CN100415893C

CN100415893C - 制备l-谷氨酸的方法

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Publication number: CN100415893C
Application number: CNB021185271A
Authority: CN
Inventors: 佐藤雅一; 秋好直树
Original assignee: Ajinomoto Co Inc
Current assignee: Ajinomoto Co Inc
Priority date: 2001-02-20
Filing date: 2002-02-20
Publication date: 2008-09-03
Anticipated expiration: 2022-02-20
Also published as: BR0200487A; US20020192772A1; EP1233070B1; AU783280B2; DE60207914D1; RU2288271C2; JP2002238591A; MY128886A; KR20020068294A; EP1233070A3; AU1565802A; CN1377972A; ATE312937T1; DE60207914T2; BR0200487B1; ES2252331T3; JP4599725B2; US6653110B2; EP1233070A2; PE20020887A1

Abstract

一种通过发酵制备L-谷氨酸的方法，其包括在具有5.0或更小pH的培养基中培养具有L-谷氨酸-生产能力的微生物，所述培养基中在该pH下抑制微生物生长的有机酸的总含量是在该含量下微生物的生长不被抑制的量；和一种通过发酵制备L-谷氨酸的方法，其包括在培养基中在有机酸不抑制该微生物生长的第一pH值下培养具有L-谷氨酸-生产能力的微生物，然后在适合该微生物生产L-谷氨酸并且低于第一pH值的第二pH值下培养该微生物。

Description

制备L-谷氨酸的方法

发明背景

本发明涉及通过发酵制备L-谷氨酸的方法。L-谷氨酸被广泛用作调味品等的原料。

主要通过使用属于短杆菌属(Brevibacterium)，棒状杆菌属(Corynebacterium)或微杆菌属(Microbacterium)或者它们的突变株的称之为生产L-谷氨酸的棒杆菌进行发酵来制备L-谷氨酸(氨基酸发酵(Amino Acid Fermentation，GakkaiShuppan中心，195-215页，1986)。作为通过使用其它菌株发酵制备L-谷氨酸的方法，已知的有使用属于芽孢杆菌属(Bacillus)，链霉菌属(Streptomyces)，青霉属(Penicillium)等的微生物的方法(美国专利号3220929)，使用属于假单胞菌属(Pseudomonas)，节杆菌属(Arthrobacter)，沙雷氏菌属(Serratia)，假丝酵母属(Candida)等的微生物的方法(美国专利号3563857)，使用属于芽孢杆菌属，假单胞菌属，沙雷氏菌属，产气气杆菌(Aerobacter aerogenes)(现在称为产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes))等的方法(日本专利公开(kokoku)No.32-9393)，使用大肠埃希氏杆菌的突变株的方法(日本专利申请Laid-open(kokai)No.5-244970)等等。另外，本发明人提出了通过使用属于克雷白氏杆菌属(Klebsiella)，欧文氏杆菌属(Erwinia)或Pantoea的微生物制备L-谷氨酸的方法(日本专利申请Laid-open No.2000-106869)。

此外，公开了通过应用重组DNA技术提高L-谷氨酸生物合成酶的活性而提高L-谷氨酸生产能力的各种技术。例如，报道过导入编码来自大肠埃希氏杆菌或谷氨酸棒状杆菌的柠檬酸合成酶的基因对于提高棒状杆菌或短杆菌属细菌生产L-谷氨酸能力是有效的(日本专利公开(kokoku)No.7-121228)。另外，日本专利申请Laid-open No.61-268185公开了一种携带包含来自棒状杆菌的谷氨酸脱氢酶基因的重组DNA的细胞。此外，日本专利申请Laid-open No.63-214189公开了通过扩增谷氨酸脱氢酶基因，异柠檬酸脱氢酶基因，乌头酸水合酶基因和柠檬酸合成酶基因提高L-谷氨酸生产能力的技术。

尽管通过微生物的上述培养或生产方法的改进大大提高了L-谷氨酸的生产力，但是仍然要求开发以更低的成本更有效地生产L-谷氨酸的方法以符合将来要求的进一步提高。

已知一种方法，其中进行发酵的同时结晶培养物中积累的L-氨基酸(日本专利申请Laid-open No.62-288)。用这种方法，通过沉淀培养物中积累的L-氨基酸将培养物中L-氨基酸浓度维持在低于一定水平。具体地说，在发酵期间通过调节培养物的温度和pH或者向培养基中加入表面活性剂来沉淀L-色氨酸，L-酪氨酸或L-亮氨酸。

如上文所述已知进行伴随沉淀L-氨基酸的发酵方法，适合该方法的氨基酸是表现出相对低的水溶解性的那些，没有将该方法用于高水可溶解性氨基酸例如L-谷氨酸的例子是已知的。另外，培养基一定具有低的pH来沉淀L-谷氨酸。但是，生产L-谷氨酸的细菌例如上面提到的那些在酸性条件下不能生长，因此，在中性条件下进行L-谷氨酸发酵(美国专利3220929和3032474；K.C.Chao&J.W.Foster，细菌学杂志(J.Bacteriol)77，pp.715-725(1959))。因此，通过伴随沉淀的发酵生产L-谷氨酸是未知的。此外，已知大多数嗜酸菌的生长被有机酸例如乙酸，乳酸和琥珀酸抑制(Yasuro Oshima编著，“极端环境微生物手册”(Extreme Environment Microorganism Handbook)p.231，科学论坛(ScienceForum)；R.M.Borichewski，细菌学杂志(J.Bacteriol)93，pp.597-599(1967)等)。因此，考虑到很多微生物对L-谷氨酸敏感，其在酸性条件下也是一种有机酸，并且没有关于试图寻找在酸性条件下表现出L-谷氨酸生产能力的微生物的报道。

发明概述

本发明的目的是提供通过发酵生产L-谷氨酸的方法，其使得即使使用含有在低pH下抑制微生物生长的有机酸的材料作为糖源时也能有效生产L-谷氨酸。

本发明的发明人发现，在中性pH下，生产L-谷氨酸的细菌消耗在低pH下抑制生产L-谷氨酸的细菌生长的有机酸，以该性能为基础，通过使用含有在低pH下抑制微生物生长的有机酸的材料作为糖源能有效生产L-谷氨酸。因此，他们完成了本发明。

本发明提供如下：

(1)通过发酵生产L-谷氨酸的方法，包括在具有5.0或更小的pH的培养基中培养具有L-谷氨酸生产能力的微生物，其中在该pH下抑制该微生物生长的有机酸的总含量是不抑制该微生物生长的量。

(2)根据(1)的方法，其中在培养基中培养的过程中，伴随着L-谷氨酸沉淀下L-谷氨酸在培养基中产生并积累。

(3)根据(1)或(2)的方法，其中有机酸的总含量是0.4克/升或更少。

(4)根据(1)-(3)任一项的方法，其中有机酸是具有1-3碳原子数的有机酸。

(5)根据(1)-(4)任一项的方法，其中微生物属于肠杆菌属。

(6)根据(5)的方法，其中微生物是成团肠杆菌(Enterobacteragglomerans)。

(7)根据(1)-(6)任一项的方法，其中所述微生物能代谢含有饱和浓度的L-谷氨酸的液体培养基中的碳源，并且该碳源在特定pH下具有以超过在该pH下L-谷氨酸在该液体培养基中的饱和浓度的量积累L-谷氨酸的能力。

(8)根据(7)的方法，其中特定pH是5.0或更小。

(9)通过发酵生产L-谷氨酸的方法，包括在培养基中有机酸不抑制该微生物生长的第一pH下培养具有L-谷氨酸生产能力的微生物，然后在适合该微生物生产L-谷氨酸并且低于第一pH的第二pH下培养该微生物。

(10)根据(9)的方法，其中有机酸是具有1-3碳原子数的有机酸。

(11)根据(9)或(10)的方法，其中第二pH值是3.0-5.0。

(12)根据(9)-(11)任一项的方法，其中通过向培养基中加入碱化物质将培养基的pH保持为第一pH值的同时在第一pH值下进行培养。

(13)根据(12)的方法，包括在第一pH值下培养之后控制加入碱化物质的量来降低培养基的pH值。

(14)根据(9)-(13)任一项的方法，其中在培养基中的有机酸消耗完之前持续在第一pH值下培养。

(15)根据(9)-(14)任一项的方法，其中微生物属于肠杆菌属。

(16)根据(15)的方法，其中微生物是成团肠杆菌。

(17)根据(9)-(16)任一项的方法，其中所述微生物能代谢含有饱和浓度的L-谷氨酸的液体培养基中的碳源，并且该碳源在特定pH值下具有以超过在该pH值下L-谷氨酸在该液体培养基中的饱和浓度的量积累L-谷氨酸的能力。

(18)根据(17)的方法，其中特定pH值是5.0或更小。

(19)根据(17)或(18)的方法，其中适合L-谷氨酸生产的pH值是在该pH值该微生物生产的L-谷氨酸在该培养基中沉淀的pH值，在该pH下在培养基中培养的过程中，伴随L-谷氨酸沉淀下产生并积累L-谷氨酸。

