KR0168720B1 - 발효에 의한 l-쓰레오닌의 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 L-시스테인에 대해 요구성을 가지고 에이 이 씨(S-2-Aminoethyl-L-cysteine)와 아스파란긴산 대사길항물질인 아스파라긴산 하이드록사메이트(DL-Aspartate hydroxamate)에 대하여 내성을 가지는 변이주인 세라티아속(Serratia sp.) KFCC-10879 변이주를 분주하고 슈크로스를 주 당질로 이용하는 생산배지에서 호기적으로 배양하여 다량의 L-쓰레오닌을 제조하는 방법이다.

배양방법으로는 생산배지 및 배양중 첨가되는 추가당에 L-시스테인을 100∼500μg/ml되게 첨가하고, pH를 암모니아와 추가당을 이용 6.8∼7.2로 유지하며 추가당액을 배양액 내의 당농도가 1%미만으로 유지하여 배양액내에 많은 L-쓰레오닌을 추적시키는 것을 특징으로 한다.

Description

발표에 의한 L-쓰레오닌의 제조방법

본 발명은 미생물의 발효에 의한 L-쓰레오닌의 제조방법에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 L-시스테인을 요구하고 동시에 S-2-아미노에틸-L-시스테인(S-2-A-minoethyl-L-cysteine, 이하 에이 이 씨라 칭함)과 아스파라긴산의 대사길항물질인 DL-아스파라긴산 하이드록사메이트(Aspartate hydroxamate)에 대한 내성을 가지는 변이주를 분히라혀 슈크로스(Sucrose)등의 당류를 탄소원으로 이용, 호기적으로 배양하여 L-쓰레오닌을 제조하는 방법에 관한 것이다.

L-쓰레오닌은 필수아니노산의 일종으로서 쌀의 제2제한 아미노산이다. 지금까지 알려진 바로는 아미노산 수액제제, 종합아미노산제제의 의약용도와 식품의 영양 강화제나 건강음료등의 식품용도를 사용되고 있다. 최근에는 L-라이신과 함께 사료첨가제로도 수요가 급증하고 있는 아미노산이다.

지금까지 알려진 발효법에 의한 L-쓰레오닌의 제조방법은 상당수 공지되어 왔다. 그 예로서 세라티아속(serratia sp.) L-쓰레오닌 생산균으로부터 아스파르토키나제(Aspartokinase), 호모세린키나제(Homoserine Kinase), 호모세린디하이드로게나제(Homoserine Dehydrogenase), 쓰레오닌신타제(Threonine Synthase)의 유전정보를 함유한 디엔에이 절편을 재조합하여 다량의 쓰레오닌을 생산하는 방법으로 일본특허공보 평 5-10076호와 브레비박테리아속(Brevibacterium sp.)에서 유래한 호모세린디하드로게나제를 암호화한 유전자를 코리네박테리움속(Coryneabacterium sp.)으로 삽입하여 배양액중에 L-쓰레오닌을 축적하는 방법으로 일본특허공보 평 5-47196호가 있다.

또한 대장균(Escherichia coli)을 이용 쓰레오닌 대사길항물질에 내성을 가지고, 생육중 메치오닌이나 디아미노피멜릭산(Diaminopmelic acid)의 요구성을 가지는 균주를 이용하는 방법으로 일본특허공보 소 56-10037호, L-세린과 에사이오닌(Ethionine)에 내성을 가지는 균주를 이용하는 방법은 유럽특허 91103569.9호가 알려져 있다.

본 발명의 목적은 발효에 의한 L-쓰레오닌의 제조에 있어서, 종래의 방법보다 높은 수율로 L-쓰레오닌을 생산할 수 있는 방법을 모색하기 위한 것이다.

