KR920008365B1 - L-스레오닌 제조방법 - Google Patents

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내용 없음.

Description

L-스레오닌 제조방법

본 발명은 L-스레오닌을 발효 생산하는 미생물 및 이를 이용한 L-스레오닌의 제조방법에 관한 것이다.

좀더 구체적으로는 에스케리키아 콜리 야생친주(E.coli W3110)로부터 돌연변이하여 메치오닌 유사체 내성, 메치오닌 영양요구성, L-스레오닌 유사체 내성, 이소루이신 리키(leaky)형 요구성, L-라이신 유사체 내성, L-발린, L-이소루이신 유사체 내성을 갖는 균주와 이 균주를 이용한 발효 및 L-스레오닌의 제조방법에 관한 것이다.

L-스레오닌은 필수 아미노산으로서, 이를 사료에 첨가함으로써 사료의 질을 향상시키기 때문에 사료첨가제로 사용될 뿐만 아니라 식품첨가제 및 의약용으로 수액제등으로 사용된다. 현재 L-스레오닌의 제조방법은 영양요구성 균주 및 대사조절 변이주를 이용하는 발효법이 주를 이루고 있다. 예를들면 에스케리키아(Escherichia)속에 속하며 디아미노피메릭산 및 메치오닌을 요구하며, 그의 생합성계가 스레오닌의 피이드백 억제작용(feedback inhibition)을 저지하는 미생물을 이용하는 방법(일본국 공고특허출원 제10037/81호), 브레비박테리움(Brevihacterium)속에 속하며 S-(2-아미노에칠)-L-시스테인 및 α-아미노-β-히드록시 발렉릭산에 대한 내성을 지니며 L-이소루이신 및 L-라이신 영양요구성 미생물을 이용하는 방법(일본국 공개특허출원 제224684/83호) 에스케리키아속에 속하며 디아미노피메릭산, 메치오닌요구성, α-아미노-β-히드록시 발레릭산 내성을 지니며 리팜피신, 라이신, 메치오닌, 아스파르트산 및 호모세린중 최소한 1가지 물질에 대한 내성을 갖거나 또는 저하된 L-스레오닌 분해능을 갖는 미생물을 이용한 방법(한국 공개특허출원 제8022/87호), 프로비덴시아(Providencia)속에 속하며 α-아미노-β-히드록시 발레릭산, L-에치오닌, 치아이소루이신(thiaisoleucine), 옥시치아민(oxythiamine) 및 설파구아니딘(sulfaguanidine) 내성을 지니며, L-루이신 요구성, L-이소루이신 리키(leaky)형 요구성 미생물을 이용하는 방법(일본국 공개특허출원 제219582/90호)들이 공지되어 있다.

그러나 상술한 공지의 방법들은 L-스레오닌 생산성이 높지 못하거나 또는 디아미노피메릭산 요구성 또는 이소루이신요구성과 같은 값비싼 물건들을 첨가해야 하는 단점들이 있다. 즉, 디아미노피메릭산 요구성주를 사용할 경우 디아미노피메릭산을 부발효해야 하므로 원가부담요인이 크며, 이소루이신 요구성주를 사용할 경우에도 이소루이신을 발효배지에 첨가하여 주어야 하는데, 이 경우 이소루이신의 가격이 고가이므로 원가상승 요인이 된다.

본 발명은 상기와 같은 문제점을 극복하기 위하여 이소루이신 리키(leaky)형 요구성주를 사용하여 발효배지내에 이소루이신을 첨가할 필요가 없으며, 라이신 합성의 중간 매체인 디아미노피메릭산 요구성주를 사용하지 않으면서도 종래의 균주들보다 발효법에 의해 고농도의 L-스레오닌을 생성할 수 있음을 특징으로 한다.

본 발명은 상술한 메치오닌 영양요구성, 고농도의 L-스레오닌 유사체내성을 지니며, 이소루이신 리키(leaky)형 요구성 균주를 사용한 점과 L-메치오닌 유사체내성 L-라이신 유사체내성 및 L-발리, L-이소루이신 유사체에 대하여 내성을 갖는 균주가 L-스레오닌의 생산성을 향상시킨다는 사실을 발견하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명을 좀더 구체적으로 설명하면 다음과 같다.

