KR920005975B1 - 미생물에 의한 l-글루타민의 제조방법 - Google Patents

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Abstract

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Description

미생물에 의한 L-글루타민의 제조방법
본 발명은 L-로이신, L-시스테인 요구성을 갖고 동시에 설파구아니딘 내성을 가지며 알라닌에 의해 생육이 촉진되는 미생물을 이용한 발효법에 의한 L-글루타민 제조방법에 관한것이다.
L-글루타민은 아미노산의 일종으로써 영양제 및 소화기 궤양 치료제, 알콜중독치료제, 뇌기능개선제등의약용은 물론 최근에는 화장품의 기초원료로서 각광을 받고있는 물질이다.
지금까지 발효법에 의한 L-글루타민 제조방법은 상당수 공지되어있다.
그예로서 배지에 일정량 이상의 염소이온을 첨가하는 방법으로는 일본특허공보 소 46-42195호와, 배지에 항생물질 또는 계면활성제를 첨가하는 방법으로 일본특허공보소 51-16588호, 소 52-49065호등이, 설파제내성주를 이용한 방법으로 일본특허공보 소 49-815878호등이 있으며, L-로이신, L-알라닌 요구성 균주를 이용 L-글루타민을 축적시키는 방법으로 대한민국 특허공고 제83-1260호등이 잘 알려져 있다.
본 발명자들은 L-글루타민의 미생물에 의한 생산을 연구해오던중 생육에 로이신을 요구하고 L-알라닌에 의해 생육이 촉진되는 코리네박테리움 MWM-791012(KFCC-10032)를 친주로 변이처리하여 설파구아니딘 내성 및 L-시스테인 요구성이 부가된 고리네박테리움 MWM-891020(KFCC-10694)가 친주에 비해L-글루타민 생성능이 우수한것으로 나타나 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 새로운 균주의 분리방법은 코리네박테리움 MWM-79l012(KFCC-10032)를 통상의 변이처리,즉 자외선 조사나 화학변이 유기제인 NTG(N-메틸-N'-메틸-N-니트로소구아니딘), DES(디에틸설페이트)를 처리하고 최소 한천 평판배지에서 1차 변이주(MWM-890821)인 설파구아니딘 내성균주를 분리하였다.
내성균주의 분리용 배지의 조성은, 포도당 2%, 유안 1%, 제 1인산칼륨 0.1%, 제 2 인산칼륨 0.3%, 황산마그네슘 0.04%, 황산제 1 철 20㎍/ℓ, 티아민염산염 350㎍/ℓ 비오틴 50㎍/ℓ, 설파구아니딘 600㎍/㎖, L-로이신 50㎎/ℓ, L-알라닌 50㎎/l, 한천 2%, pH 7.0이다.
이와같은 방법으로 선별 분리한 본 발명의 1차변이주인 설파구아니딘 내성주 MWM-890821는 표 1에서 나타난 바와같이 친주인 MWM-791012(KFCC-10032)에 비해 강한 설파구아니딘 내성을 보였다.
[표 1]
설파구아니딘 첨가에 의한 균주의 생육도
Figure kpo00001
주(1) 생육도 : 배지(분리배지 이용)에서 72시간 진탕배양한 배양액을 희석 610nm에서 흡광도 측정
주(2) SGr: 설파구아니딘 내성(resistant),600㎍/㎖ 첨가
선별된 1차 변이주를 친주로 표 2에사 보는 바와 같이 다시 자외선 조사나 NTG등의 화화변이유기제를 처리하고 통상의 아미노산 요구성균주의 분리방법에 따라 2차변이주인 L-시스테인요구성 균주, 코리네박테리움 MWM-891020(KFCC-10694)를 분리하여 본 발명에 이용하있다.
[표 2]
변이처리 과정도
Figure kpo00002
* 2차 변이주인 MWM.-891020(KFCC-10694)의 균화적 성질은 변이처리전 친주인 MWM-791012(KFCC-10032)와 비교해본 결과 표 2에서 나타낸 바와같이 설파구아니딘 내성 및 L-시스테인 요구성만이 명확한 차이를 나타냄을 알수 있다.
내성 및 시스테인 요구성균주의 분리용 배지의 조성은, 포도망 10%, 염화암모늄 3%, 제1인산칼륨 1%,제2인산칼륨1%, 황산마그네슘500㎎/ℓ, 황산망간10㎎/ℓ, 티아민염산염1㎎/ℓ, 육즙0.5%, L-로이신50㎎/ℓ, L-알라닌 50㎎/ℓ, L-시스테인 50㎎/ℓ, pH 7.2, 탄산칼슘 5%(별도 멸균첨가)이다.
분리배지에서의 배양방법은 분리배지를 50㎖ 삼각후라스크에 5㎖ 분주하여 멸균한 후 변이처리한 균주를 접종하여 30℃에서 72시간 진탕배양하였으며, L-글루타민의 생성량은 페이퍼크로마토그래피 및 아미노산자동분석기를 이용 분석하였다.
2차 변이주인 MWM-891020(KFCC-10694)과 친주인 MWM-791012(KFCC-10032)의 L-시스테인첨가농도별 생육도 및 L-글루타민 생성량을 비교분석 해본 결과는 표 3에서 나타나는 바와같이 L-시스테인이 첨가된 경우 신균주는 친주에 비해 생육은 약간 저조하였으나 L-글루마민의 측척량이 크게 향상된것으로 나타났다.
