KR100427480B1

KR100427480B1 - Ｌ-쓰레오닌의 제조방법

Info

Publication number: KR100427480B1
Application number: KR10-2001-0002373A
Authority: KR
Inventors: 김영철; 노갑수; 박재용; 김대철; 이진호; 옥승한
Original assignee: 씨제이 주식회사
Priority date: 2001-01-16
Filing date: 2001-01-16
Publication date: 2004-04-27
Also published as: KR20020061348A

Abstract

본 발명은 미생물을 이용하여 L-쓰레오닌을 생산함에 있어서, 이용되는 미생물의 염색체 DNA 중에 존재하는 원래의 포스포에놀 파이루베이트 카르복실레이즈(ppc) 유전자 외에 추가로 1 카피 이상의 포스포에놀 파이루베이트 카르복실레이즈 유전자가 염색체 DNA 중의 특정부위에 삽입된 것을 특징으로 하는 L-쓰레오닌의 제조방법에 관한 것이다.

본 발명에 따르면, 염색체 DNA 중에ppc유전자의 수를 2개 이상으로 늘림으로써 포스포에놀 파이루베이트로부터 쓰레오닌 생합성의 전구체인 옥살로아세테이트(oxaloacetate)로 전환해주는 효소인ppc유전자의 발현량을 증가시켜 L-쓰레오닌의 생산량을 획기적으로 향상시킬 수가 있다.

Description

Ｌ-쓰레오닌의 제조방법{Process for producing L-threonine}

본 발명은 미생물을 이용하여 L-쓰레오닌을 생산함에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 이용되는 미생물의 염색체 DNA 중에 존재하는 원래의 포스포에놀 파이루베이트 카르복실레이즈(ppc) 유전자 외에 추가로 1 카피 이상의 포스포에놀 파이루베이트 카르복실레이즈 유전자를 염색체 DNA 중의 특정부위에 삽입시킴으로써 포스포에놀 파이루베이트로부터 쓰레오닌 생합성의 전구체인 옥살로아세테이트(oxaloacetate)로 전환해주는 효소인ppc유전자의 발현량을 증가시켜 L-쓰레오닌의 생산량을 향상시키는 것을 특징으로하는 L-쓰레오닌의 제조방법에 관한 것이다.

L-쓰레오닌은 필수 아미노산의 일종으로 사료 및 식품 첨가제로 널리 사용되며 의약용으로 수액제, 의약품의 합성 원료로도 사용된다. L-쓰레오닌은 발효법으로 제조하는데 대장균, 코리네형 세균, 세라티아속 세균, 프로덴시아속 균주의 야생주로부터 유도된 인공변이주를 사용하고 있다. 이러한 변이 균주들로는 아미노산 유사체 및 약제 내성 변이주 또는 이들 내성주에 디아미노피메릭산, 메티오닌, 라이신, 이소루이신 영양요구성을 부여한 인공변이주가 공지되어 있다 (일본국 공개특허출원 제평2-219582호, Appl. Microbiol. Biotechnol., 29. 550-553 (1988), 한국특허공고 제92-8365호).

일반적으로 특정 유전자의 발현량을 높이기 위한 방법으로는, 1개의 미생물이 가지는 유전자의 수를 높여주는 방법이 있는데, 이러한 목적을 위해서는 통상 1개의 미생물당 카피 수가 높게 유지되는 플라스미드(plasmid)를 사용한다(Sambrook et al, Molecular cloning, 2 판, 1989, 1.3 ~ 1.5). 즉 플라스미드에 원하는 유전자를 삽입하고 이러한 재조합 플라스미드를 다시 미생물에 형질전환시킴으로써 1개의 미생물당 그 플라스미드의 카피 수 만큼 유전자를 늘려주는 효과를 기대할 수 있다. 이러한 방법으로 쓰레오닌의 생산성 향상을 시도하여 부분적인 성공이 보고된 바 있다 (미국특허: 5,538,873). 그러나 이러한 플라스미드를 이용한 기술은 대부분의 경우에 있어서 특정 유전자만을 지나치게 발현시킴으로써 숙주 미생물에 큰 부담으로 작용하며 재조합 균주의 배양 중에 플라스미드를 소실하게되는 플라스미드 안정성 등의 문제를 야기시킨다.

