KR0144641B1

KR0144641B1 - 발효에 의한 l-로이신의 제조방법

Info

Publication number: KR0144641B1
Application number: KR1019940035557A
Authority: KR
Inventors: 한재춘; 전준현; 유영수
Original assignee: 이삼우; 주식회사세원
Priority date: 1994-12-21
Filing date: 1994-12-21
Publication date: 1998-07-15
Also published as: KR960023071A

Abstract

본발명은 발효에 의한 L-로이신의 제조방법으로 더욱 자세하게는 L- 이소로이신 및 L-시스테인 요구 변이주의 호기적 배양에 의해 L-로이신을 제조하는 방법에 관한 것으로 L-로이신 생산에 이용해 오던 L-이소로이신 요구주인 코리네박테리움 속 동아 MS-03178(KFCC-10011)을 친주로 하여 통상의 변이처리방법에 의하여 획득한 변이주중 L-이소로이신 및 L-시스테인을 동시에 요구하는 변이주인 코리네박테리움 동아 MS-03381(KCTC-8508P)를 당류를 주원료로 하는 배지에서 호기적으로 배양하여 L-로이신을 배지내에 축적시켜 L-로이신을 제조하는 방법으로 본 변이주가 다량의 L-로이신을 배지내에 축적시킴으로 수율이 양호하여 공업화에 유용한 L-로이신의 제조방법이다.

Description

발효에 의한 L-로이신의 제조방법

본발명은 발효에 의한 L-로이신의 제조방법으로 더욱 자세하게는 L-이소로이신 및 L-시스테인 요구 변이주의 호기적 배양에 의해 L-로이신을 제조하는 방법에 관한 것이다.

L-로이신은 측쇄에 메칠기를 함유하는 필수 아미노산의 일종으로서 의약품의 아미노산 수용액, 종합아미노산 제제와 식품 첨가물 등으로 이용되고 있으며, 최근에는 액정 또는 폐유 분해제의 원료 및 첨가제로서 사용되고 있는 물질이다.

지금까지 알려진 상업적인 L-로이신의 제조방법은 소맥 글루텐외 여러 가지 식물성 단백질의 가수분해물로 부터의 추출법이 주로 채용되고 있으나, 미생물을 이용한 발효적 생산방법은 세라치아 말세슨스의 L-이소로이신 요구성 균주를 이용하는 방법(일본특허 소화 47-26313), 슈도모나스속, 아그로박테리움속, 대장균속, 바실러스속 등을 1종 혹은 2종의 균주를 혼합하여 배양하는 방법(일본특허 소화 52-64486), L-이소로이신, L-쓰레오닌, L-메치왼을 생육인자로 요구하는 새로운 변이주를 이용하는 방법(미국특허 149640), 초산을 주원료로 하는 배지에 S-(β-아미노에틸)-L-씨스테인 내성균주를 이용하는 방법(일본특허 소화 51-37347), L-로이신 생산균주 배양시 산소의 공급을 조절하므로서 L-로이신을 배양액내에 축적시키는 방법(일본특허 소화 57-798), 배지중의 당농도를 유지하면서 발효시간을 연장시키는 반연속식 발효공법을 이용한 L-로이신의 생산방법(대한민국 특허 공고 제 83-2485)등이 알려져 있다.

본발명자등은 상기 종래의 방법외에 L-로이신생산에 양호한 균주를 탐색하던중 본발명자 등이 L-로이신의 생산에 이용해 오던 L-이소로이신 요구주인 코리네박테리움속 동아 MS-03178(KFCC-10011)을 친주로 하여 통상의 변이처리방법에 의하여 획득한 변이주중 L-이소로이신 및 L-시스테인을 동시에 생육인자로 필요로 하는 변이주 동아 MS-03381(KCTC-8508P)을 분리하고, 일정농도의 L-이소로이신 및 L-시스테인이 첨가된 발효배지에서 배양할 경우 다량의 L-로이신이 축적되는 사실을 발견함에 따라 본 발명을 완성하게 된 것이다.

