KR100397420B1

KR100397420B1 - 글루콘산에 대한 자화성이 증가된 ｌ-라이신을 생산하는신규 코리네박테리움 글루타미컴 및 그를 이용한ｌ-라이신의 생산방법

Info

Publication number: KR100397420B1
Application number: KR10-2001-0002371A
Authority: KR
Inventors: 이경한; 김성준; 임상조; 장기창
Original assignee: 씨제이 주식회사
Priority date: 2001-01-16
Filing date: 2001-01-16
Publication date: 2003-09-13
Also published as: KR20020061133A

Abstract

본 발명은 글루콘산에 대한 자화성이 증가됨을 특징으로 하는, L-라이신을 생산하는 코리네박테리움 글루타미컴(Corynebacterium glutamicum) 및 그를 배양하여 그 배양물로부터 L-라이신을 생산하는 방법에 관한 것으로서, 본 발명에 따르면 L-라이신의 발효농도 및 수율을 향상시켜 L-라이신의 생산에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

글루콘산에 대한 자화성이 증가된 Ｌ-라이신을 생산하는 신규 코리네박테리움 글루타미컴 및 그를 이용한 Ｌ-라이신의 생산방법{Novel Corynebacterium glutamicum producing L-lysine which has high assimilation of gluconic acid and process for producing L-lysine using the same}

본 발명은 글루콘산에 대한 자화성이 증가됨을 특징으로 하는 L-라이신을 생산하는 신규 코리네박테리움 글루타미컴(Corynebacterium glutamicum) 및 그를 이용하여 L-라이신을 생산하는 방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 대한민국 특허출원 제 98-39305 호(1998년 9월 22일 출원)에 따른 코리네박테리움 글루타미컴 KFCC 11043으로부터 유래되고, 글루콘산에 대한 고자화성 성질을 갖는 균주를 이용하여 L-라이신의 생산성을 증가시키는 방법에 관한 것이다.

L-라이신은 메치오닌, 스레오닌, 트립토판과 함께 필수아미노산의 일종으로 가축의 사료첨가제, 식품첨가제, 의약원료 등으로 사용되고 있다. 특히 L-라이신의 경우 함량이 적은 가축의 곡류사료에 첨가함으로써 사료효율을 향상시킬 수 있으며 최근 가축 분뇨에서의 질소, 인 성분을 규제하려는 움직임에 따라 그 수요가 더욱 증가하고 있다. L-라이신의 사료첨가제로서의 시장규모는 1998년에 약 50여만톤에 이르고 있으며 년평균 12 - 15 % 의 지속적인 수요증대가 기대되고 있다. 따라서 L-라이신 생산 균주의 개발 또는 발효공정 개선에 의한 L-라이신의 생산성 향상은 큰 경제적 효과를 가져올 수 있다.

현재까지 L-라이신의 생산방법으로는 생합성 전구물질(예: α-아미노아디프산, α-케토아디프산)을 가하여 대사시키는 방법, 변이주를 사용하는 2단법(디아미노피멜릭산(diaminopimelic acid)을 통한 생산법), 효소에 의한 생산법(DL-α-아미노카프로락탐의 전환) 및 고전적 돌연변이 방법을 통해 개량된 미생물을 이용하는 직접 발효법 등이 알려져 있으며, 그 중에서도 개량된 미생물을 사용하는 직접발효법이 주축을 이루고 있다.

L-라이신을 생산하는 미생물에 대한 특허는 대한 민국 특허공고 79-1782, 81-1746 및 92-7402, 일본특허공개 평10-165180, 평5-111386, 평4-166092등에 기술되어 있는데, 종래에는 인공돌연변이법에 의해 아미노산 요구성, 아미노산 유사체에 대한 내성, 항생제등에 대한 내성등을 부여한 균주가 주를 이루고 있다. 그러나, 상기한 고전적 돌연변이 방법의 경우 계속된 돌연변이로 인해 배양시간이 길어져 발효생산성이 떨어지는 문제점이 있으며, 연구자가 원하는 특정 대사부분 이외의 다른 곳에도 돌연변이가 일어날 가능성을 배제할 수가 없었다.