根据本发明的方法，即使利用含有抑制微生物生长的有机酸的材料例如赤糖糊作为糖源时也能有效产生L-谷氨酸。

附图的简要说明

图1是pTWVEK101中来自成团肠杆菌的DNA片段的限制酶图谱。

图2是来自成团肠杆菌的sucA基因的核苷酸序列推导的氨基酸序列和来自大肠埃希氏杆菌的sucA基因的核苷酸序列推导的氨基酸序列的比较(上：成团肠杆菌，下栏：大肠埃希氏杆菌，下文将相同)。

图3是来自成团肠杆菌的sucB基因的核苷酸序列推导的氨基酸序列和来自大肠埃希氏杆菌的sucB基因的核苷酸序列推导的氨基酸序列的比较。

图4是来自成团肠杆菌的sucC基因的核苷酸序列推导的氨基酸序列和来自大肠埃希氏杆菌的sucC基因的核苷酸序列推导的氨基酸序列的比较。

图5是来自成团肠杆菌的sdhB基因的核苷酸序列推导的氨基酸序列和来自大肠埃希氏杆菌的sdhB基因的核苷酸序列推导的氨基酸序列的比较。

图6说明包含gltA基因，ppc基因和gdhA基因的质粒pMWCPG的构建。

图7说明包含广谱-宿主-范围质粒RSF1010的复制起点和四环素抗性基因的质粒RSF-Tet的构建。

图8说明包含广谱-宿主-范围质粒RSF1010的复制起点，四环素抗性基因，gltA基因，ppc基因和gdhA基因的质粒RSFCPG的构建。

图9说明包含gltA基因的质粒pSTVCB的构建。

图10说明各种有机酸在酸性pH下(pH4.5)的生长抑制作用。

图11说明引起生长抑制的pH下使用甲酸的研究结果。

图12说明在pH4.5条件下引起生长抑制的甲酸浓度的研究结果。

图13说明培养期间细胞的时间过程。

本发明的详细描述

下面将详细解释本发明。

根据本发明的第一实施方案的制备方法(因此也称之为“本发明的第一种制备方法”)是通过发酵制备L-谷氨酸的方法，其包括在pH是5.0或更小的培养基中培养具有生产L-谷氨酸能力的微生物，其中在该pH下所述培养基中抑制该微生物生长的有机酸的总含量是不抑制该微生物生长的含量。

在本发明的该第一种制备方法中，优选的是通过在培养基中培养伴随L-谷氨酸的沉淀来产生和积累L-谷氨酸。达到这一点的方法可以是将培养基的pH调节到产生的L-谷氨酸沉淀的pH。这样的pH通常是3.0-5.0。考虑到在通过发酵制备L-谷氨酸中，培养基中高浓度积累L-谷氨酸使得产率降低构成提高产率的障碍。例如，微生物细胞具有L-谷氨酸的排泄系统和吸收系统，而如果排泄到培养基中的L-谷氨酸一旦又被细胞吸收，则不仅生产效率降低，而且导致L-谷氨酸生物合成反应的抑制。通过使培养基处于产生的L-谷氨酸发生沉淀的pH下，能够避免由于L-谷氨酸高浓度积累导致的产率降低。

培养基的pH优选是4.5或更小，更优选4.0或更小。

在该实施方案中，在培养基的pH下抑制微生物生长的有机酸指当在所述pH下的培养基中以某一浓度(通常0.5克/升或更大)存在时，对微生物的生长的抑制作用有抑制影响的有机酸，并且通常是具有1-3个碳原子数的有机酸，即甲酸，乙酸或丙酸。

有机酸的总含量优选是0.4克/升或更少，更优选0.3克/升或更少，进一步优选0.2克/升或更少。

根据本发明的第二实施方案的制备方法(因此也称之为“本发明的第二种制备方法”)是通过发酵制备L-谷氨酸的方法，其包括在培养基中在有机酸不抑制所述微生物生长的第一pH下培养具有生产L-谷氨酸能力的微生物，然后在适合该微生物生产L-谷氨酸并且低于第一pH的第二pH下培养该微生物。

发现生产L-谷氨酸的细菌在酸性条件下一般承受有机酸对生长的抑制，而其在中性条件下可能会消耗有机酸。以该性质为基础，通过在中性pH下进行细胞培养然后将pH变为酸性pH来生产L-谷氨酸，有可能获得高产率也有可能使用各种材料作为糖源。

在该实施方案中，有机酸指当在培养基中在第二pH下以某种浓度(通常是0.5克/升或更大)存在时对微生物的生长有抑制作用的有机酸，并且其通常是具有1-3个碳原子数的有机酸，即甲酸，乙酸或丙酸。

选择第一pH值和第二pH值使得它们满足要使用的生产L-谷氨酸的细菌的性质。本领域技术人员容易测定这些pH值。例如，通过在含有被调节到各种pH值的有机酸的培养基中培养生产L-谷氨酸的细菌，以吸光度等为基础测定细胞量，并且将该细胞量与除了培养基中不含有有机酸的相同条件下培养的生产L-谷氨酸的细菌的细胞量相比较，能够测定培养基中有机酸不引起对微生物生长抑制的pH值。适合L-谷氨酸生产的pH指L-谷氨酸在培养基中积累的pH，其可以通过在各种pH值的培养基中培养生产L-谷氨酸的细菌而测得。具体地说，通过测定各种pH值的培养基中积累L-谷氨酸的量并且将它们比较而测得。

第一pH值没有特殊限制，只要在培养基中该有机酸不抑制微生物的生长，但是通常该pH值是5.0-8.0。

第二pH值优选是生产的L-谷氨酸发生沉淀的pH，这样的pH通常是3.0-5.0。作为对本发明的第一种制备方法的解释，通过在生产的L-谷氨酸发生沉淀的pH下进行培养能够避免L-谷氨酸高浓度积累带来的产率的降低。

第一pH值和第二pH值在培养期间不一定严格恒定，只要能够获得本发明的益处，它们可以有波动。

生产L-谷氨酸的细菌即使在第一pH值下也生产L-谷氨酸，因此，优选在通过向培养基中加入碱性物质保持培养基的pH为第一pH值的情况下进行在第一pH值下的培养。

尽管对碱性物质没有特殊限制，只要它对生产L-谷氨酸的细菌的生长或L-谷氨酸的生产没有不利影响，但是氨气是优选的。

通过加入酸性物质可以将培养基的pH值从第一pH值降低到第二pH值。而且如上所述，培养期间，生产L-谷氨酸的细菌生产的L-谷氨酸降低pH值。因此，优选通过控制碱性物质的加入量将培养基的pH值从第一pH值降低到第二pH值，因为可以省却酸性物质的加入。

在培养基中有机酸被耗尽之前可以持续在第一pH值下培养。所谓耗尽指有机酸的量降低到在第二pH值下培养期间生产L-谷氨酸的细菌不波抑制的水平。本领域技术人员容易测定这样的有机酸的水平。例如用下述方法确定这个水平：在第二pH值下在含有各种浓度的有机酸的培养基中培养生产L-谷氨酸的细菌，测定生产L-谷氨酸的细菌的细胞量，并且与除了培养基不含有有机酸之外相同的条件下培养的生产L-谷氨酸的细菌的细胞量相比较。一般情况下，随着第二pH值的降低，有机酸的水平也下降。

本发明第一种制备方法中和本发明第二种制备方法中使用的生产L-谷氨酸的细菌是当在培养基中培养时在培养基中积累显著量的L-谷氨酸的微生物。其例子包括肠杆菌属的微生物，优选是成团肠杆菌。

此外，本发明第一种和第二种制备方法中使用的生产L-谷氨酸的细菌优选是在特定pH值下含有饱和浓度的L-谷氨酸和碳源的液体培养基中能够代谢碳源，并且具有在上述pH值下的该液体培养基中积累超过L-谷氨酸的饱和浓度的量的L-谷氨酸的能力的微生物(下面也称之为L-谷氨酸-积累微生物)。上述特定pH值优选是L-谷氨酸在培养基中发生沉淀的pH值，这样的pH值通常是5.0或更小。

“饱和浓度”指当液体培养基被L-谷氨酸饱和时该液体培养基中溶解的L-谷氨酸的浓度。

当使用L-谷氨酸-积累微生物时，适合生产L-谷氨酸的pH值优选是L-谷氨酸在培养基中发生沉淀的pH值。通过在该pH值下进行培养，产生L-谷氨酸并且伴随其沉淀而在培养基中积累。

可以如下获得L-谷氨酸-积累微生物。将含有微生物的样品接种到特定pH值下含有饱和浓度的L-谷氨酸和碳源的液体培养基中，并且筛选代谢碳源的菌株。尽管所谓特定pH值没有特别限制，但是通常是大约5.0或更小，优选大约4.5或更小，更优选大约4.3或更小。使用L-谷氨酸-积累微生物通过发酵生产L-谷氨酸并伴随L-谷氨酸的沉淀。如果pH值太高，则难以使微生物产生足以沉淀量的L-谷氨酸。因此，pH值优选是上述范围。

如果含有L-谷氨酸的水溶液的pH值降低，则L-谷氨酸的溶解度明显降低到γ-羧基的pKa值附近(4.25，25℃)。在等电点(pH32)时溶解度变得最低，并且沉淀出超出相应于饱和浓度量的L-谷氨酸。根据培养基成分，大约30℃下，溶解的L-谷氨酸的量在pH3.2下是10-20克/升，pH4.0下是30-40克/升，pH4.7下是50-60克/升。通常pH值不必要为3.0或更低，因为当pH值低于一定值时，L-谷氨酸沉淀效果达到其上限。但是pH值可以是3.0或更低。

