KR960001811B1 - L-프롤린 유도체에 내성을 갖는 l-라이신 생산 미생물 - Google Patents

Abstract

내용 없음.

Description

L-프롤린 유도체에 내성을 갖는 L-라이신 생산 미생물

본 발명은 L-라이신 생산 미생물에 프롤린 (L-Proline)의 유도체인 L-아제티딘-2-카르복실레이트(L-azetidine-2-carboxylate)의 내성을 부여함으로써 그의 발효시간을 단축하여 전체적인 L-라이신의 생산성을 향상시키는 신규한 미생물에 관한 것이다.

L-라이신은 필수 아미노산의 일종으로 가축의 사료, 식품첨가제, 의약원료, 영양제 등으로 사용되고 있으며, 특히 L-라이신 함량이 적은 곡류의 가축사료에 첨가함으로써 영양적 균형을 만들어 사료의 효율을 향상시킬 수 있어 최근 그 수요가 급증하였다.

L-라이신의 생산방법은 주로 미생물을 이용한 직접 발효법이 사용될 수 있는데 그 생산균주는 일반적으로 아미노산 영양요구주, 아미노산 유사체에 대한 내성 및 약제 내성을 지닌 코리네박테리아움속, 브레비박테리아움속 등이다. 이러한 균주는 그 생산성을 향상시키기 위해 인공돌연변이원으로 처리하여 약제 내성을 부여하여 지속적인 역가향상을 꾀하고 있다. 그러나 연속적인 돌연변이의 처리로 역가의 향상은 가능하게 되었지만 발효시간이 지연되어 전체적인 생산성이 향상되지 못하는 단점이 있어 이를 보완하기 위해 연구한 결과, L-라이신 생산 미생물에 L-프롤린의 유도체에 대한 내성을 부여하면 발효시간이 단축됨은 물론 고농도의 당을 단시간 내어 소모한다는 사실을 알아내어 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 발효시간을 단축하여 전체적인 L-라이신의 생산성을 향상시키기 위하여, L-프롤린의 유도체에 대한 내성을 가지는 신규한 L-라이신 생산 미생물을 제공하는데 있다.

이하 본 발명을 구체적으로 설명하면 다음과 같다.

본 발명의 L-프롤린 유도체 내성주는 자외선(U . V) 변이법 및 N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘(이하 NTG라 함)에 의한 변이법에 의해 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum) KFCC 10672로부터 얻었다. 자외선 변이법은 균주의 세포농도를 107∼108cells/ml로하여 0.1몰의 마그네슘설페이트 용액에 현탁시켜 자외선을 30∼80초 조사시켜 처리하는 방법이며, NTG에 의한 변이법의 경우는 사이트레이트 완충액(pH 5.5)에 107∼108cells/ml로 현탁시킨 뒤 NTG의 최종농도가 200∼500μg/ml 되게 한 뒤 실온 또는 30℃에서 10∼20분간 처리하는 방법이다. 상기 방법에 의해 변이처리된 균은 무균수 또는 무균 생리식염수로 세척한 후 L-아제티딘-2-카르복실레이트가 함유된 최소베지에 농축, 도말하여 30∼32℃에 4∼5일간 배양시킨 후 콜로니의 크기가 큰 것부터 선별하여 역가배지가 함유된 진탕플라스크에 접종하고 30∼32℃, 200∼250rpm 조건에서 60∼72시간 배양하여 생산량을 시험한 다음 그중 당소모가 가장 빠르고 생산량이 높은 균주를 최종 1주 선별하였다.

L-라이신의 생산량은 HPLC(High Performance Liquid Chromatography), 또는 산성 닌히드린법(Acidic ninhydrin method)을 사용하였고, 당 분석은 버트란드(Bertrand)법으로 정량하였으며 실험에 사용된 최소배지 및 발효배지의 조성은 다음과 같다.