본 발명에 이용한 균주의 분리방법은 본 발명자들이 L-쓰레오닌 생산에 이용 해오던 L-시스테인 요구주이며, 에이 이 씨에 내성을 가지는 세라티아속 SW9410(KFCC-10848)을 친주로하여 통상의 변이처리방법에 의해 얻은 변이주중 L-시스테인에 대한 요구성과 에이 이 씨와 DL-아스파라긴산 하이드록사메이트에 대한 내성을 동시에 가지는 변이주 SW9511(KFCC-10879)을 유도하였다. 이 분리주를 이용 동일 조건에서 배양할 때 친주에 비하여 다량의 L-쓰레오닌이 배양액내에 축적된다는 사실을 발견함에 따라 본 발명을 완성하게 된 것이다.

본 발명에 대하여 자세히 설명하면 다음과 같다.

본 발명의 친주인 세라티아속 SW9410 균주를 통상적인 변이처리 방법 즉 자외선 조사나 화학변이유기제인 NTG(N-메틸-N´-니트로-N-니트로소 구아니딘), DES(디에틸설페이트)로 처리하여 L-시스테인 100μg/ml 및 DL-아스파라긴산 하이드록사메이트가 1mg/ml 첨가되어 있는 최소한천평판배지에 도말하고 30℃에서 5∼6일간 배양하였다. 또한, 이 평판배지상에서 생육하는 콜로니들을 분리하여 에이 이 씨(5mM), L-시스테인(100μg/ml)을 첨가한 배지와 첨가하지 않는 2종류의 한천 평판배지에 각각 레플리카하여 친주의 균주특성변화를 확인하였다. 이와 같은 방법으로 DL-아스파라긴산 하이드록사메이트와 에이 이 씨에 내성을 가진 동시에 L-시스테인 요구성을 가진 변이주중 특성이 명확한 신균주 SW9511을 분리하여 1995년 12월 1일 사단법인 한국 종균협회에 수리번호 KFCC-10879로 기탁하였다.

이들 실험을 위한 최소액체배지조성을 슈크로스 0.5%, 유안 0.2%, 제1인산칼륨 0.1%, 황산마그네슘 0.02%, 한천 2%, pH 7.3이며 최소 한천평판배지는 최소액체배지조성에 한천을 2% 첨가한 것을 사용하였다. 또한, 변이주의 증식 및 보관 배지로서 효모엑기스 1.0%, 펩톤 1.0%, 육즙 0.3%, 염화나트륨 0.5%, 포도당 0.5%, 한천 2%, pH 7.0의 완전평판배지를 사용하였다. 이와같은 방법으로 분리하여 명명한 신균주 SW9511(KFCC-10879)은 표 1에 나타난 바와같이 0∼1mg/ml의 DL-아스파라긴산 하이드록사메이트 농도에서 명확히 내성을 가지고 있으며 친주의 특성인 L-시스테인의 요구성 및 에이 이 씨의 내성을 동시에 가진 변이주임이 확인되었다.

주(1): DL-아스파라긴산 하이드록사메이트

(2): DL-아스파라긴산 하이드록사메이트가 농도별로 첨가된 최소액체배지에서 48시간 배양한 배양액을 100배 희석하여 660nm에서 흡광도를 측정

이와같은 성질을 가지는 신균주 SW9511(KFCC-10879)을 친주인 SW9410과 L-시스테인 첨가농도별 생육 및 L-쓰레오닌의 생산성을 비교 분석한 결과는 표2.와 같다. 본 발명의 신균주는 친주인 SWW9410보다 많은량의 L-쓰레오닌을 배양액내에 축적시키는 것으로 나타났으며 L-시스테인의 첨가농도는 0∼500μg/ml, 최적농도는 300μg/ml이었다.

