KR910007856B1 - 미생물에 의한 l-글루타민의 제조방법 - Google Patents

Abstract

내용 없음.

Description

미생물에 의한 L-글루타민의 제조방법

본 발명은 발효법에 의한 L-글루타민을 제조할 때 L-로이신을 생육에 요구하며 L-알라닌에 의해서 생육이 촉진되는 L-글루타민 생산균주(KFCC-10032)를 변이처리하여 L-글루타민 아나로그물질인 O-디아조아세틸-L-세린(O-Diazoacety-L-serine, 이하 아자세린이라 함, 그림 1 참조) 내성균주를 분리 당류를 주원료로 하는 배지에 호기적으로 배양하여 다량의 L-글루타민을 배양액내에서 축적시켜 이를 회수 분리하는 신균주를 이용한 L-글루타민 제조방법에 관한 것이다.

L-글루타민은 아미노산의 일종으로써 영양제 및 소화기궤양치료제, 알콜중독치료제, 뇌기능개선제등의 원료 의약품의 일종이다.

종래의 발효법에 의한 L-글루타민의 제조방법은 일본 특허공보 소39-7391호에 글루타민산 생산균주를 과잉의 질소원이 함유되어 있는 배지에 배양하는 방법이, 일본 특허공보 소51-16588호에 항생물질 또는 계면활성제를 배양액내에 첨가하는 방법이, 또는 일본 특허공보 소49-81587호에 설파제 내성균주를 분리 배양하는 방법 및 대한민국 특허공보 81-2928은 L-로이신을 생육에 요구하며 L-알라닌에 의해서 생육이 촉진되는 균주를 이용하여 L-글루타민을 상업적으로 생산하는 방법등이 알려져 있다.

그러나 배양액내 축적되는 L-글루타민의 저해작용으로 더 많은 L-글루타민을 효율좋게 축적시키는 것에는 어려움이 있었다.

본 발명은 이러한 문제점을 해결하기 위하여 코리네박테리움속의 영양요구성 변이주(KFCC - 10032)에 L-글루타민 아나로그인, 아자세린에 내성을 가진 균주를 유도분리하여 배양한 결과 많은 량의 L-글루타민을 배양액내에 축적시키므로 본 발명을 완성하게 된 것이다.

구체적으로 설명하면 본 발명은 미생물에 의하여 L-글루타민을 제조할때에 생육에 L-로이신을 요구하여 L-알라닌에 의해 생육이 촉진되고 L-글루타민 아나로그물질인 아자세린에 내성을 갖는 KCTC 8468P(MWM-880817)를, 당질을 주원료로 하는 영양배지에 호기적으로 배양하여 배양액내에 다량의 L-글루타민을 축적시키는 것을 특징으로 하는 발명이다.

본 발명에 이용한 신균주의 분리방법은 공지의 코리네박테리움 MWM-791012(KFCC-10032)를 친주로 통상의 변이처리 즉, 자외선 조사를 하거나 NTG(N-메틸-N＇-메틸-N-니트로소구아니딘), DES(디에틸 설페이트)등의 화학변이유기제를 처리하여 페니실린 농축법이나 리플리카방법등으로 아자세린 내성균주를 분리배양한 결과 많은 량의 L-글루타민을 배양액내에 축적시키므로 본 발명의 신균주를 분리하여였다.

분리배지의 조성은 포도당 10%, 염화암모늄 3%, 제1인산칼리 1%, 제2인산칼리 1%, 황산마그네슘 500mg/ℓ, 황산망간 10mg/ℓ, 티아민 염산염 1mg/ℓ, 육즙 0.5%, L-로이신 500mg/ℓ, 알리닌 50mg/ℓ, 아자세린 100mg/ℓ, pH 7.2, 탄산칼슘 5%(별도 멸균첨가)이다.

분리배지에서의 배양방법은 상기 배지 5ml를 50ml 삼각 플라스크에 분주하여 분리한 변이주를 접종하여 온도 30℃에서 72시간 진탕배양시켰다.

이와 같은 방법으로 선별 분리한 본 발명 신균주의 균학적 성질을 조사한 결과는 다음에 상세히 기재하는 바와 같다.

실험 방법은 매뉴얼 오프 마이크로-바이올로지칼 메소드(Manual of Microbiological method ; H.J.Conn and M. W. Jennison, society of American bacteriologist, 1957)에 기재된 방법에 준하여 행하였다.