另外，表述一种微生物“能够代谢碳源”指它能够增殖或者即使它不能增殖也能够消耗碳源，也就是说，这表明它分解代谢碳源例如糖或有机酸。具体地说，例如，当在pH5.0-4.0，优选pH4.5-4.0，更优选pH4.3-4.0，特别优选pH4.0，在合适的温度下，例如28℃，37℃或50℃，在含有饱和浓度的L-谷氨酸的液体培养基中培养2-4天时，如果微生物增殖，该微生物就能在培养基中代谢碳源。此外，例如，当在pH5.0-4.0，优选pH4.5-4.0，更优选pH4.3-4.0，特别优选pH4.0，在合适的温度下，例如28℃，37℃或50℃，在含有饱和浓度的L-谷氨酸的合成液体培养基中培养2-4天时，即使该微生物不增殖该微生物也消耗碳源，该微生物是能够在培养基中代谢碳源的微生物。

能够代谢碳源的微生物包括能够在上述液体培养基中生长的微生物。

此外，所谓“能够生长”指其能够增殖或者即使其不能增殖也能够产生L-谷氨酸，具体地说，例如，当在pH5.0-4.0，优选pH4.5-4.0，更优选pH4.3-4.0，特别优选pH4.0，在合适的温度下，例如28℃，37℃或50℃，在含有饱和浓度的L-谷氨酸的液体培养基中培养2-4天时，如果微生物增殖，该微生物就能在该培养基中生长。此外，例如，当在pH5.0-4.0，优选pH4.5-4.0，更优选pH4.3-4.0，特别优选pH4.0，在合适的温度下，例如28℃，37℃或50℃，在含有饱和浓度的L-谷氨酸的合成液体培养基中培养2-4天时，即使该微生物不增殖该微生物也增加了合成液体培养基中L-谷氨酸的量，该微生物是能够在培养基中生长的微生物。

在相同条件下或者改变pH值或L-谷氨酸的浓度，可以将上述筛选重复两次或多次。可以在含有低于饱和浓度L-谷氨酸的培养基中进行早期筛选，然后在含有饱和浓度L-谷氨酸的培养基中进行其后的筛选。此外，可以筛选具有有利性质例如优越增殖速度的菌株。

L-谷氨酸-积累微生物是除了具有上述性质之外具有在液体培养基中积累超过相应于L-谷氨酸在该培养基中的饱和浓度的量的L-谷氨酸的能力。上述液体培养基的pH优选与用于筛选具有上述性质的微生物的培养基的pH值相同或接近。通常，随着pH值降低微生物变得易受高浓度L-谷氨酸的影响。因此，从对L-谷氨酸的抗性的角度来看，优选pH值不是低值，但是从伴随L-谷氨酸沉淀产生L-谷氨酸的角度来看，优选低pH值。为了满足这些条件，pH值可以是3-5，优选4-5，更优选4-4.7，更优选4-4.5，特别优选4.0-4.3的范围。

作为L-谷氨酸-积累微生物或繁殖材料，可以提到的有例如属于肠杆菌属，克雷白氏杆菌属，沙雷氏菌属，Pantoea，欧文氏杆菌属，埃希氏杆菌属，棒状杆菌属，Alicyclobacillus，芽孢杆菌属，糖酵母属等的微生物，其中，属于肠杆菌属的微生物是优选的。这里本发明的微生物主要解释为属于肠杆菌属的微生物。但是，所述微生物不局限于属于肠杆菌属的微生物，同样可以使用属于其它属的那些微生物。

作为属于肠杆菌属的微生物，具体可以提到成团肠杆菌，优选成团肠杆菌AJ13355菌株。从日本Iwata-shi，Shizuoka的土壤分离的该菌株是在含有L-谷氨酸和碳源的低pH值的培养基中能够增殖的菌株。

AJ13355的生理特性所示如下：

(1)革兰氏染色：阴性

(2)对氧的行为：兼性厌氧菌

(3)过氧化氢酶：阳性

(4)氧化酶：阴性

(5)硝酸盐还原能力：阴性

(6)伏-波试验：阳性

(7)甲基红试验：阴性

(8)脲酶：阴性

(9)吲哚产生：阳性

(10)游动性：游动

(11)TSI培养基中H₂S产生：弱活性

(12)β-半乳糖苷酶：阳性

(13)糖-同化性质：

阿拉伯糖：阳性

蔗糖：阳性

乳糖：阳性

木糖：阳性

山梨糖醇：阳性

肌醇：阳性

海藻糖：阳性

麦芽糖：阳性

葡萄糖：阳性

阿东糖醇：阴性

棉子糖：阳性

水杨苷：阴性

蜜二糖：阳性

(14)甘油糖-同化性质：阳性

(15)有机酸-同化性质：

柠檬酸：阳性

酒石酸：阴性

葡糖酸：阳性

乙酸：阳性

丙二酸：阴性

(16)精氨酸脱水酶：阴性

(17)鸟氨酸脱羧酶：阴性

(18)赖氨酸脱羧酶：阴性

(19)苯丙氨酸脱氨酶：阴性

(20)色素生成：黄色

(21)明胶液化能力：阳性

(22)生长pH值：pH4下能生长，pH4.5-7下生长好

(23)生长温度：25℃生长好，30℃生长好，37℃生长好，42℃能生长，45℃不能生长。

以这些细菌学特性为基础，确定AJ13355为成团肠杆菌。

成团肠杆菌AJ13355菌株于1998年2月19日保藏在通商产业省工业技术院国立生命科学和人体技术研究所(现在是国家高级科技学院，国际专利生物保藏中心)，被接受的保藏号是FERM P-16644。其然后于1999年1月11日被转移到为布达佩斯条约承认的一个国际保藏，被接受的保藏号为FERM BP-6614。

L-谷氨酸-积累微生物可以是原来就具有L-谷氨酸-生产能力的微生物或者是具有通过利用诱变处理，重组DNA技术等进行培养而带来或增强的L-谷氨酸-生产能力的微生物。

通过例如提高催化L-谷氨酸生物合成反应的酶的活性能够带来或增强L-谷氨酸-生产能力。也可以通过降低或消除催化L-谷氨酸生物合成途径副反应并且产生不是L-谷氨酸的化合物的反应的酶的活性来增强L-谷氨酸-生产能力。

作为催化L-谷氨酸生物合成反应的酶，可以提到谷氨酸脱氢酶(下文也称之为“GDH”)，谷氨酰胺合成酶，谷氨酸合成酶，异柠檬酸脱氢酶，乌头酸氢化酶，柠檬酸合成酶(下文也称之为“CS”)，磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(下文也称之为“PEPC”)，丙酮酸脱氢酶，丙酮酸激酶，烯醇化酶，磷酸甘油酸变位酶，磷酸甘油酸激酶，甘油醛-3-磷酸脱氢酶，丙糖磷酸异构酶，果糖二磷酸醛缩酶，果糖磷酸激酶，葡萄糖磷酸异构酶等。这些酶中，CS，PEPC和GDH的一种，两种或三种是优选的。此外，优选所有三种酶CS，PEPC和GDH的活性在L-谷氨酸-积累微生物中增强。特别地，优选乳发酵短杆菌(Brevibacteriumlactofermentum)的CS，因为它不受α-酮戊二酸，L-谷氨酸和NADH的抑制。

为了提高CS，PEPC或GDH的活性，例如，可以在合适的质粒上克隆编码CS，PEPC或GDH的基因，并且可以用获得的质粒转化宿主微生物。转化的细胞株中编码CS，PEPC或GDH的基因(下文分别缩写为“gltA基因”，“ppc基因”和“gdhA基因”)的拷贝数增加，导致CS，PEPC或GDH的活性的提高。

将克隆的gltA，ppc和gdhA基因，单独地或者它们任意两种或三种的组合地，导入上述起始亲株中。当导入这些基因的两种或三种时，可以在一种类型的质粒上克隆这些基因的两种或三种，并且导入宿主中，或者分别在能够共存的两种或三种类型的质粒上克隆并且导入宿主中。

编码相同类型的酶但是来自不同微生物的基因的两种或多种可以被导入同一的宿主。

上述质粒没有特别限制只要它们在属于肠杆菌属的微生物细胞中是自主复制的。此外可以提到例如pUC19，pUC18，pBR322，pHSG299，pHSG298，pHSG399，pHSG398，RSF1010，pMW119，pMW118，pMW219，pMW218，pACYC177，pACYC184，等。除了这些，也可以使用噬菌体DNA的载体。

转化可以通过例如D.M.Morrison的方法(酶学方法(Methods inEnzymology)68，326(1979))，其中受体细菌细胞对DNA的通透性通过用氯化钙处理细胞而增强的方法(Mandel M.和Higa A.，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)53，159(1970))，电穿孔(Miller J.H.细菌遗传学短训班(A Short Coursein Bacterial Genetics)，冷泉港实验出版社，美国，1992)等进行。