따라서 이러한 문제를 해결하고자 배양액 중에 항생제를 첨가해 주거나 발현의 조절이 가능한 플라스미드를 사용하는 방법들이 개발되었다(Sambrook et al, Molecular cloning, 2 판, 1989, 1.5 ~ 1.6, 1.9 ~ 1.11). 발현조절이 가능한 플라스미드를 사용하는 경우는 생장기에는 유전자의 발현이 일어나지 않는 조건에서배양하여 숙주 미생물에 부담을 덜어주다가 미생물이 충분히 자란 후에 일시적으로 발현을 유도함으로써 목적물을 얻는 방법이다. 그러나 이러한 플라스미드들 대부분은 최종 목적물이 단백질인 경우에만 해당된다. 목적물이 1차 대사산물인 경우는 미생물의 생장과 밀접한 관련이 있기 때문에 생장기에 목적 유전자의 발현의 효과를 보지 못하면 유전자 발현에 의한 1차 대사산물의 증가 효과를 기대하기 힘들다. 1차 대사산물의 일종인 쓰레오닌도 동일한 경우에 해당한다고 할 수 있다.

따라서 이러한 단점을 보완하기 위한 노력으로 쓰레오닌 생산을 위하여 쓰레오닌 생합성 관련 특정유전자를 염색체 DNA중에 삽입 방법이 이용된 사례가 있었다(미국특허: 5,939,307). 그러나, 이 경우는 프로모터를 인듀서블(inducible) 프로모터로 교환해 준 유전자를 염색체 중에 존재하는 동일한 유전자와 치환하는 방법을 이용하기 때문에 쓰레오닌 오페론 유전자들의 획기적인 발현 증가를 기대하기 어려웠다.

이에 본 발명자들은 종래의 치환 방법과는 달리 숙주 미생물의 염색체 중에 존재하던 원래의 유전자는 그대로 두고 추가로ppc유전자를 염색체 DNA 중의 특정 부위(lacZ 유전자 부위)에 삽입함으로써 원래 숙주 미생물이 가지고 있는 유전자의 효능을 그대로 활용하면서 염색체에 삽입된ppc유전자의 효능을 추가로 활용할 수 있다는 장점을 발견하고 본 발명을 완성하기에 이르렀다. 지금까지의 유전공학적인 방법으로 쓰레오닌 수율 향상을 위한 연구로서는 주로 옥살로아세테이트로부터 쓰레오닌에 이르는 생합성 경로에만 집중하였지만 본 발명에서는 그 앞 단계 효소인 포스포에놀 파이루베이트 카르복실레이즈의 활성을 강화시킴으로써 포스포에놀파이루베이트로부터 탄소의 흐름을 우선적으로 옥살로아세테이트 경로로 유도하고자 하였다. 또한 본 발명은 원하는 경우 2 카피 이상의 유전자의 삽입도 가능하다는 특징을 가지고 있다.

따라서, 본 발명의 목적은 플라스미드를 사용한 유전자 재조합 균주의 단점으로 지적되고 있는 플라스미드의 불안정성과 생육저해 등을 해결함과 동시에ppc유전자의 수를 2개 이상으로 증가시킴으로써ppc유전자의 발현 증가를 통해 획기적인 쓰레오닌 생산성 향상을 달성할 수 있는 L-쓰레오닌이 제조방법을 제공하는 데 있다.

도 1은ppc유전자의 염색체 삽입을 위한 재조합 플라스미드의 제작 과정을 도시한 것이다.

상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 미생물을 이용하여 L-쓰레오닌을 생산함에 있어서, 이용되는 미생물의 염색체 DNA 중에 존재하는 원래의 포스포에놀 파이루베이트 카르복실레이즈(ppc) 유전자 외에 추가로 1 카피 이상의 포스포에놀 파이루베이트 카르복실레이즈 유전자가 염색체 DNA 중의 특정부위에 삽입된 것을 특징으로 하는 L-쓰레오닌의 제조방법을 제공한다.