[표 3]
L-시스테인 첨가에 의한 균주의 생육도 및 글루타민 축적량(㎎/㎖)
Figure kpo00003
주(1) 생육도 : 배지(분리배지 이용)에서 72시간 진탕배양한 배양액을 희석 610nm에서 흡광도 측정주
(2) Gln 축정량 : L-글루타민 축적량(㎎/㎖)
주(3) Cys-:시스테인 요구성
주(4) SGr: 설파구아니딘 내성(resistant),600㎍/㎖ 첨가
* 본 발명의 새로운 변이주가 현저하게 L-글루타민을 배양액내에 축적시키는 원인에 대해서 아직 이론적으로 명확히 밝혀지지 않았으나 L-글루타민 생합성의 특정한 효소 활성의 변화에 의한것으로 판단된다.
L-글루타민 발효의 배양조건은 탄소원으로써 포도당, 전분가수 분해물등이 사용 가능하며, 질소원으로서는 암모니아가스, 암모니아수, 염화암모늄, 유안, 요소, 인산암모늄등을 이용할 수 있으며, 그의 천연의 영양원과 무기금속염이 혼합된 배지면이 이용가능하다.
본 배양을 행함에 있어 발효조건은 다음과 같다.
통기량은 0.8-1.6VVM, 교반기 회전수는 400-600rpm으로 하며, 발효온도는 30℃ 내외에서 72-96시간 배양한다.
배양중 pH는 5.5-7.5로 암모니아수 또는 액화 암모니아를 이용 자동조절한다.
배양 완료액내에 축적된 L-글루타민은 통상의 방법에 따라 이온 교환수지에 흡착, 분리시켜 용리액을 얻고 여기에 에탄올을 처리 정제하여 L-글루타민 조결정을 얻는다.
이하 실시예에서 상세히 설명한다.
[실시예 1]
사용균주 : 코리네박테리움 MWM -891020(KFCC-10694)
종배지조성:
포도당 5%, 펩톤 1%, 효모엑기스 1%, 염화나트륨 0.25%, 요소 0.3%, 비오틴 30㎍/l, pH 7.0
발효배지조성:
포도당 10%, 염화암모늄 3.5%, 유안 2%, 콘스팁리커(C.S.L) 0,5%, 육즙(meat extract) 0.7%, 제1인산카리 0.2%, 황산마그네슘 300㎎/ℓ, 황산철 200㎎/ℓ, 황산망간 200㎎/ℓ, 황산아연 10㎎/ℓ, 티아민염산염 1㎎/ℓ, 요소 0.5%, L-로이신 50㎎/ℓ, L-알라닌 50㎎/ℓ, L-시스테인 50㎎/ℓ, 탄산칼슘 5%(별도 멸균 첨가) pH 7.2
배양방법 :
상기 종배지 50㎖을 500㎖ 진탕 후라스크에 분주하여 통상의 방법에 따라 가압 멸균한후 본 발명의 신균주 코리네박테리움 MWM-891020(KFCC-10694) 균주를 접종하여 30℃에서 24시간동안 진탕 배양한것을 종균 배양액으로 한다.
상기 발효배지 20㎖를 500㎖ 진탕 후라스크에 분주하여 120℃에서 15분간 가압 멸균하여 준비한 종균 배양액 2㎖를 접종한후 30℃에서 72시간동안 진탕 배양한다.
발효 종료후 배양액내의 L-글루타민 축적량은 54.2㎎/㎖였다.
[실시예 2]
실시예 1의 발효 배지에서 탄산칼슘 및 요소를 제의한 배지 2L을 5L 소형 발효조에 사입하고 종균배양액200㎖를 접종한다.
400rpm,1.5vvm의 조건으로 30℃에서 72시간 배양하고, 배양중 pH 조절은 액체암모니아로 5.5-7.5사이로 조절한다.
발효 완류후 배양액내 L-글루타민 축적량은 69.4㎎/㎖였다.
발효 완료액 1L을 여과하여 균체를 제거한후 통상의 방법에 따라 이온교환수지에 흡착, 분리정제하여 L-글루타민 조결정 58.9g을 얻었다.
[실시예 3]
실시예 2와 동일한 발효배지 16L를 사입하여 멸균한 30L 소형 발효조에 미리 준비한 종균배양액 1L를 접종하고 400rpm,1.0vvm의 조건으로 30℃에서 72시간 배양한다.
pH 조절은 액체암모니아로 5.5-7.5로 조절한다.
그의는 실시예 2와 동일하게 행한다. 발효 종료시 배양액내의 L-글루타민 축적량은 69.8㎎/㎖였다.

Claims (1)

  1. 미생물에 의한 L-글루타민을 제조함에 있어서 로이신, 시스테인 요구성을 갖는 동시에 설파구아니딘내성을 가지며 알라닌에 의해 생육이 촉진되는 균주인 코리네박테리움 MWM-891020(KFCC-10694)를 당질을 주원료로 하는 영양 배지에 호기적으로 배양하는 것을 특징으로 하는 미생물에 의한 L-글루타민의 제조방법.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN103667383A (zh) * 2013-12-24 2014-03-26 山东民强生物科技股份有限公司 L-谷氨酰胺的制备方法
JP2023521310A (ja) * 2020-03-30 2023-05-24 デサン・コーポレイション グルタミン生産能を向上させる形質転換用組換えベクターおよびこれを導入した菌株

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