通过让作为宿主的上述起始亲株的染色体DNA上存在gltA基因，ppc基因或gdhA基因的重复拷贝也能够提高CS，PEPC或GDH的活性。为了在属于肠杆菌属或类似微生物的染色体DNA上导入gltA基因，ppc基因或gdhA基因的重复拷贝，可以使用其重复拷贝位于染色体DNA上的序列，例如存在于转座因子末端的DNA和反向重复序列。或者通过利用包含gltA基因，ppc基因或gdhA基因的转座子的转移能够向染色体DNA上导入基因的重复拷贝。作为结果，转化的细胞株中gltA基因，ppc基因或gdhA基因的拷贝数增加，因此CS，PEPC或GDH的活性被提高。

作为拷贝数被增加的gltA基因，ppc基因或gdhA基因来源的微生物，可以使用任何微生物，只要其具有CS，PEPC或GDH活性。其中，原核细胞生物细菌，例如属于肠杆菌属，克雷白氏杆菌属，欧文氏杆菌属，Pantoea，沙雷氏菌属，埃希氏杆菌属，棒状杆菌属，短杆菌属，芽孢杆菌属的那些是优选的。作为具体的例子，可以提到大肠埃希氏杆菌，乳发酵短杆菌等。能够从上述微生物的染色体DNA获得gltA基因，ppc基因或gdhA基因。

通过使用缺少CS，PEPC或GDH活性的突变株来从上述微生物的染色体DNA分离补充其营养缺陷的DNA片段能够获得gltA基因，ppc基因或gdhA基因。此外，因为已经阐明了埃希氏杆菌和棒状杆菌的这些基因的核苷酸序列(生物化学(Biochemistry)，22，pp.5243-5249，(1983)；生物化学杂志(J.Biochem.)95，pp.909-916，(1984)；基因(Gene)27，pp.193-199，(1984)；微生物学(Microbiology)140，pp.1817-1828，(1994)；分子基因遗传学(Mol.Gen.Genet.)218，pp.330-339，(1989)；分子微生物学(Molecular Microbiology)6，pp.317-326，(1992))，通过使用以各核苷酸序列和作为模板的染色体的DNA为基础合成的引物进行PCR也能够获得这些基因。

除了上述基因的扩增之外，通过增强gltA基因，ppc基因或gdhA基因的表达，也能够提高CS，PEPC或GDH的活性。例如，通过用另一个更强的启动子来置换gltA基因，ppc基因或gdhA基因的启动子能够增强表达。例如，lac启动子，trp启动子，trc启动子，tac启动子，P_R启动子和λ-噬菌体的P_L启动子等是已知的强启动子。在质粒上克隆其启动子被置换的gltA基因，ppc基因或gdhA基因，并且通过使用重复DNA，反向重复序列，转座子等导入宿主微生物中，或者导入宿主微生物的染色体DNA中。

通过用另一个更强的启动子置换染色体上的gltA基因，ppc基因或gdhA基因的启动子(参见WO87/03006和日本专利申请公开61-268183)，或者在各基因的编码序列的上游插入强启动子(参见基因(Gene)29，pp.231-241(1984))也能提高CS，PEPC或GDH的活性。具体地说，在其启动子被更强的启动子或者包含其一部分的DNA置换的gltA基因，ppc基因或gdhA基因和该染色体上的相应基因之间能够进行同源重组。

催化L-谷氨酸生物合成途径副反应并且产生不是L-谷氨酸的化合物的反应的酶的的例子包括α-酮戊二酸脱氢酶(下文也称之为“αKGDH”)，异柠檬酸裂解酶，磷酸乙酰转移酶，乙酸激酶，乙酰羟酸合成酶，乙酰乳酸合成酶，甲酸乙酰转移酶，乳酸脱氢酶，谷氨酸脱羧酶，1-吡咯烷脱氢酶等。这些酶中，αKGDH是优选的。

为了降低或消除属于肠杆菌属等的微生物中的上述酶的活性，通过常规诱变处理方法或遗传工程方法能够向上述酶的基因中导入降低或消除该酶的胞内活性的突变。

诱变处理方法的例子包括，例如，利用X-射线或紫外线照射的方法，利用用例如N-甲基-N‘-硝基-N-亚硝基胍的诱变剂处理的方法等。导入突变的基因上的位点可以是在编码酶蛋白质的编码区或者在调控表达的区例如启动子内。

遗传工程方法的例子包括，例如，利用基因重组，转导，细胞融合等的方法。例如，将抗药性基因插入克隆的靶基因中来制备缺失了其功能的基因(缺损基因)。接着，该缺损基因被导入宿主微生物的细胞，并且通过利用同源重组用上述缺损基因置换染色体上的靶基因(基因破坏)。

通过测定从侯选菌株获得的细胞提取物或者其纯化级分的酶活性并且与野生菌株的相比较，能够证实该靶酶的胞内活性的降低或缺少和活性降低的程度。例如，通过Reed等的方法(Reed L.J.和Mukherjee B.B.，酶学方法(Methodsin Enzymology)13，pp.55-61(1969))，能够测定αKGDH的活性。

以该靶酶为基础，能够以突变株的表型为基础筛选靶突变株。例如，αKGDH活性被消除或降低的突变株在含有葡萄糖的基本培养基中或者含有乙酸或L-谷氨酸为专有碳源的基本培养基中在有氧培养条件下不能增殖或者表现出大大降低的增殖速度。但是，即使在相同条件下通过向含有葡萄糖的基本培养基中加入琥珀酸或赖氨酸，甲硫氨酸和二氨基庚二酸也能进行正常增殖。通过利用这些现象为指征，能够筛选具有降低的αKGDH活性或者该活性缺少的突变株。

WO95/34672详细描述了通过利用同源重组制备乳发酵短杆菌的αKGDH基因-缺少菌株的方法，可以对其它微生物应用相似方法。

此外，分子克隆(Molecular Cloning)，第二版，冷泉港出版社(1989)等详细描述了象基因克隆，和DNA的消化和连接，转化等这样的技术。

作为如上所述获得的缺少αKGDH活性或者具有降低的αKGDH活性的突变株的具体例子，可以提到成团肠杆菌AJ13356。成团肠杆菌AJ13356菌株于1998年2月19日保藏在通商产业省工业技术院国立生命科学和人体技术研究所(现在是国家高级科技学院，国际专利生物保藏中心)，被接受的保藏号是FERM P-16645。其然后于1999年1月11日被转移到为布达佩斯条约承认的一个国际保藏，被接受的保藏号为FERM BP-6615。成团肠杆菌AJ13356作为αKGDH-E1亚单位基因(sucA)的破坏的结果缺少αKGDH活性。

当在含有糖类的培养基中培养本发明使用的微生物例子的成团肠杆菌时，胞外分泌粘液，偶尔导致低操作效率。因此，当使用具有分泌粘液这样的性质的成团肠杆菌时，优选使用与野生型菌株相比分泌较少粘液的突变株。诱变处理的例子包括利用X-射线或紫外线照射的方法，利用用例如N-甲基-N‘-硝基-N-亚硝基胍的诱变剂处理的方法等。通过在含有糖类的培养基例如含有5克/升葡萄糖的LB培养基平板中接种诱变的细菌细胞并且将平板倾斜大约45度培养它们并且筛选不表现出粘液向下流动的菌落，能够筛选减少粘液分泌的突变株。

在本发明中，可以以任何顺序进行如上所述的L-谷氨酸-生产能力的赋予或增强和其它有利性质的赋予，诸如更少粘液分泌的突变。

通过在调节到使L-谷氨酸沉淀的pH条件下的液体培养基中培养L-谷氨酸-积累微生物，能够生产L-谷氨酸并且随着其在培养基中沉淀而积累。

“使微生物产生的L-谷氨酸沉淀的条件”指这里意味着当L-谷氨酸-积累微生物生产并积累L-谷氨酸时使L-谷氨酸发生沉淀的条件。尽管该条件的pH可以随着该微生物的L-谷氨酸生产能力而变化，但是当微生物是肠杆菌属细菌时其通常是3-5。

作为在本发明的第一种生产方法中培养，在本发明的第二种生产方法中第一pH下培养和第二pH下培养所使用的培养基，只要调节pH使满足预定条件，就能使用常规的含有碳源，氮源，无机盐和根据需要的有机痕量营养例如氨基酸和维生素的营养培养基。可以使用合成培养基也可以使用天然培养基。培养基中使用的碳源和氮源可以是任何碳源和氮源，只要培养的菌株能够利用它们。

作为碳源，可以使用糖，例如葡萄糖，甘油，果糖，蔗糖，麦芽糖，甘露糖，半乳糖，淀粉水解物和糖蜜等。另外，可以单独地或者与另一种碳源结合使用有机酸例如乙酸和柠檬酸。

作为氮源，使用氨，铵盐例如硫酸铵，碳酸铵，氯化铵，磷酸铵和乙酸铵和各种硝酸盐等。

作为有机痕量营养，使用氨基酸，维生素，脂肪酸，核酸，含有这些物质的物质例如蛋白胨，酪蛋白水解氨基酸，酵母提取液和大豆蛋白降解产物。当使用需要氨基酸等进行代谢和生长的营养突变型菌株时，必须补充需要的营养。