따라서 최근에는 세포융합법, 유전자재조합법 등의 유전공학기술이 비약적으로 발전함에 따라 연구자가 특정의 유전자를 생산 균주내에서 증폭하거나 제거시키는 것이 가능하게 되어 목적산물이 효율적으로 생산되도록 대사 경로를 변형시키는 방법이 균주개량에 많이 이용되고 있으며 실제 트립토판 등의 아미노산이 재조합 미생물 균주를 이용하여 생산되고 있다.

코리네박테리아의 경우에도 이러한 유전자 재조합기술들이 여러 측면에서 라이신 생산균주의 개발에 이용되고 있다. 라이신의 생산성 향상을 위해서는 라이신 생합성에 관련된 효소들을 증폭시키는 방법과 라이신 생합성에 이용되는 전구체들을 생산하는 데 관련된 효소들을 증폭시키는 방법이 여러 연구자들에 의해서 수행되었다. 이러한 연구들 중 대표적인 것으로 포스포에놀피루베이트(PEP)와 피루브산(Pyruvate)로부터 옥살로아세테이트(OAA)를 합성하는데 관련된 포스포에놀피루베이트 카르복실라아제와 피루브산 카르복실라아제에 관한 연구를 들 수 있다. 그러나, 포스포에놀피루베이트 카르복실라아제는 OAA의 주공급원으로 생각되어왔으나 라이신 생산에 중요하지 않은 것으로 밝혀졌다(FEMS Microbiol Lett(1993) 112:269-274). 또한 이외에 PEP로부터 OAA로의 탄소흐름을 증가시키기 위한 여러 가지 시도가 있었으나 라이신 생산에 별다른 영향을 주지 못했다(Appl Environ Microbiol(1991) 57:1746-1752, Appl Environ Microbiol(1994) 60:2494-2500, Biotecnol Prog(1994) 10:320-326). 이러한 사실들로부터 특정산물의 생산에 직접적으로 연결된 대사경로만이 병목부위라는 가정은 잘못된 것임을 알 수 있다.

한편 Stephanopoulos등은(Biotechnol Bioeng(1992) 39:565-574) 높은 라이신 생산속도하에서 CO₂의 배출량도 증가하는 것으로부터 라이신생산에 있어 HMP(hexose monophosphate)경로가 중요함을 시사한 바가 있으며,¹³C-NMR 분석을 통하여 해당 과정경로(Glycolysis)보다 HMP경로로의 탄소흐름이 더 높은 경우에 라이신생산이우수하다는 여러 보고가 있었다(Agric Biol Chem(1986) 50:2453-2459, J Gen Appl Microbiol(1991) 37:157-165, Biotechnol Bioeng 49:111-129). 또한 탄소원으로서 글루코오스와 글루콘산을 동시에 배지에 투여할 경우 라이신의 생산효율이 20 % 정도 향상된 결과를 얻었다는 보고(Appl Microbiol Biotechnol(1998) 49:9-15)도 HMP경로의 중요성을 말해주고 있다. 그러나, 아직까지 HMP경로를 인위적으로 강화시킨 미생물을 이용하여 L-라이신을 생산하는 방법은 개발되지 않고 있다.

이에, 본 발명자들은 글루콘산이 세포내에서 해당경로를 통하지 않고 곧바로 HMP경로로 유입되므로 글루콘산을 모균주에 비해서 고효율로 이용할 수 있는 미생물은 HMP경로가 강화되었을 것이라는 점에 착안하여, 코리네박테리움 글루타미컴(Corynebacterium glutamicum)을 모균주로 하여 글루콘산에 대한 자화성이 증가됨을 특징으로 하는 변이주를 개발하였으며, 실험결과 개발된 변이주가 기존에 전혀 공지된 바 없는 신규한 균주로서 L-라이신을 고효율로 생산함을 확인하고 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

따라서, 본 발명의 목적은 HMP경로를 강화시키기 위하여 글루콘산에 대한 자화성을 증가시킨 것을 특징으로 하는 L-라이신을 생산하는 신규 코리네박테리움 글루타미컴(Corynebacterium glutamicum) 균주를 제공하는 것이다.

본 발명에 의한 신균주는 아래의 몇가지 점에서 라이신 생산에 유용하게 사용될 수 있다. 첫째, 글루콘산은 포스포트랜스퍼라아제 시스템(PTS) 을 통하지 않고 퍼미아제에 의해서 세포내로 유입되므로 라이신 생합성의 중간체인 PEP의 소모가 모균주에 비하여 적으며, 둘째, HMP경로가 강화되면 라이신 생합성반응에서 에너지원으로 사용되는 NADPH의 생산을 높일 수 있으며, 셋째, 글루콘산에의 자화성을 높이면 탄소원으로서 원당, 포도당등의 원료외에 글루콘산도 사용할 수 있으므로 원재료값의 변동에 신축적으로 대처할 수 있는 장점이 있게 된다.