[현미경적 성상]

1) 형태 : 2연성, 단독 혹은 집합체로서 약간 타원형

2) 크기 : 0.6-1.2μ

3) 포자 : 없음

4) 운동성 : 없음

5) 편모 : 없음

6) 그람염색 : 양성

[배양학적 성질]

[가)한천사면]

1) 생육 : 중정도

2) 생육형태 : 섬유상

3) 광택 : 둔광

4) 색상 : 유백색-미황색

5) 상태 : 버터상 혹은 미점성

6) 배지색 : 변화없음

7) 냄새 : 없음

[나)한천배양 집락]

1) 형상 : 원형

2) 표면 : 평활

3) 주변 : 완전

4) 용기 : 중앙부분이 약간 부품

5) 색상 : 유백색-미황색

6) 배지색 : 변화없음

[다)한천천자 배양]

표면부에서만 생육함.

[라)액체배양]

1) 표면생육 : 때때로 시험관벽에 환상으로 생육

2) 탁도 : 약간의 탁도생성

3) 침사 : 유모성 침사

4) 향 : 없음

[생리학적 특성]

1) 생육온도 : 생육가능온도 20-42℃

2) 생육 최적온도 : 30℃내외

3) 생육 pH : 5.0-9.5

4) 최적 pH : 6.5-7.5

5) 산소요구성 : 호기성

6) 질산염환원성 : 양성

7) 유화수소생성 : 음성

8) 인돌형성 : 음성

9) 색소환원 : 메틸렌 부루 환원

10) 제라틴환원 : 음성 혹은 미약

11) 카제인소화 : 음성 혹은 극미

12) 메틸레드반응 : 미산성

13) 구연산소화성 : 음성

14) 리트머스밀크 : 변화없거나 약알카리

15) 카탈라아제 : 양성

16) 우레아제 : 양성

17) 전분액화성 : 음성

18) 글루타민 합성계효소(Glutamine Synthetase)의 활성이 극히 강함.

19) 유기산의 생성 : 포도당 배지에서 알파-케토글루탈산, 젖산이 미량 생성.

20) 당자화성

21) L-로이신과 L-알라닌이 첨가된 그래이와 타텀배지(Gray and Tatum medium)에서 아자세린 농도별 생육사항을 비교해본 결과(표1참조) 친주는 미약한 생육저해를 보이면서 L-글루타민 축적이 현저하게 떨어졌으나 본 발명의 신균주 KCTC 8468P(MWM-880817)는 아자세린이 첨가된 배지에서 친주보다 생육의 저해를 받지않으면서 배양액내 L-글루타민의 축적량이 중가하는 것으로 나타났다.

[표 1]

아자세린 농도별 균주생육 및 L-글루타민 생성비교표

주(1) 최소배지 : 그레이와 타텀배지의 변형 : 포도당 5%, 염화암모늄 0.5%, 질산암모늄 0.1%, 황산나트륨 0.2%, 황산마그네슘 0.01%, 제1인산칼리 0.1%, 제2인산칼리 0.3%, 비오틴 10γ/ℓ, 티아민 1mg/ℓ, L-로이신 50mg/ℓ, L-알라닌 30mg/ℓ, 미량원소 혼합액 1ml(미량원소 혼합액조성 : 소디움테트라보레이트 90mg, 암모니움 멜리보레이트 40mg, 염화철 1g, 황산아연 800mg, 등을 혼합하여 증류수 1L에 용해한 것)

생육도 : +++ : 생육양호 ++ : 생육보통

주(2) 실시예 1의 배지와 동일한 배지에서 배양함

표1에서 기재된 바와 같이 본 발명의 변이주 KCTC-8468P(MWM-880817)는 L-로이신 요구성 균주이고 L-알라닌에 의해 생육이 촉진되며 아자세린에 내성을 가진 한편 배양액내 L-글루타민을 다량으로 축적시키는 특성을 가지고 있다.

본 발명의 새로운 변이주가 다량의 L-글루타민을 배양액내에 축적시키는 원인에 대해서 아직 이론적으로 명확히 밝혀지지 않았으나 친주에 있어서는 다가 다른자리 입체성(Multivalent allost -eric)효소인 L-글루타민 합성효소가 배양액내에 축적된 L- 글루타민에 의해 L-글루타민 합성이 제어되었으나 본 발명의 균주는 L-글루타민 아나로그 물질인 아자세린에 내성을 갖게되어 L-글루타민 합성 제어기구의 일부가 해제되었기 때문인 것으로 판단된다.