주(1): 생산배지(후기 실시예1 참조)에서 72시간 진탕배양한 배양종료액을 희석 660nm에서 흡광도(베크만 DU-70)측정

주(2): 배양종료액내의 L-쓰레오닌 측정량을 종이 크로마토그래피 또는, 아미노산 자동분석기(히다치 L-8500A)를 이용 분석(g/L)

아스파라긴산 대사길항물질은 일반적으로 세라티아속 미생물의 생육을 억제하고, 그 생육저해가 아스파라긴산의 첨가에 의해서 회복되는 물질 또는 L-아스파라긴산계열의 아미노산 생합성에 관여하는 효소의 억제작용 및 저해작용을 나타내고 그 억제 또는 저해가 L-아스파라긴산의 첨가에 의해 회복되는 물질이다. 이들 아스파라긴산 대사 길항물질로는 DL-아스파라긴산, 하이드록사메이트, α-메칠 아스파라긴산, β-메칠 아스파라긴산, 시스테인 설핀산등이 있다. 본 발명은 신균주가 친주에 비하여 현저하게 L-쓰레오닌을 배양액내에 축적시키는 원인에 대하여는 확실하게 밝혀지지 않았으나 본 실험에서는 DL-아스파라긴산 하이드록사메이트에 대한 내성주를 유도하여 피드백 조절이 제거된 돌연변이주를 유도한 결과 L-쓰레오닌의 축적량이 증가되었다고 판단된다.

L-쓰레오닌의 발효의 배양조건은 탄소원으로서 포도당, 원당, 폐당밀등이 사용 가능하며, 질소원으로서 암모니아가스, 암모니아수, 요소, 유안, 염화암모늄, 인산암모늄등을 이용할수 있으며, 그외 천연의 영양원과 무기금속염이 혼합된 배지면 이용이 가능하다.

본배양을 행함에 있어서 배양관리조건은 다음과 같다.

발효온도는 30℃ 내외에서 통기량은 0.8∼1.2vvm, 교반기 회전수는 500∼600rpm으로 3∼4일간 배양한다. 배양중 pH는 7.0∼7.5로 암모니아수 또는 액화 암모니아를 이용 자동조절한다.

배양 완료액내 축적된 L-쓰레오닌은 통상의 방법에 따라 이온교환수지에 흡착, 분리시켜 용리액을 얻고 여기에 에탄올을 처리하여 L-쓰레오닌 조결정을 얻는다.

이하 본 발명에 의한 L-쓰레오닌 제조방법을 실시예에서 상세히 설명하지만 이에 한정되는 것은 아니다.

[실시예 1]

사용균주: 신균주 쎄라티아속 SW9511(KFCC-10879)

전배양배지 조성: 포도당 0.5%, 효모엑기스 1.0%, 펩톤 1.0%, 염화나트륨 0.5%, 육즙 0.3%, pH .70

생산배지 조성: 슈크로스 10%, 옥수수침지액 3%, 비오틴 50μg/ml, 제이인산칼륨 0.1%, 황산제일철 2mg/L, 황산망간 2mg/L, 유안 0.5%, L-시스테인 300μg/ml, 탄산칼슘 5%(별도 멸균 첨가), pH 7.0

전배양 방법: 18 x 185mm의 시험관에 각각 5ml의 전배양 배지를 분주한 후 121℃에서 15분간 가압 살균한다. 냉각후에 신균주 SW9511(KFCC-10879)을 각각 일백금니씩 접종하여 30℃에서 20시간 분당 120회 왕복 진탕 배양한 것을 전배양액으로 한다.

생산배양 방법: 500ml 사카구찌 플라스크에 각각 70ml정도의 쓰레오닌 생산배지를 분주하고 121℃에서 15분간 가압 살균한다. 냉각후 신균주 SW9511의 전배양액을 1% 접종하여, 30℃에서 72시간 분당 120회 왕복 진탕 배양한다.

발효종료 후 배양액내의 L-쓰레오인 축적량은 19.2mg/ml였다.

