KR100270510B1

KR100270510B1 - 신규 미생물 및 이를 이용한 엘- 쓰레오닌의 제조방법

Info

Publication number: KR100270510B1
Application number: KR1019980032951A
Authority: KR
Inventors: 한재춘; 최영길; 박상태; 최인석; 임병락; 임번삼
Original assignee: 고두모; 대상주식회사
Priority date: 1998-08-14
Filing date: 1998-08-14
Publication date: 2000-11-01
Also published as: KR20000013853A; WO2000009660A1; ZA9810327B

Abstract

본 발명은 미생물의 발효에 의한 L-쓰레오닌(L-threonine)을 제조함에 있어서, L-메치오닌(methionine), L-이소로이신(isoleucine)을 동시에 요구하는 에스케리차(Escherichia)속의 미생물중, 알파메칠세린(α-methyl serine)에 내성과 플로로피루베이트(fluoropyruvate)에 대한 감수성과 디아미노석신산(diaminosuccinic acid)에 내성을 나타내는 균주를 이용하여 L-쓰레오닌과 L-글루타민산(L-glutamic acid)에 대한 내성을 갖는 변이주를 분리하여 글루코스 등의 당류를 탄소원으로 호기적 배양에 의한 L-쓰레오닌을 발효액 내에 축적하는 방법에 관한 것이다.

Description

[발명의 명칭]

신규 미생물 및 이를 이용한 L-쓰레오닌의 제조방법

[발명의 상세한 설명]

[발명의 목적]

[발명이 속하는 기술분야 및 그 분야의 종래기술]

L-쓰레오닌은 필수 아미노산의 일종으로서 쌀의 제 2 제한 아미노산이다. 지금까지 알려진 바로는 아미노산 수액제제, 종합아미노산제제의 의약용도와 식품의 영양강화제나 건강음료 등의 용도로 사용되고 있다. 최근에는 L-라이신과 함께 사료에 첨가되고 있으므로 그 수요가 급증하고 있는 아미노산중의 하나이다.

지금까지 알려진 발효법에 의한 L-쓰레오닌의 제조방법은 상당수 공지되어 있는데 대표적인 것은 세라티아속(Serratia sp) L-쓰레오닌 생산균으로부터 아스파르토 키나제, 호모세린 키나제, 호모세린 디하이드로 게나제, 쓰레오닌 신타제의 유전정보를 함유한 DNA절편을 재조합하여 다량의 쓰레오닌을 생산하는 방법(일본특허공보 평5-10076호)와 프로비덴시아(Providencia sp)속에 속하고 메치오닌 대사 길항물질에 내성을 가지는 균주를 이용해 유전자를 재조합한 DNA를 삽입하여 생산성을 증가시킨 방법(일본특허공보 평1-289493호)이 있다.

또한 에스케리차(Escherichia)를 이용하여 쓰레오닌 대사길항 물질에 내성을 가지고 생육중 메치오닌이나 디아미노피멜릭산(Diamnopimelic acid)의 요구성을 가지는 균주를 이용하는 방법(일본특허공보 소56-10037호), L-세린과 에사이오닌에 내성을 가지는 균주를 이용하는 방법(유럽특허 91103569.9호)등이 알려져 있다.

[발명이 이루고자 하는 기술적 과제]

본 발명은 쓰레오닌을 생산하는 미생물의 생육적특성을 변화시켜 쓰레오닌 발효시 목적 생산물인 L-쓰레오닌 또는 미지의 발효부산물인 유기산 및 타아미노산에 대한 내삼투압을 강화하여 L-쓰레오닌 생산성을 향상시킬 수 있는 미생물과 이를 이용한 L-쓰레오닌 제조방법을 제공하는데 그 목적이 있다.

[발명의 구성 및 작용]

본 발명자 등은 공시균주 에스케리차 (Escherichia)속의 미생물 KCCM 10133을 통상의 방법에 의한 배양시 배양후반에 L-쓰레오닌 및 미지의 발효부산물 축적에 의해 L-쓰레오닌의 생산성이 저조한 문제를 해결하기 위하여 연구하던중 L-쓰레오닌의 내성과 L-글루타민산에 내성을 동시에 갖는 변이주가 친주에 비하여 다량의 L-쓰레오닌이 발효액내에 축적된다는 사실을 발견함에 따라 본 발명을 완성하게 된 것이다.

