 우수함), 및 부가적 독립적 방법 없이 부산물로서 유기산 예컨대 숙신산 또는 아세트산의 생산을 가능하게 해준다.

하기 실시예는 첨부된 청구항에서 정의된 본 발명의 범위를 제한하는 의도 없이 본 발명을 설명한다. 본 발명의 실용적인 현재 바람직한 구현예가 하기 실시예에서 오직 설명을 목적으로 제시되어 있다.

그러나, 당업자는 이러한 공개를 고려하여 본 발명의 구성 및 범위 내에서 변화 및 개선을 이룰 수 있음을 이해할 것이다.

실시예 1 ~ 4

실시예 1 ~ 4 는 반응 매질 위의 메틸 메르캅탄 (CH₃SH) 분압을 다양하게 하여 실시한다. 하기 실시예에서 이들 분압은 10 ㎪ ~ 200 ㎪ 이다.

앵커-패들로 끝나는 교반기가 설치되어 있고, 회전속도계가 달린 교반기 모터, 재킷 내부의 오일 순환을 허용하는 자동온도조절식 바쓰, 시쓰 (sheath) 내 온도측정 프로브, pH 프로브, 압력계, 질소 주입구 및 딥 튜브를 통하는 메틸 메르캅탄 주입구를 갖춘 5 ℓ 스테인리스 스틸 재킷형 반응기를 포함하는 장치에서 모든 시험을 실시한다. 메틸 메르캅탄의 유량을 측정하고, 질량 유량계로 제어한다.

하기 절차를 모든 실험에 적용했다:

3 ℓ 의 증류수로 희석한 225 g 의 O-아세틸 호모세린 (OAHS, 1.4 mol) 을 반응기에 도입한다.

교반 속도를 600 RPM 으로 설정하고 반응 매질을 33℃ (반응 온도) 로 가열한다.

반응 온도가 33℃ 에 도달할 때, 암모니아 (증류수 중 28 wt%) 를 첨가하여 pH 를 6.5 로 조정한다.

3 ㎖ 의 피리독살-5'-포스페이트 (PLP) 용액 (증류수 중 10 mM) 을 반응기에 첨가한다. PLP 는 조효소로 사용된다. 그 후 반응기를 밀폐한다.

그리고, 메틸 메르캅탄을 딥 튜브가 설치되어 있는 가압 실린더 내에서 액화시킨다. CH₃SH 압력보다 높은 질소 압력을 액화 CH₃SH 위에 가한다. 이런 식으로, 액체 CH₃SH 를 주 반응기 내의 반응 매질 내로 도입할 수 있다. CH₃SH 는 주 반응기 내에서 자발적으로 기화된다.

교반하는 동안, 수 분 내지 한두 시간 후에 반응기 내에서 액체상 및 기체상 사이의 평형 상태에 도달된다. CH₃SH 분압이 압력계에 표시되고, 밸브를 사용하여 실시예에 요구되는 값으로 제어된다. 메틸 메르캅탄을 또한 유량 제어하면서 도입한다.

메틸 메르캅탄 분압을 10 ㎪ (실시예 1), 100 ㎪ (실시예 2), 150 ㎪ (실시예 3), 및 200 ㎪ (실시예 4) 로 설정한다.

9 g 의 효소 (예컨대 WO 2008/013432 에 기재됨) 를 150 ㎖ 증류수에 용해시키고, 중간체 질소 가압 용기를 사용하여 반응기 내에 도입한다.

화학량론적 양 (67.2 g, 1.4 mol) 을 도입했을 때 메틸 메르캅탄 (CH₃SH) 의 도입을 중단한다. 이 시점으로부터, CH₃SH 분압은 반응 시간 종료시까지 감소한다.

반응 시간 내내, 앞에 언급한 바와 같이 암모니아를 첨가하여 pH 를 6.2 ~ 6.5 로 유지한다. 실제로 반응 매질의 pH 는 반응 부산물인 아세트산의 방출로 인해 시간의 흐름에 따라 감소한다.

매 시간 마다, 반응기로부터 샘플을 취하고, HPLC (고압 액체 크로마토그래피) 로 분석하여 잔류 OAHS 및 L-메티오닌 함량을 확인한다.

하기 표 1 은 실시예 1-4 의 결과를 조합한다:

-- 표 1 --

이들 결과는 첫째로 CH₃SH 분압 증가의 유익 효과를 보여주며, 예를 들어 실시예 1 및 실시예 2 의 3 h 에서의 OAHS 전환율, 즉 L-메티오닌 수율을 비교한다. CH₃SH 분압의 추가의 증가는 유해 효과를 초래하며, 예를 들어 실시예 4 의 3 h 에서의 OAHS 전환율, 즉 L-메티오닌 수율을 참고한다.