에스케리키아 콜리 야생형 균주(E.coli W3110)를 친주로 사용하여 포스페이트 완충액(pH 7.0) 혹은 시이트레이트 완충액(pH 5.5)에 10⁷-10⁸cells/ml로 현탁시키고 N-메칠-N'-니트로-N-니트로소구아니딘(이후 NTG라 칭함)을 최종농도가 100-500㎎/ℓ가 되도록 첨가하고 실온 혹은 33℃에서 10분에서 30분간 처리하여 인공돌연변이를 유발시킨 후, L-메치오닌 유사체들(DL-ethionine, norleucine, α-methylmethionine, L-methionine-D, L-sulphoximine)을 농도별(1-10g/ℓ)로 함유한 최소한천배지(배지4)에 도말하여 온도 25-37℃에서 2-5일간 배양하여 생육하는 메치오닌 유사체내성 군락(colony)들을 분리한 후 영양한천배지(배지5)에 스트리킹(streaking)하여 25-37℃에서 15-25시간 배양한 후 배지 6을 20ml씩 첨가한 250ml 삼각플라스크에 접종한 다음 250-300rpm, 25-37℃, 36-72시간 진탕배양한 후 발효액을 원심분리한 상등액을 HPLC 기기를 사용하여 L-스레오닌을 정량분석하여 L-스레오닌 생산균주(TF0143)를 선별하였다. TF0143을 영양배지(배지5)에서 대수기 중간단계까지 배양한 다음 0.1몰 마그네슘 설페이트용액에 10⁷-10⁸cells/ml로 현탁시키고 자외선을 30-150초간 조사하여 변이를 유발시킨 후 페니실린 G(최종농도 2000-8000units/ml) 또는 엠피실린(ampicillin)(최종농도 20-100㎎/ℓ)을 처리하여 0.1몰 마그네슘 설페이트 및 20% 슈크로오즈 용액으로 구성된 하이퍼토닉(hypertonic) 최소배지에서 집적(enrichment) 배양한 다음, 메치오닌첨가 최소한천배지에 적절히 희석한 후 도말하여 군락(colony)을 얻은 후에, 최소한천배지(배지1) 및 메치오닌 첨가 최소한천배지(배지2)에 리프리카(replica)하여 메치오닌 요구성주들을 선별한 후 상술한 방법으로 진탕배양한 후 정량분석하여 L-스레오닌 생산균주 TF0670을 분리하였다 TF0670으로부터 NTG를 사용하여 3차 인공돌연변이를 하여 저농도의 L-스레오닌 유사체들(α-아미노-β-히드록시 발레릭산(이후 AHV라 칭함) 및 DL-스레오닌 히드록사메이트)을 농도별(1-10g/ℓ)로 함유한 메치오닌 첨가 최소한천배지(배지4)에서 생육하는 L-스레오닌 유사체 내성균주들을 선별한 후 상기에서 서술한 방법으로 발효한 후 발효액을 HPLC를 사용하여 L-스레오닌을 정량분석하여 L-스레오닌 생산균주 TF1148을 선별한 다음 다시 NTG 처리하여 변이를 유발시킨 후 고농도의 L-스레오닌 유사체들 (15-30g/ℓ)에 대한 내성균주들을 선별한 후 플라스크 발효실험에서 L-스레오닌 우량 생산균주 TF1299를 선별하였다. 다시 이 균주(TF1299)를 자외선을 사용하여 5차 인공돌연변이 한 후 페니실린 G 또는 엠피실린을 사용하여 2회 집적배양한 다음 메치오닌 첨가 최소한 천배지(배지2)에서는 생육이 지연되나 메치오닌, 이소루이신 첨가 최소한천배지(배지3)에서는 잘 생육하는 이소루이신 리키(leaky)형 요구성 균주들을 구한 다음 플라스크에서 발효실험하여 L-스레오닌 우량 생산균주 TF2387를 선별한 후, NTG 처리하여 6차 인공돌연변이를 하여 L-라이신 유사체들(S-(2-아미노에칠)-L-시스테인(이후 AEC라 칭함) 및 r-메칠-L-라이신(이후 ML이라 칭함))을 농도별(1-10g/ℓ)로 함유한 메치오닌, 이소루이신 첨가 최소한천배지(배지4)에서 생육하는 L-라이신 유사체 내성 균주들을 구한후 플라스크에서 발효실험에서 L-스레오닌 우량 생성균주인 TF3057을 선별하였다. 다시 TF3057로부터 NTG 처리하여 돌연변이시킨 다음 L-발린, L-이소루이신의 유사체인 α-아미노 뷰티릭산(1-10g/ℓ)을 농도별로 첨가한 메치오닌, 이소루이신 첨가 최소한천배지에서 생육하는 α-아미노 뷰티릭산 내성주들을 구한 후 삼각플라스크에서 L-스레오닌 발효실험에서 L-스레오닌 생산성이 가장 우수한 에스케리키아 콜리 TF4076을 최종적으로 선별하였다.

