KR0134840B1 - 발효에 의한 l-쓰레오닌의 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 발효에 의한 L-쓰레오닌의 제조방법에 관한 것으로 더욱 자세하게는 쎄라티아(Serratia)속의 L-쓰레오닌 생산 균주의 변이주를 호기적으로 배양하여 다량의 L-쓰레오닌을 제조하는 방법에 관한 것으로 종래의 L-쓰레오닌 제조방법에 비하여 본발명의 균주는 100-500μg/ml의 L-시스테인 첨가에 의해 다량의 L-쓰레오닌을 배양액내에 축적함으로 공업화에 유용한 L-쓰레인 제조방법이다.

Description

발효에 의한 L-쓰레오닌의 제조방법

본 발명은 발효에 의한 L-쓰레오닌의 제조방법에 관한 것으로 더욱 자세하게는 쎄라티아(Serratia)속의 L-쓰레오닌 생산 균주의 변이주를 호기적으로 배양하여 다량의 L-쓰레오닌을 제조하는 방법에 관한 것이다.

L-쓰레오닌은 필수아미노산의 일종으로 쌀의 제 2 제한아미노산이며 강화제로서 중요하다. 현재는 주로 아미노산수액용, 종합아미노산제제, 식품의 영양강화제등의 용도에 사용되어지고 있으며, 최근 사료 첨가제로 수요의 증가가 예상되는 아미노산이다.

지금까지 발효법에 의한 L-쓰레오닌의 제조방법은 상당수 공지되어 있다. 그 예로서 프로비덴시아(Providen cia)속의 메사이오닌 대사길항물질에 내성을 갖는 균주를 이용하는 방법으로 일본 특허공보 소 61-216698호와 이 균주를 이용하여 유전자재조합 디엔에이를 삽입, 생산성을 증가시킨 방법으로는 일본 특허공보 평 1-289493호가 있으며, 코리네박테리움(Corynebacterium)계통의 균주를 이용, 벡터를 형성하고 여기에 대장균에서 유래한 L-쓰레오닌 생합성 유전자를 재조합하여 L-쓰레오닌을 생산하는 방법으로는 일본 특허공보 소 63-237793호 등이 있다. 또한, 대장균(Escherichia)을 이용 쓰레오닌 대사길항물질에 내성을 갖고, 생육중 메사이오닌이나 디아미노피멜릭 산(Diaminopimelic acid)의 요구성을 가지는 균주를 이용하는 방법으로 일본 특허공보 소 56-10037호, L-세린과 에사이오닌에 내성을 가지는 균주를 이용하는 방법은 유럽특허 91103569,9호에 , 메시이오닌 대사 길항물질에 대한 내성을 가진 쎄라티아균주를 이용한 방법으로는 일본 특허공보 소 56-134993호가 알려져 있다.

본 발명자등은 상기 종래의 균주외에 아미노산 생산 능력을 가지며 특히 L-쓰레오닌 생성수율이 높은 신균주를 선별하기 위해 서울근교를 비롯 각지의 토양(논,밭,산,도로),퇴비, 하천, 육제품, 해산물등으로 부터 순수분리하고 분리된 각 균주에대하여 아미노산 생산능을 조사하여 L-쓰레오닌 생산능이 있는 쎄라티아속 SW9405를 분리하고, 이 분리균주를 친주로 하여 통상의 변이처리방법에 의하여 각종요구주와 아날로그물질 내성주를 분리, 이들 변이주에 의한 L-쓰레오닌의 발효 생산 방법을 연구한 결과생육에 AEC 시스테인을요구하고,동시에에내성이있는신균주SW9410(KFCC-10848)이 배양배지내에 다량의 L-쓰레오닌을 축적한다는 사실을 발견하고 본 발명을 완성하게 된것이다.