또한, 본 발명의 또 다른 목적은 상기 글루콘산에 대한 자화성이 증가됨을 특징으로 하는 신규 코리네박테리움 글루타미컴(Corynebacterium glutamicum) 주를 배양하여 그 배양물로부터 L-라이신을 고효율로 생산하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 코리네박테리움 글루타미컴 (Corynebacterium glutamicum) 종에 속하고 L-라이신 생산성을 갖는 미생물을 모균주로 하여 유도되고, 글루콘산 함유 최소배지에서 모균주 대비 높은 성장도를 갖는 균주를 선별함으로써 수득되는 글루콘산에 대한 자화성을 증가시킨 것을 특징으로 하는 L-라이신 고생산성 코리네박테리움 글루타미컴(Corynebacterium glutamicum) 균주를 제공한다.

보다 구체적으로, 본 발명은 대한민국 특허출원 제 98-39305 호에 공시된 바 있는 코리네박테리움 글루타미컴 KFCC 11043을 모균주로 하여 글루콘산에 대한 자화성이 증가됨을 특징으로 하는 코리네박테리움 글루타미컴(Corynebacterium glutamicum) CJG-18 (기탁번호 제 KFCC-11245 호)에 관한 것이며, 이 균주는 기존에 전혀 공지된 바 없는 신규한 균주로서 L-라이신 생산효율이 모균주에 비해 월등히 우수함을 확인할 수 있다(표2 참조).

본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 L-라이신 생산성을 갖는 코리네박테리움 글루타미컴 (Corynebacterium glutamicum) 을 모균주로 하여 유도되고 글루콘산에 대한 자화성을 증가시킨 것을 특징으로 하는 코리네박테리움 글루타미컴(Corynebacterium glutamicum) 균주를 배지중에 배양하고, 그 배양물중에 L-라이신을 축적시켜, 이 배양물로부터 L-라이신을 채취하는 것을 특징으로 하는 L-라이신의 제조방법을 제공한다.

보다 구체적으로, 본 발명은 글루콘산에 대한 자화성이 증가됨을 특징으로 하는, L-라이신을 생산하는 코리네박테리움 글루타미컴(Corynebacterium glutamicum) CJG-18 (기탁번호 제 KFCC- 11245 호)을 직접발효법으로 배양하여 그 배양물로부터 L-라이신을 생산하는 방법에 관한 것으로서, 본 발명에 따르면 L-라이신의 발효농도 및 수율을 향상시켜 L-라이신의 생산에 유용하게 사용될 수 있다.

이하 본 발명을 더욱 상세히 설명하면 다음과 같다.

본 발명에 따른 L-라이신을 고효율로 생산하기 위한 변이주는 코리네박테리움 글루타미컴(Corynebacterium glutamicum)종에 속하고, 글루콘산에 대한 자화성이 증가된 것을 특징으로 하며, L-라이신 생산성을 갖는 미생물이면 어떤 것이라도 좋다. 이와 같은 변이주는 코리네박테리움 글루타미컴 종에 속하고 L-라이신 생산성을 가진 미생물을 모균주로 하여 인공돌연변이에 의해 유도할 수가 있다.

본 발명에서 모균주로서 사용될 수 있는 균주는, 예컨대 대한민국 특허출원 제 98-39305 호에 공시된 바 있는 코리네박테리움 글루타미컴 KFCC 11043 을 들 수있다. 상기 코리네박테리움 글루타미컴 KFCC 11043 주는 L-라이신의 생합성 경로에 있어서 중요한 대사조절 부위인 아스파토키나아제에 대한 L-라이신과 L-트레오닌의 피드백 저해가 해제되고 호모세린 디하이드로게나제에 대한 트레오닌의 저해만 지속되는, 라이신 유사체인 S-(β-아미노에틸)-L-시스테인에 대한 내성을 갖는 균주이므로, L-라이신 생산에 적합한 균주이다.