본 발명에서는, 염색체 DNA 중에ppc유전자의 수를 2개 이상으로 늘림으로써 포스포에놀 파이루베이트로부터 쓰레오닌 생합성의 전구체인 옥살로아세테이트(oxaloacetate)로 전환해주는 효소인ppc유전자의 발현량을 증가시켜 L-쓰레오닌의 생산량을 향상시킬 수가 있다.

본 발명에 이용될 수 있는 미생물은 대장균, 코리네형 세균, 세라티아속 세균, 프로덴시아속 균주 등과 같이 L-쓰레오닌을 생산할 수 있는 어떤 균주도 가능하나, 특히 상기 미생물이 대장균인 것이 바람직하다.

본 발명의 미생물에 추가로 삽입되는ppc유전자는 특히 쓰레오닌 유사체, 라이신 유사체, 이소루이신 유사체와 메티오닌 유사체에 대해 내성을 보이는 미생물(인공 변이주)로부터 획득하는 것이 바람직하다.

본 발명에서 추가로 삽입되는ppc유전자는 염색체 DNA 중의 원래ppc유전자외에 어떤 부위에도 삽입될 수 있으나, 특히 삽입 부위가 lacZ 부위인 것이 바람직하다.

바람직하게는, 본 발명은 L-쓰레오닌의 생산 균주인 대장균 TF4076 (KFCC 10718, 대한민국 특허출원 제90-22965)의 염색체로부터 폴리머레이즈 체인 반응(PCR)을 통해 얻은ppc유전자를 다시 모균주인 TF4076의 염색체에 삽입시키는 것을 특징으로 하는 L-쓰레오닌의 제조방법을 제공한다.

본 발명을 좀더 상세하게 살펴보면 다음과 같다.

1. ppc 유전자

ppc유전자는 쓰레오닌 생산균주인 TF4076(KFCC10718, 대한민국 특허출원 제90-22965)의 염색체로부터 폴리메라제 연쇄반응(Polymerase Chain Reaction: PCR)을 통하여 클로닝하여 사용하였다. TF4076은 메티오닌 요구성, 쓰레오닌 유사체(AHV: α-아미노-β-하이드록시 발레릭산)에 대한 내성, 라이신 유사체(AEC: S-(2-아미노에틸)-L-시스테인)에 대한 내성, 이소루이신 유사체(α-아미노부티릭에시드) 대한 내성, 메티오닌의 유사체(에티오닌)에 대한 내성 등의 특성을 가지고 있다.

2. 삽입용 벡터

염색체 삽입을 위한 벡터로는 이러한 용도로 개발된 플라스미드 벡터인 pBRINT-TsGm (참고문헌: Sylvie Le Beatriz 등 (1998), pBRINT-Ts: a plasmid family with a temperature-sensitive replicon, designed for chromosomal integration into the lacZ gene of Escherichia coli. Gene. 223, 213-219.)을 이용하였다. 이 벡터는 37℃에서 배양하면 플라스미드에 클로닝된 유전자가 염색체 DNA의 lacZ 유전자 부위로 삽입되는 특성을 가지고 있으며 다시 온도를 44℃로 올려서 배양하면 세포질 내에 존재하는 남은 플라스미드들이 소실되어버리는 온도 감수성의 특성을 가지고 있다.

3. 재조합 벡터

먼저 TF4076의 염색체로부터 PCR을 통해 획득한ppc유전자를 pBRINT-TsGm의HindIII와EcoRI 부위에 클로닝하여 pGm-PPC를 제작하고 여기서 제작된 재조합 플라스미드 벡터를 다시 TF4076에 형질전환시킨 후 37℃에서 배양하여 클로닝된ppc유전자가 염색체 DNA의lacZ유전자 부위에 삽입을 유도한 후 다시 44℃에서 배양함으로써 숙주 모균주의 세포질 중에 남아있는 플라스미드들의 소실을 유도하였다.