본 발명을 더욱 상세히 설명하면, 본 발명에 사용된 신균주의 분리방법은 각 시료 1g을 살균주에 현탁하여 1백금이를 분리용 액체배지에 접종하여 30℃에서 2-3일간 배양한후 한천완전평판 배지상에서 순수분리한 각 균주중 L-쓰레오닌 생산능력이 있는 쎄라티아속 SW9405를 통상적인 변이처리제 즉 자외선, NTG(N-Methyl -N'-nitrosoguanidine)등 화학변이 유기제등을 처리하여 완전한천평판배지에 도말하고 30℃에서 3-5일간 배양하였다. 그리고,완전한천평판배지상에서 생육되는 콜로니들을 AEC및 각종의 아미노산이 첨가된 최소한천평판배지상에 페르리카하여 1-2일간 배양한후 변이주를 선별하였다.

신균주의 분리용 액체배지조성은 효모엑기스 1.0%, 펩톤 1.0%, 육즙 0.%, 염화나트륨 0.5%, 포도당 0.5%, pH7.0이며, 완전한천평판배지는 분리용 액체배지조성에 한천을 2%첨가한 것을사용하였다. 또한, 변이주선별을 위한 최소한천평판배지 조성은 슈크로스 0.5%, 유안 0.2%, 제 1인산칼륨 0.1%, 황산마그네슘 0.02%, 한천 2%, pH 7.3이며,영양요구성및 내성확인을 위하여 각 아미노산(100-300μg/ml) 및 AEC(5-10mM)를 별도로 첨가하였다.

이와같은 방법으로 선별분리한 본 발명의 신균주 SW9410(KFCC-10848)의 균학적 성질을 조사하여 본 결과는 다음에 상세히 기재하는 바와같다.

1.현미경적 성상

1) 형태: 단간균,2) 크기: 0.5-0.8×0.9×2.0 μm, 3) 포자: 없음, 4)운동성: 있음,5)그림염색: 음성 2.배양학적 성질

가. 한천사면

1)생육: 중정도, 2)색조:미황색, 3)광택: 둔광, 4)상태: 크림상, 5)배지색:변화없음, 6)냄새: 특징없음

나. 한천배양집락

1)형상: 원형, 2)표면: 메끄러움, 3)색상: 미황색, 4)융기: 중앙부분에 약간 풀어오름, 5)주변: 완전, 6)배지색: 변화없음

다.액체배양

1)표면생육: 없음, 2)탁도: 있음, 3)침사:없음, 4)배지색: 변화없음

3.생리학적 성질

1)생육온도: 25-35℃, 2)생육최적온도:30℃내외, 3)생육 pH:5.0-9.5, 4)최적 pH:6.5-7.5, 5)산소요구성: 호기성, 6)질산환원성: 양성, 7)카타라제: 양성, 8)우레아제: 양성, 9)옥시다제: 음성, 10)베타갈락토시다제: 양성, 11)디에이제합성: 양성, 12)구연산소화성:양성, 13)글루콘산소화성: 양성, 14)말로네이트소화성: 음성,15)MR반응: 음성, 16)VP반응: 양성, 17) 인돌형성: 음성, 18)유화수소생성: 양성, 19)젤라틴환원: 양성, 20)적색세포생성: 양성, 21) 당류발효성: 글루코오스 +, 크실로스 ±, 슈크로스 +, 말토스 +, 아라비노노스 -, 락토스 -, 만니톨 +, 솔비톨 +, 살리신 +, 이노시톨 ±, 트레할로스 +, 아도니톨 ±, 에스큐린 -.

상기와 같은 균학적 성질을 갖는 본 발명의 신균주르 버지스메뉴얼(Bergey's Manual of Determinative Bacteriology) 8판을 이용하여 분류 동정해 본 결과 쎄라티아(Serratia)속에 속하는 것을 알게되어 쎄라티아 SW 9410이라 명명하였다.

이와같은 방법으로 선별 분리한 본 발명의 신균주인 SW 9410(KFCC-10848)은 친주와는 달리 생육에 시스테인을 요구하며(표 1),친주인 SW9405에 비해 강한 AEC 내성을 보였다. (표 2) 즉, 본발명의 신균주인 SW9410은 생육에 시스테인을 요구하고, 동시에 AEC에 내성이 있는 변이주임을 알수 있다.