본발명에 대해 자세히 설명하면, 본발명의 친주인 코리네박테리움속 동아 MS-03178(KFCC-10011)균주를 통상의 변이처리 방법, 즉 자외선 조사나 화학 변이유기제인 NTG(N-메칠-N'-니트로-N-니트로소구아니딘), DES(디에칠설페이트)를 처리하여 한천완전배지에 도말하고 30℃에서 2~3일간 배양하였다. 그리고 한전완전배지상에서 생육되는 콜로니들을 각종의 아미노산을 첨가한 최소한천평판배지와 첨가하지 않은 최소한천평판배지상에 레플리카하여 1~2일간 배양한 후 L-시스테인이 첨가된 최소한천평판배지상에서만 생육이 가능한 균주를 선별함으로서 L-시스테인요구성 변이주들을 분리하였다.

완전평판배지의 조성은 폴리펩톤 1%, 육즙 1%, 효모엑기스 0.5%, 염화나트륨 0.5%, pH 7.0 이며 최소평판배지의 조성은 글루코스 1%, 제1인산칼륨 0.1%, 유안 0.7%, 황산마그네슘 0.05%, 황산 제 1철 0.001%, 비오틴 50㎍/L, 요소 0.2%, pH 7.2인 것은 사용하였으며, 한천배지의 경우 각각 한천을 2% 되게 첨가하여 사용하였다.

주(1): - ; 생육불가, + ; 생육저조, ++ ; 생육보통, +++ ; 생육양호

이들 변이주중 상기의 표 1에서 나타난 바와같이 명확한 L-이소로이신 및 L-시스테인을 동시에 요구하는 변이주 MS-03381(KCTC-8508P)를 선별, 분리하였다. 이와같은 방법으로 선별, 분리한 본발명의 신균주를 L-시스테인 첨가 농도별 생육 및 L-로이신의 축적량을 비교, 분석해본 결과는 다음의 표 2에 나타낸 바와 같다.

주(1) : 생산배지에 첨가한 L-시스테인의 첨가량(㎍/㎖)

주(2) : 생산 배지(후기 실시예 1 참조)에서 72시간 진탕배양한 배양종료액을 희석 610nm에서 흡광도(베크만 DU-70) 측정

주(3) : 배양종료액내의 L-로이신 축적량으로 아미노산분석기(히다찌 L-8500A)를 이용분석(㎍/㎖)

본발명의 변이주 코리네박테리움 동아 MS-03381(KCTC-8508P)은 친주인 코리네박테리움 동아 MS-03178(KFCC-10011)보다 많은량의 L-로이신을 배양액내에 축적시키는 것으로 나타났으며, L-시스테인의 첨가범위는 100~500㎍/㎖, 최적 첨가농도는 300㎍/㎖ 이었다.

본발명에 이용한 변이주 코리네박테리움속 동아 MS-03381(KCTC-8508P)의 요구물질인 L-시스테인과 L-이소로이신이 L-로이신의 생합성작용을 촉진시키는 상세한 기작은 알수 없으나, 배양액중의 포도당을 이용하여 목적 생산물인 L-로이신을 생합성할 때 L-로이신은 L-이소로이신과 생합성 경로와 대시조절이 관련되어 있어 L-이소로이신을 요구하는 본발명의 변이주 코리네박테리움속 동아 MS-03381(KCTC-8508P)은 L-이소로이신 합성 과정이 차단, 전반적인 반응의 흐름이 L-로이신 생합성 경로로 유도되는 것에 기인하는 것으로 판단되며, L-시스테인은 동일 경로상에 직접적으로 관여하는 아미노산은 아니나 부생아미노산으로 생성되던 L-시스테인으로서의 대사경로가 차단되거나 흐름이 약화되는 반면 L-로이신으로의 축적이 촉진되는 것으로 추정할 수 있다.

L-로이신의 배지조건은 탄소원으로서는 포도당, 원당, 전분가수분해물 등의 이용이 가능하며, 질소원으로서는 암모니아 가스, 암모니아수, 염화암모늄, 암모늄아세테이트, 유안, 요소, 인산암모늄, 옥수수침지액 등을 이용할수 있으며, 그외 천연의 영양원과 무기금속염이 혼합된 배지를 이용하였다.