4. 선별 방법

재조합 균주들의 외형상의 선별 방법은 클로닝에 사용된 젠타마이신에 대한 내성과 카베니실린에 대한 감수성, 그리고 X-gal과 IPTG가 첨가된 고체배지에서 푸른색이 아닌 흰색을 보이는 콜로니들을 선별하였다. 이것은 염색체 DNA중의 lacZ 유전자에ppc유전자가 삽입됨으로써 lacZ 활성이 소실되어 발색제인 X-gal을 분해할 수 있는 능력이 소실되는 원리를 이용한 것이다.

이렇게 해서 선별된 재조합주를 역가배지가 함유된 삼각 플라스크에서 쓰레오닌의 생산성을 모균주와 비교해 본 결과 모균주는 48시간에 20.0 g/L을 생산한 반면 염색체 DNA에ppc유전자와 쓰레오닌 오페론이 삽입된 재조합 균주중 최고의 성적을 보인 균주 pGm-PPC16(KFCC-11229)은 25.5 g/L의 쓰레오닌을 생산함으로써 약 27.5% 에 이르는 수율 향상을 달성하였다(실시예 3 참조). 또한 이 균주의 경우 5-리터 발효조에서는 모균주 (75.3 g/L)에 비해 수율이 약 30.8% 향상된 98.5 g/L의 쓰레오닌을 생산하였다(실시예 4 참조).

이하, 실시예를 들어서 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하지만, 본 발명은 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1 : ppc 유전자의 클로닝

ppc유전자의 클로닝 과정을 도 1에 나타내었다. 클로닝에 사용된ppc유전자는 쓰레오닌 생산균주인 TF 4076으로부터 얻었다. 염색체 DNA를 분리하여 제한효소 Sal I으로 절단한 후 전기영동하여 4 -5 kb 크기의 DNA 절편만을 회수하였다. 회수한 DNA 절편을 템프레이트로 사용하고 프라이머1 (5'-aggaattcttccgcagcatttgacgtcac-3') 과 프라이머2 (5'-aggaagcttttagccggtattacgcatacc-3')를 사용하여ppc유전자를 증폭하였다. 증폭된 유전자는EcoRI 과HindIII로 절단하여 다시 전기영동을 통하여 최종 2.8 kb 크기의ppc유전자 절편을 회수하였다. 클로닝에 사용된 벡터로는 멕시코 국립대학으로부터 획득한 pBRINT-Ts 계열의 벡터(참고문헌: Sylvie Le Beatriz 등 (1998), pBRINT-Ts: a plasmid family with a temperature-sensitive replicon, designed for chromosomal integration into thelacZgene ofEscherichia coli. Gene . 223, 213-219.)인 pBRINT-TsGm (7.9 kb)을 사용하였다. pBRINT-TsGm도 동일한 제한효소EcoRI과HindIII로 이중절단하여 T4 DNA ligase를 사용하여 상호 접합하였다. 접합된 DNA를 대장균 DH5α에 전기장충격법을 통하여 형질전환하여 1리터 당 카베니실린 (carbenicillin)은 50 ㎎, 젠타마이신(gentamycin)은 5 ㎎ 되게 항생제가 포함된 LB 고체배지(효모엑기스 5 g/L, 박토트립톤 10g/L, 염화나튜륨 10 g/L, 박토아가 1.7%, pH 7.0)에서 자란 단일 콜로니들을 회수하였다. 회수된 콜로니들을 동일한 항생제가 첨가된 LB 배지에서 배양한 균체로부터 플라스미드를 분리하여 포함된 플라스미드의 크기를 일차로 확인하고 2차로 다시EcoRI과HindIII로 2중 절단하여 2.8 kb 크기의 DNA 절편이 나오는지를 확인함으로써ppc유전자가 포함된 재조합 플라스미드 pGm-PPC(10.7 kb)를 제작하였다.