이와같은 성질을 갖는 본발명의 신균주를 친주인 SW9405와 L-시스테인 첨가농도별 생육및 L-쓰레오닌 생성량을 비교 분석해본 결과는 표 3에 기재된 것과 같이 친주의 경우 별다른 변화를 보이지 않았으나, 신균주의 경우 100-500μg/ml의 L-시스테인 첨가에 의해 L-쓰레오닌의 축적량이 향상되는 것으로 나타났다.

주(1): 생산배지(후기 실시예 1참조)에서 72시간 진탕배양한 배양종료액을 희석 660nm에서 흡광도(베크만 DU-70)측정

주(2): 배양종료액내의 L-쓰레오닌 축적량으로 페이퍼크로마토그라피 또는 아미노산 자동분석기(히다찌 L-8500A)를 이용 분석

주(3): 시스테인은 L-시스테인 대신 L-시스테인염산염으로 대체하여도 동일한 결과를 보임

본 발명의 신균주가 현저하게 L-쓰레오닌을 배양액내에 축적시키는 원인에 대하여 아직 이론적으로 명확히 밝혀지지는 않았으나 L-라이신 안로그물질인 AEC에 내성을 가져 L-쓰레오닌 생합성경로상 L-라이신에 의한 저해원인이 해제된 것과 동시에 균생육에 요구아미노산인 시스테인이 작용하는 것으로 판단된다.

L-쓰레오닌 발효의 배양조건은 탄소원으로써 포도당, 원당, 페당밀 등이 사용가능하며, 질소원으로서는 암모니아가스, 암모니아수, 요소, 유안, 염화암모늄, 인산암모늄 등을 이용할수 있으며, 그외 천연의 영양원과 무기금속염이 혼합된 배지면 이용가능하다.

본 배양을 행함에 있어 배양관리 조건은 다음과 같다.

발효온도는 30℃내외에서 통기량 0.8-1.5vvm, 교반기 회전수 400-600rpm으로 3-5일간 배양한다. 배양중 pH는 6.5-7.5로 암모니아수 또는 액화암모니아를 이용 자동조절한다.

배양 완료액내에 축적된 L-쓰레오닌은 통상의 방법에 따라 이온교환수지에 흡착, 분리시켜 용리액을 얻고 여기에 에탄올 등을 처리하여 L-쓰레오닌 조정을 얻는다.

이하 본 발명을 실시예에서 상세히 설명하지만 이에 한정하는 것은 아니다.

[실시예 1]

사용균주: 신균주 쎄라티아 속 SW9410 (KFCC-10848)

전배양배지조성: 포도당 0.5%, 효모엑기스 1.0%, 펩톤 1.0%, 염화나트륨 0.5%,육즙 0.3%,pH7.0

생산배지조성: 슈크로스 10%, 옥수수침지액 3%, 비오틴 50γ, 제이인산칼륨 0.1%, 황산 제일철 2mg/L, 황산망간 2mg/L, 유안 0.5%, L-시스테인 300μg/ml, 탄산칼슘 5%(별도 멸균첨가), pH 7.0

전배양 방법: 18ψX 185mm의 시험관에 각각 5ml의 전배양 배지를 분주하고121℃에서 15분간 가압 살균한다. 냉각후 신균주 SW9410(KFCC-10848)을 각각 일백금이 접종하여 30℃에서 20시간 분당 120회 왕복 진탕배양한 것을 전배양액으로한다.

생산 배양 방법: 500ml 사카구찌 플라스크에 각각 70ml의 쓰레오닌 생산 배지를 분주하고 121℃에서 15분간 가압 살균한다. 냉각후 신균주 SW9410의 전배양액을 1% 접종하여, 30℃에서 72시간 분당 120회 왕복 진탕 배양한다.