본 발명에서는 글루콘산에 대한 고자화성을 갖는 코리네박테리움 글루타미컴 변이주를 수득하기 위하여, 상기 L-라이신 생산성을 갖는 코리네박테리움 글루타미컴 KFCC 11043을 모균주로 하여 이를 인공돌연변이시켜 글루콘산만을 탄소원으로서 포함한 최소배지에서 모균주에 비해 성장속도가 빠른 변이주를 획득하고자 하였다.

인공돌연변이 유발원으로는 자외선 조사, N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘(NTG) 또는 아질산 등에 의한 화학처리를 들 수 있으나, 바람직하게는 본 발명에서는 알킬화제의 일종인 N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘(N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine: NTG)을 10⁷∼10⁸세포/㎖에 대하여 최종농도 1,000 ㎍/㎖으로 약 5 분간 처리하였다. NTG는 생체내에서 분해되어 산성 조건에서는 아질산(nitrous acid)으로, 알칼리성 조건에서는 디아조메탄으로 각각 전환되며 DNA 단편의 부정확한 복제를 일으킴으로써 돌연변이를 유발하게 된다.

그런 후 글루콘산에 고자화성을 갖는 균주를 개발하기 위하여 글루콘산 함유 최소배지에서 모균주에 비해 빨리 성장하는 변이주를 선별하였으며, 삼각플라스크 역가실험을 통하여 L-라이신 발효성을 시험해 본 결과, 그 변이주가 모균주인 KFCC 11043에 비하여 라이신 생산효율이 우수함을 확인하였다.

따라서 상기 변이주를 코리네박테리움 글루타미컴 CJG-18 이라고 명명하고, 이 변이주를 2000년 12 월 6 일자로 사단법인 한국종균협회에 기탁하고, 기탁번호 제 KFCC-11245 호를 부여받았다.

본 발명에 따른 변이주에 의한 L-라이신의 생산은 통상 사용되는 미생물의 배양법으로 실시가능하다. 사용배지로서는 탄소원, 질소원, 무기물, 기타 사용균주가 필요로 하는 미량의 영양소를 알맞게 함유하는 것이며 합성배지 또는 천연배지 어는 것이라도 사용가능하다. 배양종료후에는, 배양액으로부터 균체를 제거하고 얻어진 청징액으로부터 농축결정화 처리, 활성탄 처리 또는 이온교환수지 처리 등의 공지의 정제방법을 사용하여 L-라이신을 단리 채취할 수 있다.

본 발명에 따른 코리네박테리움 글루타미컴 CJG-18을 개발하기 위한 과정을 상술하면 하기 실시예와 같다.

[실시예]

이하의 실험에서 변이주 선별을 위한 최소배지로는 하기의 한천 최소배지를 사용하였고, 선별된 변이주의 평가를 위한 배지로는 하기의 플라스크 발효배지를 사용하였다. L-라이신의 농도는 HPLC(High Performance Liquid Chromatography)로 측정하였고, 당량은 필요한 경우 버트란트(Bertrand)법을 사용하여 정량하였다.

글루콘산 한천 최소배지

글루콘산 10g, (NH₄)₂SO₄2g, 요소 2g, KH₂PO₄1.0g, K₂HPO₄3.0g, MgSO₄·7H₂O 0.5g, FeSO₄·7H₂O 10mg, MnSO₄·5H₂O 10mg, 바이오틴 100㎍, 티아민·HCl 100㎍,CaCl₂·2H₂O 0.1g, Na₂B₄O₇·10H₂O 80㎍, (NH₄)₆MoO₂₇·4H₂O 40㎍, ZnSO₄·7H₂O 10㎍, CuSO₄·7H₂O 300㎍, MnCl₂·4H₂O 10㎍, FeCl₃·6H₂O 1mg, 한천 20g, 증류수 1리터당 (pH 7.0(살균전)).

플라스크 발효배지

당밀(환원당으로서) 100g, 효모엑기스 4g, (NH₄)₂SO₄40g, 요소 4g, KH₂PO₄1g, NaCl 2.5g, MgSO₄·7H₂O 0.5g, FeSO₄·7H₂O 10mg, MnSO₄·5H₂O 10mg, 바이오틴 100㎍, 티아민·HCl 200㎍, CaCO₄40g, 공정수 1리터당 (pH 7.0(살균후)).