(배지1)

최소배지(1L) : 포도당 5.0g, 인산제이나트륨 6.0g, 인산제일칼륨 3.0g, 염화나트륨 0.5g, 염화암모늄 1.0g, 황산마그네슘 0.5g, 염화칼슘, 0.01g, pH 7.0 필요에 따라 한천 18g 첨가함.

(배지 2)

메치오닌 첨가 최소배지(1L) : 배지 1의 최소배지에서 메치오닌 50-100㎎첨가한 배지, 필오에 따라 한천 18g을 첨가함.

(배지 3)

메치오닌, 이소루이신 첨가 최소배지(1L) : 배지 2에 이소루이신 25-50㎎ 첨가한 배지.

(배지 4)

유사체 내성주 선별용 최소배지(1L) : 영양요구 아미노산들을 첨가한 최소배지에 L-메치오닌 유사체들을 1-10g, 또는 L-스레오닌 유사체들을 1-30g, 또는 L-라이신 유사체들을 1-10g 또는 L-발린, L-이소루이신 유사체 α-아미노 뷰티릭산 1-10g를 막여과 제균하여 농도별로 첨가한 한천 평판배지.

(배지 5)

영양배지(1L) : 박토트립톤 10g, 박토효모엑기스 5g, 염화나트름 10g, 포도당 5g, 필요에 따라 한천 18g을 첨가함.

(배지 6)

플라스크 발효배지(1L) : 포도당 70g, 인산제일칼륨 1g, 황산암모늄 20g, 황산마그네슘 0.5g, 황산망간 5㎎, 황산철 5㎎, 효모엑기스 2g, 탄산칼슘 30g, pH 5.5-75, 필요한 경우 영양요구성 아미노산들을 50-300㎎ 첨가함.

(배지 7)

발효조 발효배지(1L) : 포도당 50g, 인산제일칼륨 2.0g, 황산암모늄 10g, 황산마그네슘 0.5g, 황산망간 5㎎, 황산철 5㎎, 효모엑기스 2g, 메치오닌 150㎎.