본 발명에 사용한 발효배지로는 공업적으로 값싼 당질원료 즉, 포도당, 과당, 원당 및 전분가수분해물등이 이용가능하며 무기질소원으로 암모니아가스, 암모니아수, 염화암모늄, 유안, 요소, 인산암모늄등이 사용되고, 천연의 영양원으로 콘스팁리커(CLS) 육즙, 효모엑기스, 펩톤, 대두박분해물등이 사용가능하며, 무기염류는 황산마그네슘, 염화아연, 제1인산칼리, 제2인산칼리, 황산망간등을 혼합첨가한 배지면 이용가능하다.

배양방법은 온도 25-35℃, pH 5.5-7.5로 유지하면서 호기적으로 2-3일간 배양하며, 축적된 L-글루타민은 상법에 따라 이온교환수지에 흡착분리하여 용리액을 얻고 여기에 에탄올을 처리 정제하여 조결정을 얻는다.

이하 실험 방법은 실시예에서 상세히 기술한다.

[실시예 1]

사용균주 : 코리네박테리움 KCTC-8468P(MWM-880817)

종배지 : 포도당 5%, 펩톤 1%, 효모엑기스 1%, 염화나트륨 0.25%, 요소 0.3%, 비오틴 30γ/ℓ, pH 7.0

발효배지 : 포도당 5%, 염화암모늄 3.5%, 유안 2%, 콘스팁리커(CLS) 0.5%, 육즙 0.7%, 제1인산칼리 0.2%, 제2인산칼리 0.2%, 황산마그네슘 300mg/ℓ, 황산철 10mg/ℓ, 황산망간10mg/ℓ, 황산아연 10mg/ℓ, 티아민염산염1mg/ℓ, 요소 0.5%, pH 7.0, L-로이신 50mg/ℓ, L-알라닌 30mg/ℓ, 아자세린 100mg/ℓ, 탄산칼슘 5%(별도 멸균첨가), pH 7.2

배양방법 : 상기 종배지 50ml를 500ml 진탕플라스크에 분주하여 상법에 따라 가압멸균한 후 본 발명의 신균주 KCTC-8468P 균주를 접종하고 30℃에서 24시간동안 진탕배양하여 종균배양액으로 한다.

발효배지 20ml를 500ml 진탕 플라스크에 분주하고 120℃에서 10분간 가압 멸균한 후 미리 준비한 종균배양액을 2ml 접종하여 30℃에서 72시간 배양한다.

발효완료후 배양액내의 L-글루타민 축적량은 57.2mg/ml였다.

[실시예 2]

실시예 1의 발효배지에서 탄산칼슘을 제외한 배지 16L를 사입하여 멸균한 30L 소형 발효조에 미리 준비한 종균배양액을 1L 접종하고 400rpm, 1.0-1.5vvm의 조건으로 30℃에서 72시간 배양한다.

pH 조절은 암모니아수로 5.5-7.5으로 조절한다.

배양종료시 L-글루타민 축적량은 72.3mg/ml였다. 발효완료액 1L를 균체를 제거한 후 상법에 따라 이온교환수지에 흡착 분리하여 용리액을 얻고 이것을 농축처리 L-글루타민 조결정 60.2g을 얻었다.

[실시예 3]

실시예 2의 발효배지중 포도당 대신 원당을 포도당으로 10%되게 환산하여 첨가한 발효배지 16L를 30L 소형 발효조에 사입하여 120℃에서 15분간 멸균한다.

요기에 미리 준비한 종균배양액 1L를 접종하여 400rpm, 1.0-1.5vvm의 조건으로 30℃에서 72시간 배양한다.

그외 배양방법은 실시예 2와 동일하게 행한다. 발효 종료시 배양액내의 L-글루타민 축적량은 64. 8mg/ml였다.

[실시예 4]

실시예 2의 발효배지중 포도당 대신 전분가수분해물을 포도당으로 10%되게 환산하여 첨가한 발효배지 16L를 30L 소형 발효조에 사입하여 120℃에서 15분간 멸균한다.

여기에 미리 준비한 종균배양액 1L를 접종하여 400rpm, 1.0-1.5vvm의 조건으로 30℃에서 72시간 배양한다.

그외 배양방법은 실시예 2와 동일하게 행한다.

발효종료시 배양액내의 L-글루타민 축적량은 69.5mg/ml였다.

Claims (1)

1. 미생물에 의해 L-글루타민을 제조함에 있어서 생육에 L-로이신을 요구하며 L-알라닌에 의해 생육이 촉진되며 아자세린 내성을 가진 코리네박테리움속의 변이주 KCTC-8648P(MWM-880817)를, 당질을 주원료로 하는 영양배지에 호기적으로 배양하여 배양액내에 다량의 L-글루타민을 축적시키는 것을 특징으로 하는 발효에 의한 L-글루타민의 제조방법.