[실시예 1]

모균주인 KFCC 11043의 글루콘산에 대한 성장도를 시험하기 위하여 글루콘산 10 g/l를 함유한 최소배지에 도말한 후 콜로니 생성시기까지 소요되는 시간을 측정하였다. 그 결과 최소 5일 정도가 지나야 콜로니가 생성됨을 확인하였다.(표 1)

코리네박테리움 글루타미컴 KFCC11043의 글루콘산에 대한 성장도 시험

	배양일수(일)
	1	2	3	4	5	6	7
성장도	-	-	-	-	+	++	+++

- : 세포성장 안일어남, + : 세포 성장 일어남

[실시예 2]

글루콘산에 고자화성을 갖는 균을 개발하기 위하여 루리아 버타니 액체배지에서 대수기 중반까지 성장한 코리네박테리움 글루타미컴 KFCC 11043을 시트르산완충액(pH 5.5)에 10⁷∼10⁸세포/㎖로 현탁시킨 후, NTG를 최종농도가 1,000 ㎍/㎖이 되도록 첨가하고 30℃ 진탕기에서 5분간 처리하였다. 이어서 인산칼륨 완충액(pH 7.0)으로 3회 세척하고 글루콘산을 10 g/l 함유한 최소배지에 도말한 후 30℃의 항온기에서 배양하면서 5일 이내에 생성되는 콜로니를 선별하였다. 그 결과 20 개의 글루콘산 고자화성 균주를 획득할 수 있었다.

위에서 얻은 균주를 진탕배양기에서 배양온도 30℃, 교반속도 230 rpm(revolution per minute), 배양시간 72시간의 조건으로 L-라이신의 생산성을 측정하였다. 그 결과 모균주인 KFCC 11043에 비해서 발효농도가 3% 정도 상승한 3개의 균주를 획득하였다.(표 2)

코리네박테리움 글루타미컴 KFCC 11043 및 글루콘산 고자화성 균주의 삼각플라스크 실험결과

균주	발효농도(g/ℓ)	OD562
KFCC 11043	52.1	20
CJG-7	53.5	22
CJG-14	53.5	23
CJG-18	53.8	21

상기 표3에서 보여지듯이, 본 발명의 글루콘산에 고자화성을 갖는 균주들은 모균주인 KFCC 11043에 비해서 발효농도가 3% 이상 상승하였으며, 특히 CJG-18의 경우는 모균주에 비해 발효농도가 현저히 향상되었음을 알 수 있었다. 또한, 본 발명의 글루콘산에 고자화성을 갖는 균주들은 모균주인 KFCC 11043에 비해서 세포증식에 비례하는 흡광도(OD562) 값이 높아짐을 알 수 있었다.

또한, 위에서 획득한 3개 균주의 글루콘산에서의 성장속도를 재확인하기 위하여 글루콘산 함유배지에 도말한 결과 모균주는 5 일만에 콜로니가 생성됨(표 1 참조)에 비해서 CJG-18 균주는 3일 만에 콜로니가 생성됨을 확인하였고 나머지 두 균주는 모균주보다는 빠르나 CJG-18에 비해서는 다소 늦은 성장속도를 나타내었다.

본 발명에 따르면, L-라이신 생산성을 갖는 모균주인 코리네박테리움 글루타미컴(Corynebacterium glutamicum)을 인공돌연변이시켜 글루콘산에 대한 자화성을 증가시킨 변이주(CJG-18 등)를 획득함으로써, 모균주에 비해 발효능력을 향상시켜 L-라이신의 생산성 향상에 유용하게 사용될 수 있다.

Claims

L-라이신 생산성을 갖는 코리네박테리움 글루타미컴 (Corynebacterium glutamicum) 을 모균주로 하여 이를 인공돌연변이시켜 글루콘산에 대한 자화성을 증가시킨 것을 특징으로 하는 L-라이신 고생산성 코리네박테리움 글루타미컴(Corynebacterium glutamicum) CJG-18 균주 (기탁번호 제 KFCC-11245 호).
L-라이신 생산성을 갖는 코리네박테리움 글루타미컴 (Corynebacterium glutamicum) 을 모균주로 하여 유도되고 글루콘산에 대한 자화성을 증가시킨 것을 특징으로 하는 코리네박테리움 글루타미컴(Corynebacterium glutamicum) 균주를 배지중에 배양하고, 그 배양물중에 L-라이신을 축적시켜, 이 배양물로부터 L-라이신을 채취하는 것을 특징으로 하는 L-라이신의 제조방법.