본 발명의 내용을 더 자세히 설명하면 영양요구성 돌연변이주를 선별할 때는 변이주 획득율을 증가시키기 위하여 페니실린 G(최종농도 2000-8000units/ml) 또는 엠피실린(ampicillin)(최종농도 20-100㎎/ℓ)농축법을 사용하여 농축한 후, 1) 메치오닌 영양요구성주를 선별할 경우, 최소한천배지(배지1)와 메치오닌 첨가 최소한천배지(배지 2)에, 2) 이소루이신 리키(leaky)형 요구성주를 선별할 경우, 메치오닌 첨가 최소한천배지와 메치오닌, 이소루이신 첨가 최소한천배지(배지3)에 리프리카(replica)하거나 각각 멸균된 이쑤시개로 접종하여 온도 25-37℃에서 2-5일간 배양하여 생육의 유무로서 영양요구성을 확인하였으며, 한천이 들어가지 않은 같은 조성의 액체 배지에 배양하여 생욱도를 야생균주와 비교하였다. 내성 변이주의 선별은, 돌연변이를 처리한 후 적당히 희석하여 각각의 아미노산 유사체를 함유하는 배지 4의 한천 평판배지에 도말하여 배양기내에서 25-37℃로 2-5일간 배양하여서 생성된 균주를 분리·정제하였으며 그 저항성을 확인하기 위하여 아미노산 유사체를 함유한 액체 시험관 배지에 접종하여 진탕배양후 생육의 차이를 탁도계를 사용하여 562nm에서 측정하였다. 변이처리하여 얻은 균주들을 호기적 조건(진탕배양 : 250-300rpm, 발효조의 경우는 0.5-1.0vvm의 통기) 및 pH 5.5-7.5, 25-37℃의 온도 조건하에서 배양하여 L-스레오닌을 제조하였으며 플라스크에서 배양하는 경우에는 36-72시간 후에 L-스레오닌이 배양액에 축적되었다. 또한 발효조에서 배양하는 경우에는 추가당을 공급하는 유가식 발효법으로 L-스레오닌을 제조하였으며, L-스레오닌의 농도는 HPLC로 정량 분석하였다.

본 발명의 상세한 내용은 아래의 실시예와 같다.

[실시예 1]

명세서에 언급된 야생주(E. coli W3110)를 사용하여 포스페이트 완충액(pH 7.0) 혹은 시이트레이트 완충액(pH 5.5)에 10⁷-10⁸cells/ml로 현탁시키고 N-메칠-N'-니트로-N-니트로소구아니딘을 최종농도가 100-500㎎/ℓ가 되도록 첨가하고 실온 혹은 33℃에서 10분에서 30분간 처리하여 돌연변이를 유발시키거나 또는 0.1몰 마그네슘 설페이트 용액에 10⁷-10⁸cells/ml로 현탁시키고 자외선을 30초 내지 150초간 조사하여 변이처리한 후 위에서 상술한 방법으로 영양요구성주 및 아미노산 유사체 내성주들을 구하여, 최종 표현형이 L-메치오닌 유사체내성, 메치오닌 영양요구성, L-스레오닌 유사체내성, 이소루이신 리키(leaky)형 요구성, L-라이신 유사체내성, L-발린, L-이소루이신 유사체인 α-아미노 뷰티릭산 내성(이후 ABA라 칭함)을 특징으로 하며, 동시에 L-스레오닌 생산성이 우수한 최종균주 TF4076을 선별하였으며, 인공돌연변이 과정중 개발된 균주들의 특성을 표 1에 명시하였다. 또 이 균주들중에서 아미노산 유사체 내성주들인 TF1299, TF3057 그리고 TF4076을 각각에 대한 대표적인 유사체인 DL-에치오닌, AHV, AEC 및 ABA를 농도별로 첨가한 액체 최소배지에서 생육도를 측정하여 표 2, 표 3, 표 4, 및 표 5에 각각 명시하였다.

* Met(메치오닌), Thr(스레오닌), AHV(α-아미노-β-히드록시 발레릭산), Ile(이소루이신), Lys(라이신), AEC(S-(2-아미노에칠)-L-시스테인), ML(δ-메칠-L-라이신)

[표 2]

* 상대 생육도는 배양액을 562nm에서 흡광도를 측정하여, DL-에치오닌 농도가 0일 때의 생육도를 100으로 기준하여 표시하였음.

[표 3]

* 상대 생육도는 배양액을 562nm에서 흡광도를 측정하여, AHV 첨가농도가 0일 때의 생육도를 100으로 기준하여 표시하였음.

[표 4]

* 상대 생육도는 배양액을 562nm에서 흡광도를 측정하여, AEC 첨가농도가 0일 때의 생육도를 100으로 기준하여 표시하였음.