作为无机盐，使用磷酸盐，镁盐，钙盐，铁盐，锰盐等。

作为培养方法，通常进行20-42℃通气培养，条件是将pH调节为预定值。

培养结束后，可以通过离心、过滤等收集培育物中沉淀的L-谷氨酸。也可以通过已知方法收集溶解于培养基中的L-谷氨酸。例如，可以通过浓缩液体培养基使其结晶或者通过离子交换层析等分离L-谷氨酸。也可使溶解于培养基中的L-谷氨酸结晶，然后和结晶的L-谷氨酸一起收集液体培养基中沉淀的L-谷氨酸。

在超饱和浓度L-谷氨酸沉淀的实施方案中，溶解于培养基中的L-谷氨酸的浓度保持恒定水平。因此，可以减少高浓度的L-谷氨酸对微生物的影响。因此，也可能培养具有进一步改进L-谷氨酸-生产能力的微生物。此外，因为L-谷氨酸作为结晶体沉淀，L-谷氨酸的积累对液体培养基的酸化作用被抑制，因此，显著减少了保持培养基pH所使用的碱量。

实施例

下面将参照下面的实施例更具体地解释本发明。在实施例中，除非另有说明，氨基酸是L-氨基酸。

参考实施例1

<1>酸性环境中具有L-谷氨酸抗性的微生物的筛选

如下进行酸性环境中具有L-谷氨酸抗性的微生物的筛选。将从包括土壤，水果，植株体，河流水等的自然界中获得的大约500份样品每一份一(1)克悬浮在5毫升无菌水中，将其200微升包覆在用盐酸调节至pH4.0的20毫升固体培养基上。该培养基的成分如下：3克/升葡萄糖，1克/升硫酸铵，0.2克/升硫酸镁七水合物，0.5克/升磷酸二氢钾，0.2克/升氯化钠，0.1克/升氯化钙二水合物，0.01克/升硫酸亚铁七水合物，0.01克/升硫酸锰四水合物，0.72毫克/升硫酸锌二水合物，0.64毫克/升硫酸铜五水合物，0.72毫克/升氯化钴六水合物，0.4毫克/升硼酸，1.2毫克/升钼酸钠二水合物，50微克/升生物素，50微克/升泛酸钙，50微克/升叶酸，50微克/升肌醇，50微克/升烟酸，50微克/升对-氨基苯甲酸，50微克/升吡哆醇盐酸盐，50微克/升核黄素，50微克/升硫胺素盐酸盐，50毫克/升环己酰亚胺和20克/升琼脂。

在28℃，37℃或50℃下将铺有上述样品的培养基培养2-4天并且获得378个形成菌落的菌株。

接着，将如上所述获得的每一个菌株接种于长16.5厘米直径14毫米的含有3毫升含有饱和浓度L-谷氨酸的液体培养基(用盐酸调节到pH4.0)的试管中，并且在28℃，37℃或50℃下震荡培养24小时至三天。然后，筛选生长的菌株。上述培养基的成分如下：40克/升葡萄糖，20克/升硫酸铵，0.5克/升硫酸镁七水合物，2克/升磷酸二氢钾，0.5克/升氯化钠，0.25克/升氯化钙二水合物，0.02克/升硫酸亚铁七水合物，0.02克/升硫酸锰四水合物，0.72毫克/升硫酸锌二水合物，0.64毫克/升硫酸铜五水合物，0.72毫克/升氯化钴六水合物，0.4毫克/升硼酸，1.2毫克/升钼酸钠二水合物和2克/升酵母提取物。

因此，成功获得表现出酸性环境中具有L-谷氨酸抗性的微生物78株。

<2>从酸性环境中具有L-谷氨酸抗性的微生物筛选表现出卓越生长速度的菌株

将如上所述获得的酸性环境中具有L-谷氨酸抗性的各微生物分别接种于长16.5厘米直径14毫米的含有3毫升培养基(用盐酸调节到pH4.0)的试管中，这培养基是通过向M9培养基(Sambrook，J.，Fritsh，E.F.和Maniatis，T.，分子克隆(Molecular Cloning)，冷泉港实验出版社，美国，1989)加入20克/升谷氨酸和2克/升葡萄糖获得的，随着时间进程测定该培养基的浊度来筛选表现出好的生长速度的菌株。作为结果，作为表现出好的生长的菌株，从日本Iwata-shi，Shizuoka的土壤获得AJ13355。根据其上述细菌学特征确定该菌株是成团肠杆菌。

<3>从成团肠杆菌AJ13355菌株获得较少粘液分泌的菌株

因为当在含有糖的培养基中培养时成团肠杆菌AJ13355菌株胞外分泌粘液，所以操作效率是不好的。因此，通过紫外线照射方法(Miller J.H.等，细菌遗传学短训班(A Short Course in Bacterial Genetics)，p.150，1992冷泉港实验出版社，美国)获得较少粘液分泌的菌株。

在距离60-W紫外灯60厘米的地方用紫外线照射成团肠杆菌AJ13355菌株2分钟并且在LB培养基中培养过夜以固定突变作用。用含有5克/升葡萄糖和20克/升琼脂的LB培养基稀释并接种诱变的菌株，这样每个平板将出现大约100个菌落并且将平板倾斜大约45度在30℃下培养过夜，然后筛选不流下粘液的20个菌落。

从上述菌株筛选出SC17菌株作为满足下列条件的菌株：即使在含有5克/升葡萄糖和20克/升琼脂的LB培养基中传代5次之后没有出现回复突变型，和在LB培养基、含有5克/升葡萄糖的LB培养基和补充有20克/升L-谷氨酸和2克/升葡萄糖并且用盐酸调节到pH4.5的M9培养基(Sambrook，J.，等，分子克隆(Molecular Cloning)，第二版，冷泉港出版社，美国，1989)中应出现与亲株等同生长。

<4>从成团肠杆菌SC17菌株构建谷氨酸-生产细菌

(1)从成团肠杆菌SC17菌株构建缺少αKGDH的菌株

从成团肠杆菌SC17菌株制备缺少αKGDH的并且具有增强的L-谷氨酸生物合成系统的菌株。

(i)成团肠杆菌AJ13355菌株的αKGDH基因(下文称之为“sucAB”)克隆

通过筛选补充大肠埃希氏杆菌的缺少αKGDH-E1亚单位基因(下文称之为“sucA”)的菌株的乙酸-非同化性质的DNA片段，从成团肠杆菌AJ13355菌株的染色体DNA克隆成团肠杆菌AJ13355菌株的sucAB基因。

通过常规用于从大肠埃希氏杆菌提取染色体DNA的方法(生物工程实验教科书(Text for Bioengineering Experiments)，生物科学和生物工程学会编著，日本，pp.97-98，Baifukan，1992)分离成团肠杆菌AJ13355菌株的染色体DNA。用作载体的pTWV228(抗氨苄青霉素)是Takara Shuzo有限公司的商业产品。

用EcoT221消化的AJ13355菌株的染色体DNA和用PstI消化的pTWV228用T4连接酶连接并且用来转化sucA-缺少大肠埃希氏杆菌JRG465菌株(Herbert，J.等，分子基因遗传学(Mol.Gen.Genetics)105，182(1969))。从上面获得的转化株筛选在乙酸盐基本培养基中生长的菌株，并且从其中提取质粒并且记作pTWVEK101。除了乙酸-非同化性质之外，携带pTWVEK101的大肠埃希氏杆菌JRG465菌株恢复琥珀酸或L-赖氨酸和L-甲硫氨酸的营养缺陷型。这提示pTWVEK101包含成团肠杆菌的sucA基因。

图1给出来自成团肠杆菌的pTWVEK101中的DNA片段的限制酶图谱。在图1的影线部分的核苷酸序列中，发现被认为是两个全长ORF的核苷酸序列和两个被认为是OFR的部分序列的核苷酸序列。作为对它们的同源性检索的结果，发现测定其核苷酸序列的部分包含琥珀酸脱氢酶铁-硫蛋白质基因(sdhB)的3’末端部分序列，全长sucA和αKGDH-E2亚基基因(sucB基因)，和琥珀酰基CoA合成酶β亚单位基因(sucC基因)的5’末端部分序列。图2-5给出了从这些核苷酸序列推导出的氨基酸序列与来自大肠埃希氏杆菌的氨基酸序列的比较结果(欧洲生物化学杂志(Eur.J.Biochem.)141，pp.351-359(1984)；欧洲生物化学杂志(Eur.J.Biochem.)141，pp.361-374(1984)；生物化学(Biochemistry)24，pp.6245-6252(1985))。因此，这些氨基酸序列彼此间表现出非常高的同源性。另外，发现和在大肠埃希氏杆菌中一样在成团肠杆菌的染色体上形成了sdhB-sucA-sucB-sucC簇(欧洲生物化学杂志(Eur.J.Biochem.)141，pp.351-359(1984)；欧洲生物化学杂志(Eur.J.Biochem.)141，pp.361-374(1984)；生物化学(Biochemistry)24，pp.6245-6252(1985))。