[실시예 2]

사용균주: 신균주 쎄라티아속 SW9511(KFCC-10879)

1차 전배양 배지조성: 실시예 1의 전배양 배지와 동일

2차 전배양 배지조성: 슈크로스 4%, 옥수수침지액 3%, 비오틴 100μg/ml, 제이인산칼륨 0.1%, 황산제일철 2mg/L, 황산망간 2mg/L, 유안 0.05%, 요소 0.6%, L-시스테인 200μg/ml, pH 7.0

생산배지 조성:슈크로스 10%, 옥수수침지액 3%, 비오틴 50μg/ml, 제이인산칼륨 0.1%, 황산제일철 2mg/ml, 황산망간 2mg/L, 유안 0.5%, L-시스테인 300μg/ml, pH 7.0

전배양 방법: 실시예 1과 동등한 방법으로 배양된 1차 전배양액을 500ml사카구찌 플라스크에 500ml분주된 2차 전배양 배지에 1% 접종한다. 접종후 30℃에서 24시간 분당 120회 왕복 진탕배양한것을 2차 전배양액으로 한다.

생산배양 방법: 생산배지를 5L 소형 발효조에 2L 사입하고 121℃에서 15분간 가압살균한다. 냉각후 종배양액을 2% 접종하고, 교반 600RPM, 통기 0.8∼1.2VVM의 조건으로 30℃에서 72시간 배양한다. 이때 추가당은 당농도가 1-3%를 유지할 수 있도록 추가하고, pH조절은 암모니아수로서 7.0∼7.5로 유지시킨다. 발효종료 후 배양액내의 L-쓰레오닌의 축적량을 40.1mg/ml였다.

발효 종료액 1L를 원심분리하여 균체를 제거한 후 이온교환수지에 흡착, 분리 정제하여 L-쓰레오닌의 결정을 36.19g 얻었다.

[실시예 3]

사용균주: 신균주 쎄라티아속 SW9511(KFCC-10879)

1차 전배양 배지조성: 실시예 1의 전배양 배지와 동일

2차 전배양 배지조성: 실시예 2의 전배양 배지와 동일

전배양 방법: 실시예 2와 동등한 방법으로 배양

생산배양 방법: 제 조건은 실시예 2와 동등한 방법으로 행하나 당 추가방법에 있어서 초기 사입 당의 소모 시점으로부터 자동펌프를 이용 pH 7.0이상에서 당이 추가되게 하고, pH 7.0이하에서는 암모니아를 이용 전체 배양 시간동안 pH를 6.8∼7.2정도로 유지시키며, 당농도는 1%가 넘지 않도록 유지시킨다.

발효 종료후 배양액내에 쓰레오닌 축적량은 43.62mg/ml였다.

한편, 천주인 SW9410을 이용 동일 방법으로 배양했을 때 L-쓰레오닌 축적량 37.25mg/ml였다.

실시예 2와 같은 방법으로 분리, 정제한 L-쓰레오닌의 결정은 38.29mg/ml이었다.

이와같이 본 발명에 의한 신균주 세라티아속 SW9511(KFCC-10879)는 L-시스테인을 요구하고 동시에 이 씨와 DL-아스파라긴산 하이드록사메이트에 내성을 갖는 변이주로 이를 이용한 발효에 의한 L-쓰레오닌의 제조방법은 보다 고수율로 L-쓰레오닌을 수득할 수 있는 공업적으로 유용한 방법이다.

Claims (3)

1. 미생물의 발효에 의한 L-쓰레오닌의 생산에 있어서, L-시스테인을 요구하고 동시에 S-2-아미노에틸-L-시스테인(S-2-Amineothyl-L-cysteine)과 DL-아스파라긴산 하이드록사메이트(DL-Aspartate hydroxamate)에 내성을 갖는 쎄라티아(Serratia) 속 SW 9511(KFCC-10879)을 이용하여 L-쓰레오닌을 제조함을 특징으로 하는 발효에 의한 L-쓰레오닌의 제조방법.
2. 제1항에 있어서, L-시스테인을 100∼500μg/ml 되게 첨가함을 특징을 하는 발효에 의한 L-쓰레오닌의 제조방법.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, pH를 추가당과 암모니아를 이용 6.8∼7.2로 유지시키고, 당농도를 1% 미만으로 유지하면서 배양함을 특징으로 하는 발효에 의한 L-쓰레오닌의 제조방법.