최소 배지 조성(g/l)

포도당 10

황산암모늄 2

요소 2

KH₂PO₄0.2

K₂HPO₄0.2

MgSO₄·7H₂O 0.1

CaCl₂·2H₂O 0.1

비오틴 100μg/ι

치아민염산염 100μg/ι

Na₂B₄O₆·10H₂O 80μg/ι

(NH₄)₆·MO₂₇4H₂O 40μg/ι

ZnSO₄·7H₂O 10μg/ι

CuSO₄·5H₂O 300μg/ι

MnCl₂·4H₂O 10μg/ι

FeCl₃·6H₂O 1mg/ι

pH 7.0∼7.2

발효 배지 조성(g/l)

슈크로스 100

황산암모늄 27

Corn steep liquor 100

KH₂PO₄1.3

MgSO₄·7H₂O 0.5

FeSO₄·7H₂O 13mg/ι

MnSO₄·5H₂O 8mg/ι

비이틴 300μg/ι

티이민염산염 500μg/ι

판토테네이트칼슘염 10mg/ι

CaCO₃40g/ι

pH 7.0∼7.2

이하 실시예를 통해 본 발명을 보다 상세히 설명한다.

[실시예 1]

코리네박테리움 글루타미쿰 KFCC 10672 균주에 대한 L-프롤린의 효과를 알아보기 위하여 최소배지에 슈크로스 20%를 첨가하여 세포성장도를 관찰한 결과는 다음과 같다.

[표 1. L-프롤린이 세포성장에 미치는 영향]

위 표에서 보듯이 20% 슈크로스를 함유한 최소배지에 L-프롤린을 0.8g/ι 이상 첨가했을 때 세포성장이 일어난 결과로 미루어 L-프롤린이 삼투보호제(osmoprotectant)로 적용하고 잇음을 알 수 있었다.

[실시예 2]

코리네박테리움 글루타미쿰 KFCC 10672 균주의 1-아제티딘-2-카르복실레이트의 내성도를 측정하기 위해 최소배지에 L-아제티딘-2-카르복실레이트를 농도별로 첨가하여 그 성장도를 관찰하였다.

[표 2. L-아제티딘-2-카르복실레이트(L-A.C) 내성도]

그 결과 10g/ι까지는 균이 어느 정도 성장했지만 15g/ι 이상에서는 전혀 성장이 일어나지 않았다.

[실시예 3]

돌연변이원이 처리된 코리네박테리움 글루타미쿰 KFCC 10672를 L-아제티딘-2-카르복실레이트가 15g/ι 함유된 최소배지에 도달하고 4∼5일간 30∼32℃에 배양한 후 콜로니 크기가 큰 것부터 재차 20%의 슈크로스가 함유된 최소배지에 도달하였다. 1∼3일 배양후 콜로니의 크기가 큰 것만을 채취하여 플라스크에서 역가시험을 실시했다. 그중 KFCC 10672에 비해 당소모속도가 빠르고 L-라이신 축적량이 비교적 높은 균을 골라 그 균을 코리네박테리움 글루타미쿰 AC 8이라 명명하고 1992년 7월 2일자로 한국종균협회에 기탁하였다(기탁번호 : Corynebacterium glutamicum KFCC 10769).

다음 표 3은 플라스크에서 전술된 역가배지를 사용하여 배양시간별 잔당과 L-라이신 생산량을 나타낸 것으로 코리네박테리움 글루타미쿰 KFCC 10769가 공지의 균인 KFCC 10672에 비해 L-라이신 측정량은 거의 대등했지만 발효시간이 상당히 단축되었음을 알 수 있었다.

[표 3. 플라스크에서 코니네박테리움 글루타미쿰 KFCC 10672와 KFCC 10769의 비교실험]

Claims (2)

1. L-프롤린 유도체에 내성을 갖는 L-라이신 생산 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum KFCC 10769).
2. 제1항에 있어서, L-프롤린 유도체는 L-아제티딘-2-카르복실레이트임을 특징으로 하는 코리네박테리움 글루타미쿰.