본 발명에 이용한 균주의 분리방법은 L-쓰레오닌 생산능이 있는 공시균주 에스케리차 (Escherichia)속의 미생물 KCCM 10133을 친주로하여 통상의 변이처리방법에 의해 친주보다 L-쓰레오닌과 L-글루타민산의 첨가시 균의 생육이 양호한 즉, L-쓰레오닌과 L-글루타민산에 내성을 나타내는 균주 DSM9807(KCCM-10132)을 유도하였다. 이 분리주를 이용하여 통상적인 방법으로 미생물을 배양할 때 친주에 비하여 다량의 L-쓰레오닌이 발효액내에 축적된다는 사실을 발견함에 따라 본 발명을 완성하게 된 것이다. 본 발명에 대하여 보다 상세히 설명하면 다음과 같다.

본 발명의 친주인 에스케리차 속의 미생물 DSM 9806(KCCM-10133)을 통상적인 변이처리방법, 즉 자외선 조사나 화학변이유기제인 NTG(N-메틸-N'-니트로-N-니트로소 구아니딘), DES(디에틸설페이트)로 처리하여 얻어진 콜로니를 L-쓰레오닌이 7% 함유된 완전 한천 평판배지에 도말하여 생육하는 균주를 선별하고, 선별된 균주를 상기와 같이 재 변이처리하여 L-쓰레오닌 생합성 경로상의 중간물질인 L-글루타민산 240mM이 첨가되어 있는 완전 한천 평판배지에 도말하고 37℃에서 2-3일간 배양하였다. 그리고 이 평판배지상에서 생육하는 콜로니들을 분리하여 L-쓰레오닌 7%와 L-글루타민산 240mM을 첨가한 배지와 첨가하지 않는 2종류의 최소 한천 평판배지에 각각 레플리카하여 균주특성변화를 확인하였다. 이와 같은 방법으로 L-쓰레오닌과 L-글루타민산에 내성을 갖는 변이주중 특성이 명확한 신규주 DSM9807(KCCM-10132)을 분리하였다.

이들 변이주의 선별을 위한 완전 액체 배지조성은 효모엑기스 1.0%, 펩톤 1.0%, 육즙 0.3%, 염화나트륨 0.5%, 포도당 0.5%, pH 7.0이며, 완전 한천 평판배지는 완전 액체 배지조성에 한천을 2% 첨가한 것을 사용하였다.

친주 및 본 발명의 신균주인 DSM9807(KCCM-10132)의 특성 변화를 확인하기 위한 최소 한천 평판배지조성은 글루코스 1.0%, 유안 0.2%, 제1인산칼륨 0.1%, 황산 마그네슘 0.02%, 한천 2%, 디아미노피멜릭산(diaminopimelic acid) 100㎎/L, pH 7.3이며, 영양요구성을 확인하기 위해서는 L-메치오닌 200㎎/L과 L-이소로이신 200㎎/L을 각각 첨가하였다.

이와 같은 방법으로 분리하여 명명한 신균주 DSM9807 (KCCM 10132)은 표 1. 2에 나타난 바와 같이 0 -7.0%의 L-쓰레오닌과 0-270mM의 L-글루타민산 농도에서 명확히 내성을 가지고 있으며 친주의 특성인 L-메치오닌과 L-이소로이신의 요구성 및 알파메칠세린의 내성, 플로로피루베이트의 감수성, 디아미노석신산 내성을 그대로 유지하고 있는 것으로 판명되었다.

이와 같은 성질을 가지는 신균주 DSM9807(KCCM 10132)과 친주 KCCM 10133 균주를 L-쓰레오닌 생산배지(실시예1과 동일)를 이용하여 L-글루타민산 첨가농도별생육 및 L-쓰레오닌의 생산성을 비교 분석한 결과는 표3과 같다. 본 발명의 신균주는 동일한 조건에서 친주인 KCCM 10133 보다 다량의 L-쓰레오닌을 발효액내에 축적 시키는 것으로 나타났다.