실시예 2: 재조합 플라스미드의 염색체 삽입 균주의 선별

먼저 DH5a로부터 분리한 재조합 플라스미드 pGm-PPC를 사용하여 쓰레오닌 생산균주인 TF4076에 형질전환하여 5 mg/L 젠타마이신이 첨가된 LB 고체배지 (효모엑기스 5 g/L, 박토트립톤 10g/L, 염화나튜륨 10 g/L, 박토아가 1.7%, pH 7.0)에 도말하여 30℃에서 60시간 배양하였다. 단일 콜로니들을 따서 0.5 ㎖의 LB에 접종하여 30℃에서 4시간 동안 배양한 후 배양액의 일부를 다시 10 ㎖의 LB에 옮겨서 30℃에서 6시간 배양한 후 다시 37℃에서 밤새 배양했다. 배양액을 10^-3∼10^-6로 희석하여 5 mg/L 젠타마이신이 첨가된 LB 고체배지에 도말하였다. 이때 0.1 M IPTG 12 ㎕ 와 2% X-gal 60 ㎕를 같이 도말했다. 도말한 플레이트는 44℃에서 24시간 동안 배양하여 나온 흰색 콜로니들 중 15 mg/L의 카베니실린이 첨가된 LB 고체배지에서 자라지 못하는 카베니실린에 민감한 콜로니들을 선별함으로써 최종적으로 염색체 DNA의lacZ유전자 부위에ppc유전자가 삽입됨과 동시에 남은 플라스미드는 소실된 재조합 균주를 선별하였다.

실시예 3: 재조합 균주들의 삼각 플라스크에서 쓰레오닌 생산 역가 비교 시험

재조합 플라스미드가 염색체에 삽입된 재조합 균주들의 단일 콜로니 30주 선별하여 표 1에 나타낸 쓰레오닌 역가배지를 사용하여 삼각 플라스크에서 쓰레오닌 생산성을 비교하였다. 32℃의 인큐베이터에서 LB 고체배지중에 밤새 배양한 단일 콜로니들을 20 ml의 역가배지에 1루프씩 접종하여 32℃에서 250 rpm으로 48시간 동안 배양하였다. 분석 결과를 표2에 나타내었는데 모균주인 TF4076은 20.0 g/L인 반면 재조합 균주들은 30주 모두 모균주에 비해 우수한 성적을 보였으며 특히 25.0 g/L 이상의 성적을 보인 균주도 4주나 되었으며 가장 높은 성적을 보인 균주의 경우 25.5 g/L 의 쓰레오닌을 생산함으로써 수율이 모균주 대비 약 27.5% 정도 향상되었음을 관찰하고 pGm-PPC16 로 명명하고, 이 변이주를 2000년 11 월 20 일자로 사단법인 한국종균협회에 기탁하고, 기탁번호 제 KFCC-11229 호를 부여받았다.

쓰레오닌 역가배지

조성물	농도 (리터당)
포도당	70 g
황산암모늄	28 g
KH₂PO₄	1.0 g
MgSO₄.7H₂O	0.5 g
FeSO₄.7H₂O	5 mg
MnSO₄.8H₂O	5 mg
탄산칼슘	30 g
L-메티오닌	0.15 g
효모엑기스	2 g
pH (7.0)