배양방법으로는 온도 30±1℃에서 pH를 6.8~7.0로 유지시키면서 통기량 0.5~1.0vvm의 조건하에서 48~72시간 배양한다.

이하 실시예에서 상세히 설명한다.

[실시예 1]

사용균주 : 코리네박테리움속 동아 MS-03381(KCTC-8508P)

전배양배지조성 : 포도당 6.0%, 효모엑기스 0.5%, 폴리텝톤 0.1%, 염화나트륨 0.25%, 육즙 0.5%, 요소 0.4%, 비오틴 50㎍/L, 옥수수침지액( C.S.L) 0.6%, pH 7.2(멸균전)

생산배지조성 : 포도당 12%, 암모늄아세테이트 0.3%, 황산암모늄 2.0%, 육즙 1.0%, 황산제일철 0.001%, 비오틴 300㎍/L, 제이인산칼륨 0.1%, 치아민염산염 2㎎/L, 황산마그네슘 0.4%, 염화나트륨 0.2%, L-이소로이신 500㎍/㎖, L-시스테인 300㎍/㎖, 탄산칼슘(별도 멸균 첨가)5%, 소포제 적당량, pH 7.0 (멸균전)

배양방법 : 상기와 같은 배지조성을 가진 종배지를 500㎖ 진탕후라스크에 50㎖씩 분주하여 멸균, 냉각한후 본발명의 변이주 MS-03381(KCTC-8508P)을 1백금이 접종하여 진탕배양한 것을 종배양액으로 한다. 상기 L-로이신 생산배지 300㎖를 1L 삼각후라스크에 분주한 후 멸균, 냉각하여 준비한 종균배양액 12㎖를 접종한후 30℃에서 72시간 분당 120회전의 속도로 진탕배양한 결과 배양종료시의 L-로이신의 축적량은 42.1㎎/㎖였다.

[실시예 2]

실시예 1의 발효배지에서 탄산칼슘을 제외한 모든 배지를 5L 소형발효조에 2L 사입한 후 멸균, 냉각하여 준비한다. 여기에 미리 준비한 종균 배양액 80㎖를 접종하고 pH는 암모니아수를 이용하여 6.8~7.0 으로 자동조절하고 교반 600rpm, 통기 1vvm의 조건으로 30℃에서 48시간 배양한 결과 배양 종료시의 L-로이신의 축적량은 49.3㎎/㎖ 였다.

L-이소로이신 및 L-시스테인을 동시에 요구하는 변이주인 코리네박테리움 동아 MS-03381(KCTC-8508P)를 당류를 주원료로 하는 배지에서 호기적으로 배양하여 L-로이신을 배지내에 축적시켜 L-로이신을 제조하는 본발명은 본 변이주가 다량의 L-로이신을 배지내에 축적시킴으로 수율이 양호하여 공업화에 유용한 L-로이신의 제조방법이다.

Claims

발효에 의한 L-로이신을 제조함에 있어서, 생육에 L-이소로이신 및 L-시스테인을 동시에 요구하는 변이주인 코리네박테리움속 동아 MS-03381(KCTC-8508P)를 이용하여 L-로이신을 제조함을 특징으로 하는 발효에 의한 L-로이신의 제조방법.
제1항에 있어서, 변이주인 코리네박테리움속 동아 MS-03381(KCTC-8508P)를 당질을 주원료로 하는 발효배지에서 호기적으로 배양함을 특징으로 하는 발효에 의한 L-로이신의 제조방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 발효배지에 L-이소로이신을 500㎍/㎖, L-시스테인을 100~500㎍/㎖ 첨가함을 특징으로 하는 발효에 의한 L-로이신의 제조방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, pH를 6.8~7.0 으로 유지시킴을 특징으로 하는 발효에 의한 L-로이신의 제조방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 통기량을 0.5~1.0vvm으로 유지하면서 배양함을 특징으로 하는 L-로이신의 제조방법.