(ii)从成团肠杆菌SC17菌株获得αKGDH-缺陷菌株

通过使用如上所述获得的成团肠杆菌的sucAB基因进行同源重组获得成团肠杆菌的αKGDH-缺陷菌株。

用SphI消化pTWVEK101切除包含sucA的片段之后，用克列诺片段(TakaraShuzo有限公司)使该片段平端化，并且通过使用T4 DNA连接酶(Takara Shuzo有限公司)与用EcoRI消化和用克列诺片段平端化的pBR322相连接。得到的质粒通过使用酶在大约位于sucA的中心的限制酶BglII识别位点被消化，用克列诺片段平端化，然后通过使用T4 DNA连接酶再次连接。认为sucA基因变得没有功能，因为通过上述方法新构建的质粒的sucA中导入了移码突变。

如上所述构建的质粒用限制酶ApaLI消化，并且进行琼脂糖凝胶电泳来回收包含导入了移码突变的sucA和来自pRB322的四环素抗性基因的DNA片段。通过使用T4 DNA连接酶再次连接回收的DNA片段来构建用于破坏αKGDH基因的质粒。

使用如上所述获得的破坏αKGDH基因的质粒通过电穿孔转化成团肠杆菌SC17菌株(Miller J.H.，细菌遗传学短训班(A Short Course in Bacterial Genetics)手册，p.279冷泉港实验出版社，美国，1992)，并且通过使用四环素抗性作为标记物获得通过同源重组用质粒的突变型置换染色体上的sucA的菌株。该得到的菌株记为SC17sucA菌株。

为了证明该SC17sucA菌株缺少αKGDH活性，用Reed等的方法(Reed L.J.和Mukherjee B.B.，酶学方法(Methods in Enzymology)13，pp.55-61(1969))通过使用LB培养基中培养至对数生长期的菌株的细胞来测定αKGDH活性。作为结果，从SC17菌株测得αKGDH活性为0.073(ΔABS/分钟/毫克蛋白质)，而从SC17sucA菌株没有测得αKGDH活性，因此证明，正如所期望地消除了sucA。

(2)成团肠杆菌SC17sucA菌株L-谷氨酸生物合成系统的增强

接着将来自大肠埃希氏杆菌的柠檬酸合成酶基因，磷酸烯醇丙酮酸羧化酶和谷氨酸脱氢酶基因导入SC17sucA菌株。

(i)制备具有来自大肠埃希氏杆菌的gltA基因，ppc基因和gdhA基因的质粒

参照图6和7解释具有gltA基因，ppc基因和gdhA基因的质粒的制备方法。

用HindIII和SphI消化具有来自大肠埃希氏杆菌的gdhA基因的质粒，pBRGDH(日本专利申请Laid-openNo.7-203980)，通过T4 DNA聚合酶处理将两个末端平端化，然后纯化并且回收具有gdhA基因的DNA片段。分别地，用XbaI消化具有来自大肠埃希氏杆菌的gdhA基因和ppc基因的质粒，pMWCP(WO97/08294)，然后通过使用T4 DNA聚合酶将两个末端平端。将其与上述纯化的具有gdhA基因的DNA片段混合并且通过使用T4连接酶连接来获得质粒pMWCPG，其相应于进一步包含gdhA基因的pMWCP(图6)。

同时，用NotI消化具有广谱宿主范围质粒RSF1010的复制起点的质粒pVIC40(日本专利申请公开号8-047397)，用T4 DNA聚合酶处理并且用PstI消化。pBR322用EcoT14I消化，用T4 DNA聚合酶处理并且用PstI消化。将这两种产物混合并且通过使用T4连接酶连接来获得具有RSF1010的复制起点和四环素抗性基因的质粒RSF-Tet(图7)。

接着，用EcoRI和PstI消化pMWCPG，并且纯化和回收具有gltA基因，ppc基因和gdhA基因的DNA片段。类似地，用EcoRI和PstI消化RSF-Tet，并且纯化和回收具有RSF1010的复制起点的DNA片段。将这两种产物混合并且通过使用T4连接酶连接来获得质粒RSFCPG，其相应于包含gltA基因，ppc基因和gdhA基因的RSF-Tet(图8)。根据补充来自大肠埃希氏杆菌的gltA基因-，ppc基因-或gdhA基因-缺陷菌株的营养缺陷型和各种酶活性的测定证实获得的质粒RSFCPG表达gltA基因，ppc基因和gdhA基因。

(ii)具有来自乳发酵短杆菌gltA基因的质粒的制备

如下构建具有来自乳发酵短杆菌gltA基因的质粒。通过使用以谷氨酸棒状杆菌gltA基因(微生物学(Microbiology)140，pp.1817-1828(1994))的核苷酸序列为基础制备的引物DNA，和乳发酵短杆菌ATCC13869的DNA为模板，进行PCR，来获得大约3kb的gltA基因片段。将该片段插入用SmaI消化过的质粒pHSG399(购自Takara Shuzo有限公司)，获得质粒pHSGCB(图9)。接着，用HindIII消化pHSGCB，并且将切下的大约3kb的gltA基因片段插入用HindIII消化过的质粒pSTV29(购自Takara Shuzo有限公司)，获得质粒pSTVCB(图9)。通过测定成团肠杆菌AJ13355菌株中的酶活性证实得到的质粒pSTVCB表达gltA基因。

(iii)将RSFCPG和pSTVCB导入SC17sucA菌株

通过电穿孔用RSFCPG转化成团肠杆菌SC17 sucA菌株获得表现出四环素抗性的转化体SC17 sucA/RSFCPG菌株。此外，通过电穿孔用pSTVCB转化SC17 sucA/RSFCPG菌株获得表现出氯霉素抗性的转化体SC17 sucA/RSFCPG+pSTVCB菌株。

<5>获得在低pH下对L-谷氨酸具有改进的抗性的菌株

从成团肠杆菌SC17 sucA/RSFCPG+pSTVCB菌株分离出在低pH下对高浓度L-谷氨酸具有改进的抗性的菌株(下文也称之为“低pH下具有高浓度L-谷氨酸抗性的菌株”)。

用盐水洗涤过的细胞适当稀释并在LBG培养基(10克/升胰蛋白胨，5克/升酵母提取液，10克/升氯化钠，5克/升葡萄糖)中30℃下将SC17 sucA/RSFCPG+pSTVCB菌株培养过夜，并且在M9-E培养基(4克/升葡萄糖，17克/升磷酸氢二钠12水合物，3克/升磷酸二氢钾，0.5克/升氯化钠，1克/升氯化铵，10mM MgSO₄，10μM CaCl₂，50毫克/升L-赖氨酸，50毫克/升L-甲硫氨酸，50毫克/升DL-二氨基庚二酸，25毫克/升四环素，25毫克/升氯霉素，30克/升L-谷氨酸，用氨水调节到pH4.5)平板上平板培养。获得32℃下培养2天之后出现的菌落，是低pH下具有高浓度Glu-抗性的菌株。

关于获得的菌株，测定M9-E液体培养基中的生长水平并且在含有5毫升L-谷氨酸生产试验培养基(40克/升葡萄糖，20克/升硫酸铵，0.5克/升硫酸镁七水合物，2克/升磷酸二氢钾，0.5克/升氯化钠，0.25克/升氯化钙二水合物，0.02克/升硫酸亚铁七水合物，0.02克/升硫酸锰四水合物，0.72毫克/升硫酸锌二水合物，0.64毫克/升硫酸铜五水合物，0.72毫克/升氯化钴六水合物，0.4毫克/升硼酸，1.2毫克/升钼酸钠二水合物，2克/升酵母提取物，200毫克/升L-赖氨酸盐酸盐，200毫克/升L-甲硫氨酸，200毫克/升DL-α，ε-二氨基庚二酸，25毫克/升四环素盐酸盐和25毫克/升氯霉素)的50-毫升容积的大实验试管中测试L-谷氨酸-生产能力。表现出最佳生长水平和与亲株SC17 sucA/RSFCPG+pSTVCB菌株相同的L-谷氨酸-生产能力的菌株被指定为成团肠杆菌AJ13601。AJ13601菌株于1999年8月18日保藏在通商产业省工业技术院国立生命科学和人体技术研究所(现在是国家高级科技学院，国际专利生物保藏中心；中心6，Higashi 1-1-1，Tsukuba-shi，Ibaraki305-8566，日本)，被接受的保藏号是FERMP-17516。其然后于2000年7月6日被转移到为布达佩斯条约承认的一个国际保藏，被接受的保藏号为FERM BP-7207。

实施例1：在酸性pH下有机酸抑制生长

尽管成团肠杆菌AJ13601菌株在自中性pH至酸性pH的宽pH范围内能够生长，但是，有机酸对生长的抑制作用在酸性pH下特别显著。因此，在酸性pH下进行涉及一种有机酸对生长抑制作用的实验。

在30℃下在含有25毫克/升四环素盐酸盐和25毫克/升氯霉素的LBG琼脂培养基(10克/升胰蛋白胨，5克/升酵母提取液，10克/升氯化钠和15克/升琼脂)上培养成团肠杆菌AJ13601 14小时，并且取出一白金环的细胞并且接种到1升容积小型发酵罐中含有下面成分的300毫升菌种培养培养基中，在34℃pH6.0下进行菌种培养。

[菌种培养培养基的组成]