이들 첫번째 4 가지 실험은 반응기 내부의 정확한 CH₃SH 분압 (상기 실시예에서 10 ㎪ ~ 150 ㎪, 바람직하게는 100 ㎪ ~ 150 ㎪) 에서 최적 OAHS 전환율, 및 결과적으로 최적 L-메티오닌 생산 수율이 달성됨을 명백히 보여준다.

실시예 5 ~ 7

하기 실시예 5 ~ 7 에 기재된 시험을 30 ℓ 반응기에서 이전 실시예에 기재된 바와 동일한 절차를 사용하여 실시하나, 33℃ 대신 37℃ 의 반응 온도에서 실시하고, PLP 를 처음 용해시켰던 신선한 효소 용액의 또다른 샘플을 반응기 내에 도입하기 전에 20 분 동안 느리게 교반하여 사용한다.

이러한 효소/PLP 용액을 WO 2008/013432 에 따라 신선하게 제조된 효소 용액 1.2 ℓ 및 증류수 중 10 mM PLP 용액 25 ㎖ 로 제조한다. OAHS 의 사용량은 18.5 ℓ 의 증류수에 희석된 1480 g 이다.

이전 실시예에 기재된 바와 같이 암모니아를 사용하여 반응 매질의 pH 를 6.2 로 조정하고, 교반 속도를 300 RPM 으로 설정한다.

하기 표 2 는 실시예 5 ~ 7 의 결과를 조합한다:

-- 표 2 --

이들 실시예는 메틸 메르캅탄 분압의 효과와 관련하여 동일한 현상을 보여준다. 이러한 반응에 최고 성능이 수득될 수 있는 최적 압력이 존재함이 확인된다. 이러한 최적 CH₃SH 분압은 여기서 다시 10 ㎪ 내지 200 ㎪ 미만으로 관찰된다.

Claims (12)

1. L-메티오닌 전구체와 메틸 메르캅탄의 효소 전환으로 L-메티오닌을 수득하는 방법으로서, 반응 온도에서 반응 용기 내의 반응 매질 위의 메틸 메르캅탄 분압이 10 ㎪ ~ 180 ㎪ 인 방법.
2. 제 1 항에 있어서, 반응 온도가 20℃ ~ 45℃ 인 방법.
3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, L-메티오닌 전구체가 O-숙시닐 호모세린 (OSHS) 및 O-아세틸 호모세린 (OAHS) 으로부터 선택되는 방법.
4. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 효소 전환에 사용되는 효소가 생명공학적 방법에 따른 유전자 발현을 사용하여 제조되는 방법.
5. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 효소 전환에 사용되는 효소가 슈도모나스 속, 크로모박테리움 속, 렙토스피라 속 또는 하이포모나스 속으로부터 유래된 시스타티오닌-γ-신타아제 또는 O-아세틸 호모세린 설프히드릴라아제 또는 O-숙시닐 호모세린 설프히드릴라아제로부터 선택되는 방법.
6. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 반응 매질의 pH 가 6 ~ 7 로 유지되는 방법.
7. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 조효소가 첨가되고, 상기 조효소는 피리독살-5'-포스페이트인 방법.
8. 하기 단계를 포함하는 L-메티오닌의 제조 방법:
   1) L-메티오닌 전구체-생산 균주를 제조하고, 균주의 발효에 의해 L-메티오닌 전구체를 생산하는 단계,
   2) 제 1 항 또는 제 2 항의 효소 전환 방법에 따라, 상기 L-메티오닌 전구체를 L-메티오닌으로 전환하는 단계, 및
   3) 수득된 L-메티오닌을 수집하는 단계.
9. 제 8 항에 있어서, 상기 L-메티오닌 전구체-생산 균주가 L-메티오닌 전구체를 축적할 수 있는 원핵 또는 진핵 미생물 균주인 방법.
10. 제 9 항에 있어서, 균주가 에스케리치아 속, 에르비니아 속, 세라티아 속, 프로비덴시아 속, 코리네 박테리아 속, 슈도모나스 속, 렙토스피라 속, 살모넬라 속, 브레비박테리아 속, 히포모노나스 속, 크로모박테리움 속 및 노르카디아 속 미생물 또는 진균 또는 효모로 이루어지는 군으로부터 선택되는 방법.
11. 제 9 항에 있어서, 다양한 탄소 공급원, 질소 공급원 및 미량 원소를 포함하는 배양 배지에서 균주가 수득되는 방법.
12. 제 11 항에 있어서, 탄소 공급원이 글루코스, 수크로스, 락토스, 프룩토스, 말토스, 전분, 셀룰로스; 대두유, 해바라기유, 피마자유 및 코코넛 오일과 같은 지방; 팔미트산, 스테아르산, 및 리놀레산과 같은 지방산; 글리세롤 및 에탄올과 같은 알코올; 및 아세트산과 같은 유기산, 및 이들의 혼합물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 방법.