발효 종료 후 배양액내의 L-쓰레오닌 축적량은 13.7mg/ml였다.

[실시예 2]

사용균주: 신균주 쎄리티아 속 SW9410(KFCC-10848)

1차 전배양 배지조성: 실시예1의 전배양배지와 동일

2차 전배양 배지조성: 슈크로스 10%, 옥수수침지액 3%, 비오틴 100γ, 제이인산칼륨 0.1%, 황산 제일철 2mg/L, 황산망간 2mg/L, 유안 0.5%, L-시스테인 200μg/ml, 탄산칼슘 5%(별도 멸균첨가), pH 7.0

생산배지조성:슈크로스 10%, 옥수수침지액 3%, 비오틴 50γ, 제이인산칼륨 0.1%, 황산 제일철 2mg/L, 황산망간 2mg/L, 유안 0.5%, L-시스테인 300μg/ml, pH 7.0

추가당배지조성: 슈크로스 50%, 옥수수침지액 3%,유안 0.2%, L-시스테인 300μg/ml, 대두단백분해물 1%

전배양방법: 500ml 사카구찌 플라스크에 각각 50ml의 2차전 배양배지를 분주하고 121℃에서 15분간 가압 살균한다. 실시예 1.과 동일한 방법으로 준비된 1차전 배양액 1%를 냉각된 2차전 배양배지에 접종한후 20℃에서 24시간 분당 120회 왕복 진탕 배양한것을 2차전 배양액으로 한다.

생산 배양 방법: 생산배지를 5L, 소형발효조에 2L 사입하고, 121℃에서 15분간 가압 살균한다. 냉각후 종배양액을 2.0%접종하고, 교반 600rpm, 통기 1vvm의 조건으로 30℃에서 72시간 배양한다. 배양간 배양액 내의 당이 전부소모되는 시점에서 추가당을배양액내의 당농도가 3%되게 추가하고 pH조절은 암모니아수로써 6.5-7.5로 조절한다.

발효종료후 배양액내의 L-쓰레오닌의 축적량은 26.8mg/ml였다.

발효종료액 1L를 균체를 제거한 후 통상의 방법에 따라 이온 교환수지에 흡착, 분리, 정제하여 L-쓰레오닌 조결정 24.1g을 얻었다.

[실시예 3]

사용균주: 신균주 쎄라티아 속 SW9410(KFCC-10848)

생산 배양 방법: 실시예2.의 생산배지중 슈크로스 대신 페당밀을 포도당으로 환산하여 첨가하고 비오틴을 제외한 배지 2L를 5L소형발효조에 사입하여 실시예 2.와 동일한 배양방법으로 배양한다. 발효종료후 배양액내의 L-쓰레오닌의 축적량은 24.8mg/ml였다.

이상과 같이 본발명에 따른 신균주 쎄라티아 속 SW9410(KFCC-10848)을 이용한 발효에 의한 L-쓰레오닌의 제조방법은 다량의 L-쓰레오닌을 배양액내에 축적함으로 L-쓰레오닌 제조에 유용한 방법이다.

Claims (3)

1. 미생물에 의한 L-쓰레오닌의 생산에 있어서, 시스테인의 요구와 동시에 AEC (S-2-Aminoethyl -L -cysteine)에 내성을 갖는 쎄라티이(Serratia)속 SW9410(KFCC-10848)을 이용하여 L-쓰레오닌의 제조함을 특징으로 하는 발효에 의한 L-쓰레오닌의 제조방법.
2. 제1항에 있어서, 당질 특히 슈크로스,페당밀을 주원료로 하고, 배양간 추가당액을 배양액내의 당농도가 3-5%되게 추가하는 것을 특징으로 하는 발효에 의한 L-쓰레오닌의 제조방법.
3. 제1항또는 제2항에 있어서, 시스테인을 100-500μg/ml되게 첨가하여 배양함을 특징으로 하는 발효에 의한 L-쓰레오닌의 제조방법.