[표 5]

* 상대 생육도는 배양액을 562nm에서 흡광도를 측정하여, ABA 첨가농도가 0일 때의 생육도를 100으로 기준하여 표시하였음.

[실시예 2]

명세서에 언급된 야생주(E. coli W3110)로부터 인공돌연변이 과정을 거치는 동안 선별되었던, TF0143, TF0670, TF1299, TF2387, TF3057, TF4076를 영양한천배지(배지5)에 접종하여 25-37℃에서 15-20시간 배양한 후 배지 6을 각각 20ml씩 분주한 250ml 삼각플라스크에 각 균주들을 한 백금이씩 접종하여 25-37℃, 배양 pH 5.5-7.5, 250-300rpm으로 36-72시간 진탕배양하였다. 이 발효액을 원심분한 상등액을 HPLC 분석기로 정량분석하여 L-스레오닌의 생성량에 표 6에 표시하였다.

[표 6]

[실시예 3]

에스케리키아 콜리 W3110(야생주)를 사용하여 명세서에 언급된 방법으로 돌연변이를 유발시켜서 L-스레오닌을 생성할 수 있으며 최종 표현형이 메치오닌 영양요구성, L-스레오닌 유사체 내성을 특징으로 하는 TF1173을 선별하였다. 에스케리키아 콜리 TF1173과 메치오닌 유사체 내성주로부터 선별된 에스케리키아 콜리 TF4076을 DL-메치오닌을 농도별로 함유한 배지 6의 배지에 접종하여 실시예 2에서 상술한 방법으로 진탕배양하여 L-스레오닌의 생성량을 표 7에 기재하였다.

[실시예 4]

에스케리키아 콜리 TF2387, TF3057 및 TF4076을 한천보존배지(배지5)로부터 한 백금이를 영양한천배지에 접종하여 25-37℃에서 15-20시간 배양기에서 배양한 후, 배지 5를 75ml씩 분주한 500ml 삼각플라스크에 한 백금이 식균하여 10시간 진탕배양한 후 식균량 5%를 5ℓ발효조에 접종하여 배양온도 33℃, 배양 pH 6.8으로 하면서 pH를 조절하기 위하여 28% 암노니아수를 공급, 통기량 1.0vvm으로 유지하면서 배지 7의 배지조성에서 당농도가 0.5-1.0%되면 당을 추가 공급하는 유기식으로 배양한 다음, 최종 배양액을 HPLC 분석기를 사용하여 L-스레오닌의 농도를 분석하여 표 8에 기재하였다.

Claims (5)

1. L-메치오닌 유사체에 대한 내성을 가지며, 메치오닌 영양요구성, L-스레오닌 유사체에 대한 내성, 이소루이신 리키형 요구성, L-라이신 유사체에 대한 내성 α-아미노 뷰티릭산 내성을 가지며, L-스레오닌을 생산할 수 있음을 특징으로 하는 에스케리키아 콜리(대장균)에 속하는 미생물.
2. 제1항에 있어서, 에스케리키아 콜리(대장균)에 속하는 미생물 KFCC 10718임을 특징으로 하는 에스케리키아 콜리(대장균)에 속하는 미생물.
3. 제1항에 있어서, L-메치오닌 유사체가 D,L-에치오닌 또는 노르루이신 또는 α-메칠메치오닌 또는 L-메치오닌-D,L-설폭시민임을 특징으로 하는 에스케리키아 콜리(대장균)에 속하는 미생물.
4. 제1항에 있어서, L-스레오닌 유사체가 α-아미노-β-히드록시 발레릭산 또는 DL-스레오닌 히드록사메이트임을 특징으로 하는 에스케리키아 콜리(대장균)에 속하는 미생물.
5. 제1항에 있어서, L-라이신 유사체가 S-(2-아미노에칠)-L-시스테인, 또는 δ-메칠-L-라이신임을 특징으로 하는 에스케리키아 콜리(대장균)에 속하는 미생물.