50克/升蔗糖，0.4克/升硫酸镁七水合物，4.0克/升硫酸铵，2.0克/升磷酸二氢一钾，4.0克/升酵母提取物，0.01克/升硫酸亚铁七水合物，0.01克/升硫酸锰五水合物，0.4克/升L-赖氨酸盐酸盐，0.4克/升DL-甲硫氨酸，0.4克/升DL-α，ε-二氨基庚二酸，25毫克/升四环素盐酸盐和25毫克/升氯霉素。

在培养期间通过通入氨气控制pH。通过发现在菌种培养培养基中糖的减少作为标记来终止菌种培养，并且以主要培养培养基体积的20％的量将菌种培养液体培养基接种到盛于1升容积小型发酵罐中的300毫升主要培养培养基中来进行主要培养。下面给出主要培养培养基的成分。当进行有机酸对生长的抑制作用的实验时，通过以预定浓度加入有机酸来进行实验。

[主要培养培养基的组成]

20克/升葡萄糖，0.4克/升硫酸镁七水合物，5.0克/升硫酸铵，6.0克/升磷酸二氢一钾，1.5克/升氯化钠，0.01克/升硫酸亚铁七水合物，0.01克/升硫酸锰五水合物，0.8克/升L-赖氨酸盐酸盐，0.6克/升DL-甲硫氨酸，0.6克/升DL-α，ε-二氨基庚二酸，25毫克/升四环素盐酸盐，25毫克/升氯霉素，6.0克/升酵母提取液和0.75克/升氯化钙二水合物。

将培养温度调节到34℃，通过加入氨气将pH控制为预定pH。

首先用各种有机酸进行在酸性pH(pH4.5)下的生长抑制效果实验。通过以0.5克/升的浓度向主要培养培养基加入各种甲酸，乙酸，乳酸，丙酸，戊酸，琥珀酸，富马酸，马来酸，草酰乙酸和柠檬酸来进行实验。图10中给出了这些实验的结果的一部分。

这些结果证明，甲酸，乙酸和丙酸表现出显著的生长抑制。另一方面，乳酸使得生长速度可与没有补充有机酸的对照培养基相比(除此之外，柠檬酸，富马酸，和马来酸都不表现出生长抑制作用)。也报道因为在酸性pH条件下失去电荷的有机酸穿过细胞质膜并且在中性pH条件下在细胞内再次解离，引起有机酸在酸性pH条件下对微生物的生长抑制作用，通过使用有机酸的解离常数pKa来解释该概念。

表1

有机酸	pKa	生长抑制作用
有机酸	pKa	生长抑制作用	甲酸	3.75	观察到
乳酸	3.86	没有观察到	甲酸	3.75	观察到
乳酸	3.86	没有观察到	柠檬酸	4.21	没有观察到
乙酸	4.76	观察到	柠檬酸	4.21	没有观察到
乙酸	4.76	观察到	丙酸	4.87	观察到

但是，以pKa为基础不能解释上述实验的结果，甲酸，乙酸和丙酸对成团肠杆菌AJ13601的生长抑制作用被认为是另一种抑制机理引起的，先前报道的概念不能解释该机理。

然后，通过使用甲酸(浓度：0.5克/升)研究引起生长抑制作用的pH。结果如图11所示。5.5或更大的pH范围内没有发现甲酸对生长的抑制作用，但是在低于该值的pH下观察到了，这一点很清楚。特别地，在pH4.5下，很难发现细胞的生长。

此外，也研究了pH4.5条件下引起生长抑制作用的甲酸浓度。结果如图12所示。这些结果清楚地表明，当培养基中甲酸的浓度是0.20克/升或更小时没有发现生长抑制作用，但是在高于0.2-0.5克/升范围内的某一水平的浓度下观察到了生长抑制作用。

以上述实验结果为基础得出结论，为了使能够在酸性pH下利用含有有机酸的碳源(糖)，例如甜菜糖蜜和甘蔗糖蜜，和氮源，例如玉米浆(CSL)、大豆蛋白水解液、动物蛋白水解液(肉提取物)和酪蛋白水解产物，来培养成团肠杆菌AJ13601菌株，需要降低培养基中表现出抑制作用的有机酸例如甲酸和乙酸的浓度，或者为了在酸性pH下产生L-谷氨酸，需要一种培养方法，包括在没有发现生长抑制作用的pH范围内培养细胞使得表现出抑制作用的有机酸被消耗，然后在变换的酸性pH下培养细胞，如下文提到的实施例2所述。

实施例2：通过pH变换培养减少有机酸的生长抑制作用

正如实施例1所证实的，在酸性pH下小分子有机酸例如甲酸抑制成团肠杆菌AJ13601菌株的细胞生长。因此，因为很多这样的天然粗材料，包括甜菜糖蜜和甘蔗糖蜜，含有大量的这样的有机酸，因此使用天然粗材料在酸性pH下不能培养成团肠杆菌AJ13601菌株。但是，因为只有在酸性pH下观察到有机酸对生长的抑制作用，而在中性pH下没有观察到，所以尝试通过在中性pH下进行培养以便培养早期消耗引起生长抑制作用的有机酸，然后将pH变换为酸性pH来生产谷氨酸，以此来生产谷氨酸。

在30℃下在含有25毫克/升四环素盐酸盐和25毫克/升氯霉素的LBG琼脂培养基(10克/升胰蛋白胨，5克/升酵母提取液，10克/升氯化钠和15克/升琼脂)上培养成团肠杆菌AJ13601 14小时，取出一白金环的细胞并且接种到1升容积小型发酵罐中含有下面成分的300毫升菌种培养培养基中，在34℃pH6.0下进行菌种培养。

[菌种培养培养基的组成]

在培养期间通过通入氨气控制pH。通过在菌种培养培养基观察糖的耗尽作为标记来终止菌种培养，并且以主要培养培养基体积的20％的量将菌种液体培养基接种到1升容积小型发酵罐中含有的300毫升主要培养培养基中来进行主要培养。下面给出主要培养培养基的成分。

[主要培养培养基的组成]

20克/升甜菜糖蜜(或甘蔗糖蜜)，0.4克/升硫酸镁七水合物，5.0克/升硫酸铵，6.0克/升磷酸二氢一钾，1.5克/升氯化钠，0.01克/升硫酸亚铁七水合物，0.01克/升硫酸锰五水合物，0.8克/升L-赖氨酸盐酸盐，0.6克/升DL-甲硫氨酸，0.6克/升DL-α，ε-二氨基庚二酸，25毫克/升四环素盐酸盐，25毫克/升氯霉素，6.0克/升酵母提取液和0.75克/升氯化钙二水合物。

将培养温度调节到34℃，并且通过加入氨气将pH控制为预定pH值。在pH6.0下开始培养并且进行到主要培养培养基中的糖和有机酸被消耗。糖耗尽之后，连续加入700克/升葡萄糖水溶液(5毫升/小时)。连续加入葡萄糖的同时，控制氨气的加入量并且经大约2小时利用与谷氨酸产生有关的pH减小将pH降低至4.5的水平，然后，在pH4.5下继续培养，当液体培养基中谷氨酸浓度达到45克/升时，向主要培养培养基中加入1.0克谷氨酸晶体作为晶种来促进液体培养基中晶体的沉淀。

作为培养50小时的结果，小型发酵罐中沉淀出大量谷氨酸晶体。然后通入氨气使得将pH提高至6.0来溶解在小型发酵罐中的全部谷氨酸结晶，然后测定制备的谷氨酸的量。此外，以上述相同方式进行培养，除了在培养早期就将pH保持在4.5，并测定制备的谷氨酸的量。在这种情况下，因为细胞减少，培养在28小时内终止。表2给出了结果。

表2：发酵结果的比较

培养方法	OD(X101)	制备的谷氨酸的量(克)
培养方法	OD(X101)	制备的谷氨酸的量(克)	pH变换	0.753	50.4
pH恒定(4.5)	0.078	2.6	pH变换	0.753	50.4

此外，以620nm波长下的光密度(OD)为基础测定细胞的生长时间进程。图13给出了结果。

作为结果发现，从培养早期在酸性pH下进行培养的实验中，细胞生长受到抑制，因此很难观察到L-谷氨酸产生，而利用pH变换进行培养的实验中，在液体培养基中沉淀出谷氨酸晶体，因此证明该方法中可以使用含有有机酸的天然粗材料。

从上述结果证明，利用pH变换进行培养使得可能在酸性pH下沉淀出谷氨酸晶体进行培养，即使使用含有有机酸的天然粗材料也是如此。

序列表

<110>味之素株式会社(Ajinomoto Co.，Inc.)