본 발명의 신균주가 친주에 비하여 현저하게 L-쓰레오닌을 발효액내에 축적시키는 원인에 대하여 확실하게 밝혀지지는 않았으나 L-쓰레오닌의 내성과 L-글루타민산의 내성증가에 의해 생육 및 생산성이 증가된 원인은 발효액내에 축적된 L-쓰레오닌의 피드백 저해나 억제가 해제되었을 것으로 추정되며 발효액내에 축적된 목적 생산물인 L-쓰레오닌과 발효 부산물에 대하여 L-글루타민산이 삼투보호제로 작용하였을 것으로 추정된다.

L-쓰레오닌 발효의 발효조건은 탄소원으로써 포도당, 원당 분해액 등이 사용가능하며, 질소원으로서는 암모니아가스, 암모니아수, 요소, 유안, 염화암모늄, 인산암모늄 등을 이용할 수 있으며 그외 천연의 영양원과 무기금속염이 혼합된 배지는 이용이 가능하다.

발효조를 이용한 쓰레오닌 발효에 있어서 발효조건은 다음과 같다. 발효온도 30℃ 내외에서 통기량을 0.8-1.5vvm, 교반기 회전수는 600-700rpm으로 3-4일간 발효를 한다. 발효중 pH는 6.5-7.0로 암모니아수 또는 액화 암모니아를 이용 자동조절한다. 발효 종료후 발효액내에 축적된 L-쓰레오닌은 통상의 방법에 따라 이온교환수지에 흡착, 분리시켜 용리액을 얻고 여기에 에탄올을 처리하여 L-쓰레오닌 조결정을 얻는다.

다음의 실시예는 본 발명을 보다 상세히 설명하기 위한 것으로 이들 실시예가 본 발명의 기술적범위를 한정하는 것은 아니다.

[실시예 1]

* 사용균주 : 신균주 DSM9807(KCCM 10132)

* 전배양배지 조성 :

포도당 0.5%, 효모엑기스 1.0%, 펩톤 1.0%, 염화나트륨 0.5%, 육즙 0.3%, pH 7.0

* 생산배지 조성 :

포도당 10%, 옥수수침지액 3%, 제이인산 칼륨 0.1%, 황산제일철 2㎎/L, 황산 망간 2㎎/L, 유안 0.5%, L-메치오닌 200㎎/L, L-이소로이신 200㎎/L, 탄산칼슘 5%(별도 멸균 첨가), pH 7.0

* 전 배양 방법 :

18Φ×185mm의 시험관에 각각 5㎖의 전배양 배지를 분주한 후 121℃에서 15분간 가압 살균한다. 냉각후에 신균주 DSM9807(KCCM -10132)을 일백금니 접종하여 30℃에서 20시간, 분당 120회 왕복 진탕배양한 것을 전배양액으로 한다.

* 생산배양 방법 :

500ml 사카구찌 플라스크에 각각 70ml 정도의 쓰레오닌를 분주하고 121℃에서 15분간 가압 살균한다. 냉각 한 후 신균주 DSM9807(KCCM-10132)을 전배양액을 1%접종하여, 30℃에서 72시간, 분당 120회 왕복 진탕 배양한다. 발효 종료후 배양액내의 L-쓰레오닌의 축적량은 19.60㎎/㎖이었다. 또한 상기예와 같은 방법으로 변이처리전의 친주(KCCM10133)를 사용한 결과 L-쓰레오닌의 축적량은 16.57㎎/㎖이었다.