<120>生产L-谷氨酸的方法

<130>

<140>JP 2001-44135

<141>2001-02-20

<160>8

<210>1

<211>935

<212>PRT

<213>成团肠杆菌(Enterobacter agglomerans)

<400>1

Met Gln Asn Ser Ala Met Lys Pro Trp Leu Asp Ser Ser Trp Leu Ala

1 5 10 15

Gly Ala Asn Gln Ser Tyr Ile Glu Gln Leu Tyr Glu Asp Phe Leu Thr

20 25 30

Asp Pro Asp Ser Val Asp Ala Val Trp Arg Ser Met Phe Gln Gln Leu

35 40 45

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50 55 60

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65 70 75 80

Thr Asp Pro Ala Thr Asn Ser Lys Gln Val Lys Val Leu Gln Leu Ile

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100 105 110

Gly Leu Trp Lys Gln Asp Arg Val Ala Asp Leu Asp Pro Ala Phe His

115 120 125

Asp Leu Thr Asp Ala Asp Phe Gln Glu Ser Phe Asn Val Gly Ser Phe

130 135 140

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Lys Gln Thr Tyr Cys Gly Ser Ile Gly Ala Glu Tyr Met His Ile Asn

165 170 175

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210 215 220

Gly Ala Lys Arg Phe Ser Leu Glu Gly Gly Asp Ala Leu Val Pro Met

225 230 235 240

Leu Arg Glu Met Ile Arg His Ala Gly Lys Ser Gly Thr Arg Glu Val

245 250 255

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Leu Gly Lys Lys Pro Gln Asp Leu Phe Asp Glu Phe Ser Gly Lys His

275 280 285

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Asn Pro Ser His Leu Glu Ile Val Ser Pro Val Val Met Gly Ser Val

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435 440 445

Asp Val Phe Ile Asp Leu Val Cys Tyr Arg Arg His Gly His Asn Glu

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465 470 475 480

Lys His Pro Thr Pro Arg Lys Ile Tyr Ala Asp Arg Leu Glu Gly Glu

485 490 495

Gly Val Ala Ser Gln Glu Asp Ala Thr Glu Met Val Asn Leu Tyr Arg

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Asp Ala Leu Asp Ala Gly Glu Cys Val Val Pro Glu Trp Arg Pro Met

515 520 525

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545 550 555 560

Leu Arg Ile Ser Gln Val Pro Glu Gln Ile Glu Val Gln Ser Arg Val

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675 680 685

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Gln Gly Ala Trp Tyr Cys Ser Gln His His Phe Arg Asp Val Val Pro

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<210>2

<211>407

<212>PRT

<213>成团肠杆菌(Enterobacter agglomerans)

<400>2

Met Ser Ser Val Asp Ile Leu Val Pro Asp Leu Pro Glu Ser Val Ala

1 5 10 15

Asp Ala Thr Val Ala Thr Trp His Lys Lys Pro Gly Asp Ala Val Ser

20 25 30

Arg Asp Glu Val Ile Val Glu Ile Glu Thr Asp Lys Val Val Leu Glu

35 40 45

Val Pro Ala Ser Ala Asp Gly Val Leu Glu Ala Val Leu Glu Asp Glu

50 55 60

Gly Ala Thr Val Thr Ser Arg Gln Ile Leu Gly Arg Leu Lys Glu Gly

65 70 75 80

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115 120 125

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Ala Pro Ala Ala Gly Ala Ala Thr Ala Gln Gln Pro Val Ala Asn Arg

165 170 175

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180 185 190

Arg Leu Leu Glu Ala Lys Asn Ser Thr Ala Met Leu Thr Thr Phe Asn

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Gly Asn Phe Thr Ile Thr Asn Gly Gly Val Phe Gly Ser Leu Met Ser

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405

<210>3

<211>41

<212>PRT

<213>成团肠杆菌(Enterobacter agglomerans)

<400>3

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1 5 10 15

Met Pro Ala Pro Thr Gly Tyr Ala Cys Thr Thr Pro Arg Glu Ala Glu

20 25 30

Glu Ala Ala Ser Lys Ile Gly Ala Gly

35 40

<210>4

<211>39

<212>PRT

<213>成团肠杆菌(Enterobacter agglomerans)

<400>4

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1 5 10 15

Cys Pro Lys Gly Leu Asn Pro Thr Arg Ala Ile Gly His Ile Lys Ser

20 25 30

Met Leu Leu Gln Arg Ser Ala

35

<210>5

<211>933

<212>PRT

<213>大肠埃希氏杆菌(Escherichia coli)

<400>5

Met Gln Asn Ser Ala Leu Lys Ala Trp Leu Asp Ser Ser Tyr Leu Ser

1 5 10 15

Gly Ala Asn Gln Ser Trp Ile Glu Gln Leu Tyr Glu Asp Phe Leu Thr

20 25 30

Asp Pro Asp Ser Val Asp Ala Asn Trp Arg Ser Thr Phe Gln Gln Leu

35 40 45

Pro Gly Thr Gly Val Lys Pro Asp Gln Phe His Ser Gln Thr Arg Glu

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Tyr Phe Arg Arg Leu Ala Lys Asp Ala Ser Arg Tyr Ser Ser Thr Ile

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485 490 495

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805 810 815

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820 825 830

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835 840 845

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850 855 860

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885 890 895

Ala Ser Leu Arg Tyr Ala Gly Arg Pro Ala Ser Ala Ser Pro Ala Val

900 905 910

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Ala Leu Asn Val Glu

930

<210>6

<211>405

<212>PRT

<213>大肠埃希氏杆菌(Escherichia coli)

<400>6

Met Ser Ser Val Asp Ile Leu Val Pro Asp Leu Pro Glu Ser Val Ala

1 5 10 15

Asp Ala Thr Val Ala Thr Trp His Lys Lys Pro Gly Asp Ala Val Val

20 25 30

Arg Asp Glu Val Leu Val Glu Ile Glu Thr Asp Lys Val Val Leu Glu

35 40 45

Val Pro Ala Ser Ala Asp Gly Ile Leu Asp Ala Val Leu Glu Asp Glu

50 55 60

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145 150 155 160

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165 170 175

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180 185 190

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210 215 220

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225 230 235 240

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245 250 255

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260 265 270

Val Ser Thr Pro Arg Gly Leu Val Thr Pro Val Leu Arg Asp Val Asp

275 280 285

Thr Leu Gly Met Ala Asp Ile Glu Lys Lys Ile Lys Glu Leu Ala Val

290 295 300

Lys Gly Arg Asp Gly Lys Leu Thr Val Glu Asp Leu Thr Gly Gly Asn

305 310 315 320

Phe Thr Ile Thr Asn Gly Gly Val Phe Gly Ser Leu Met Ser Thr Pro

325 330 335

Ile Ile Asn Pro Pro Gln Ser Ala Ile Leu Gly Met His Ala Ile Lys

340 345 350

Asp Arg Pro Met Ala Val Asn Gly Gln Val Glu Ile Leu Pro Met Met

355 360 365

Tyr Leu Ala Leu Ser Tyr Asp His Arg Leu Ile Asp Gly Arg Glu Ser

370 375 380

Val Gly Phe Leu Val Thr Ile Lys Glu Leu Leu Glu Asp Pro Thr Arg

385 390 395 400

Leu Leu Leu Asp Val

405

<210>7

<211>60

<212>PRT

<213>大肠埃希氏杆菌(Escherichia coli)

<400>7

Met Asn Leu His Glu Tyr Gln Ala Lys Gln Leu Phe Ala Arg Tyr Gly

1 5 10 15

Leu Pro Ala Pro Val Gly Tyr Ala Cys Thr Thr Pro Arg Glu Ala Glu

20 25 30

Glu Ala Ala Ser Lys Ile Gly Ala Gly Pro Trp Val Val Lys Cys Gln

35 40 45

Val His Ala Gly Gly Arg Gly Lys Ala Gly Gly Val

50 55 60

<210>8

<211>58

<212>PRT

<213>大肠埃希氏杆菌(Escherichia coli)

<400>8

Phe Leu Ile Asp Ser Arg Asp Thr Glu Thr Asp Ser Arg Leu Asp Gly

1 5 10 15

Leu Ser Asp Ala Phe Ser Val Phe Arg Cys His Ser Ile Met Asn Cys

20 25 30

Val Ser Val Cys Pro Lys Gly Leu Asn Pro Thr Arg Ala Ile Gly His

35 40 45

Ile Lys Ser Met Leu Leu Gln Arg Asn Ala

50 55

Claims

1. 一种通过发酵制备L-谷氨酸的方法，其包括在pH值为3.0-5.0的培养基中培养具有L-谷氨酸-生产能力的微生物，其中甲酸、乙酸和丙酸的总含量是0.4g/L或更少。

2. 根据权利要求1的方法，其中在培养基中培养期间在培养基中产生并积累L-谷氨酸伴随有L-谷氨酸的沉淀。

3. 根据权利要求1的方法，其中所述微生物属于肠杆菌属。

4. 根据权利要求3的方法，其中所述微生物是成团肠杆菌。

5. 根据权利要求1的方法，其中微生物能够在pH是5.0或更小代谢含有饱和浓度的L-谷氨酸的液体培养基中的碳源，并且具有以超过L-谷氨酸在该液体培养基中在该pH下的饱和浓度的量积累L-谷氨酸的能力。

6. 根据权利要求1-5的任一项的方法，其中在pH 5.0-8.0培养所述微生物，然后在pH 3.0-5.0培养所述微生物。

7. 根据权利要求6的方法，其中在进行在pH 5.0-8.0培养时通过向培养基中加入碱化物质而将培养基的pH值保持为pH 5.0-8.0。

8. 根据权利要求7的方法，其包括在pH 5.0-8.0培养之后通过控制碱化物质的加入量来降低培养基的pH值。

9. 根据权利要求6的方法，其中在pH 5.0-8.0连续培养直到培养基中的甲酸、乙酸和丙酸被耗尽。