[실시예 2]

* 사용균주 : 신균주 DSM 9807(KCCM-10132)

* 1차 전배양 배지조성 : 실시예1의 전배양 배지와 동일

* 2차 전배양 배지조성 :

글루코스 2%, 옥수수침지액 3%, 제이인산칼륨 0.1%, 황산제일철 2㎖/L, 황산 망간 2㎖/L, 유안 0.05%, 요소 0.6%, L-메치오닌200㎎/L, L-이소로이신 200㎎/L, pH7.0

* 생산배지 조성 :

포도당 10%, 옥수수 침지액 3%, 제이인산 칼륨 0.1%, 황산제일철 2㎎/L, 황산 망간 2㎎/L, 유안 0.05%, 요소 0.6%, L-메치오닌 200㎎/L, L-이소로이신 200㎎/L, pH 7.0

* 전 배양 방법 :

실시예 1과 동등한 방법으로 배양된 1차 전배양액을 50㎖의 2차 전배양 배지가 121℃에서 15분간 멸균되어 냉각된 50㎖ 사카구찌 플라스크에 1% 접종한다. 접종후 30℃에서 24시간 분당 120회 왕복 진탕배양한 것을 2차 전배양액으로 한다.

* 생산 배양 방법 :

생산배지를 5L 소형 발효조에 2L사입하고 121℃에서 15분간 가압살균한다. 냉각후 2차 전배양액을 2% 접종하고, 교반 550rpm, 통기 0.8-1.5vvm의 조건으로 30℃에서 72시간 배양한다. 이때 추가당은 당농도가 1-3%를 유지할 수 있도록 추가하고, pH조절은 암모니아수로서 6.5-7.0로 유지시킨다. 발효 종료후 배양액내의 L-쓰레오닌의 축적량은 95.60㎎/㎖이었다. 또한 상기예와 같은 방법으로 변이처리전의 친주(KCCM10133)를 사용한 발효 종료후 배양액의 L-쓰레오닌의 축적량은 74.14㎎/ml 이었다.

발효 종료액 1L를 원심분리법으로 균체를 제거한 후 이온교환 수지에 흡착, 분리, 정제한 L-쓰레오닌의 결정은 신균주 DSM9807 (KCCM-10132)는 78.46㎎/㎖이고, 친주 (KCCM10133)는 63.02㎎/㎖이었다.

[발명의 효과]

본 발명은 공시균주 에스케리차 속의 미생물 DSM 9806(KCCM-10133)을 변이 처리하여 L-쓰레오닌의 내성과 L-글루타민산에 내성을 갖는 신균주 (KFCC 10132)로 L-쓰레오닌의 생산성을 크게 향상시킨 발명으로 L-쓰레오닌을 생산하는 일반적인 에스케리차 속의 미생물 및 친주 DSM 9806(KCCM-10133)의 경우 L-쓰레오닌 발효공정의 후반에 나타나는 L-쓰레오닌 및 유기산 과 타아미노산 등의 발효부산물 축적에 의해 L-쓰레오닌의 생산성을 저해하는 현상이 있었으나 본 발명의 신균주는 L-쓰레오닌과 삼투보호제로 알려진 L-글루타민산에 대한 내성증가에 의해 생육 및 L-쓰레오닌의 생산성을 크게 향상시켰다.

Claims

L-쓰레오닌을 생산할 수 있는 신규 미생물 에스케리차 콜리 DSM 9807 (KCCM-10132, 98.7.16 한국종균협회 기탁).
미생물 발효에 의한 L-쓰레오닌의 생산에 있어서, L-메치오닌과 L-이소로이신을 요구하는 동시에 플로로피루베이트에 대한 감수성, 알파메칠세린과 디아미노석신산에 내성을 가진 에스케리차(Escherichia)속 미생물을 이용하여 L-쓰레오닌과 L-글루타민산에 대한 내성을 부여하여 L-쓰레오닌을 제조함을 특징으로 하는 발효에 의한 L-쓰레오닌의 제조방법.
제 2 항에 있어서, L-메치오닌, L-이소로이신 요구성을 유지하고 플로로피루베이트에 대한 감수성과 알파메칠세린, 디아미노석신산, L-쓰레오닌 및 L-글루타민산에 대하여 내성을 나타내는 에스케리차(Escherichia)속 미생물 DSM9807 (KCCM10132, 98.7.16 한국종균협회 기탁)을 이용하여 L-쓰레오닌을 제조함을 특징으로 하는 발효에 의한 L-쓰레오닌의 제조방법.