재조합 균주들의 플라스크 역가 시험 결과

20-22 g/L	22-24 g/L	24-25 g/L	25 g/L 이상
6	10	10	4

실시예4: 발효조를 이용한 쓰레오닌 비교시험

실시예 3에서 선별된 우수균주 pGm-PPC16와 모균주 TF4076을 사용하여 5-L 발효조에서 쓰레오닌 생산성을 비교하여보았다. 초기 배지 조성은 표 3에 나타내었다. 종균배양은 LB배지에 포도당 10 g/L와 L-메티오닌을 0.1 g/L 되게 첨가해 준 배지를 사용하였고 발효조의 초기 접종 부피는 초기 배양 부피의 3 -5%에서 조정하였다. 추가당은 6회에 걸쳐 첨가하였으며 추가한 후의 포도당 농도가 5% 되게하였으며 추가시점은 포도당이 고갈된 시점이다. 또한 포도당을 추가할 때 제일인산칼륨(KH₂PO₄)을 중량기준으로 1% 되게 같이 첨가해주었다. 초기 배양 부피는 1.5 L이고 최종 부피는 3.0 L이며 발효종료 후 투입된 총 포도당의 농도는 250 g/L이다. 교반속도는 700 -1000 rpm으로 해주고 pH와 온도는 각각 7.0과 32℃로 맞추어 주었다. 배양중 pH의 조절은 25 -28%의 암모니아수를 사용하였다. 또한 통기량은 0.5vvm으로 조정하였다. 실험 결과를 표 4에 나타내었는데 모균주 TF4076은 75.3 g/L의 쓰레오닌을 생산하여 소비한 포도당에 대해 30.1%의 수율을 보인 반면 재조합 균주 pGm-PPC16는 98.5 g/L의 쓰레오닌을 생산하여 39.4%의 수율을 보임으로써 농도와 수율 면에서 모균주에 비해 30.8%의 월등한 성적 향상을 보여주었다. 또한 재조합 균주에 흔히 나타나는 생육저해 현상에 따른 발효시간 당소모 속도 지연 현상도 전혀 나타나지 않고 모균주와 유사한 양상을 보였다.

5리터 발효조의 초기 배지 조성

조성물	농도 (리터당)
포도당	50 g
KH₂PO₄	4 g
(NH₄)₂SO₄	6 g
효모엑기스	3 g
MgSO₄.7H₂O	2 g
L-메티오닌	1 g
FeSO₄.7H₂O	40 mg
MnSO₄.8H₂O	10 mg
CaCl₂.2H₂O	40 mg
CoCl₂.6H₂O	4 mg
H₃BO₃	5 mg
Na₂MoO₄.2H₂O	2 mg
ZnSO₄.7H₂O	2 mg
pH 7.0

재조합 균주의 5리터 발효조에서의 발효 성적

균주명	쓰레오닌 (g/L)	발효시간(시간)	수율(%)
TF4076	75.3	78	30.1
pGm-PPC16	98.5	77	39.4

이상 살펴본 바와 같이, 본 발명에 따르면 염색체 DNA 중에ppc유전자의 수를 2개 이상으로 늘림으로써 포스포에놀 파이루베이트로부터 쓰레오닌 생합성의 전구체인 옥살로아세테이트(oxaloacetate)로 전환해주는 효소인ppc유전자의 발현량을 증가시켜 L-쓰레오닌의 생산량을 27% 이상 획기적으로 향상시킬 수가 있다.

Claims

미생물을 이용하여 L-쓰레오닌을 생산함에 있어서, 이용되는 미생물의 염색체 DNA 중에 존재하는 원래의 포스포에놀 파이루베이트 카르복실레이즈(ppc) 유전자 외에 추가로 1 카피 이상의 포스포에놀 파이루베이트 카르복실레이즈 유전자가 염색체 DNA 중의 특정부위에 삽입된 것을 특징으로 하는 L-쓰레오닌의 제조방법.
제 1 항에 있어서, 상기 미생물이 대장균인 것을 특징으로 하는 L-쓰레오닌의 제조방법.
제 1 항에 있어서, 추가로 삽입된ppc유전자가 쓰레오닌 유사체, 라이신 유사체, 이소루이신 유사체와 메티오닌 유사체에 대해 내성을 보이는 미생물로부터 획득한 것을 특징으로 하는 L-쓰레오닌의 제조방법.
제 1 항에 있어서, 추가로 삽입된ppc유전자의 염색체 DNA 중의 삽입 부위가 lacZ 부위인 것을 특징으로 하는 L-쓰레오닌의 제조방법.
제 1 항에 있어서, L-쓰레오닌의 생산 균주인 대장균 TF4076 (KFCC 10718)의 염색체로부터 폴리머레이즈 체인 반응(PCR)을 통해 얻은ppc유전자를 다시 모균주인 TF4076의 염색체에 삽입시키는 것을 특징으로 하는 L-쓰레오닌의 제조방법.
제 1 항에 있어서, 상기 미생물이 도1에 도시된 재조합 플라스미드 pGm-PPC 를 사용하여 제작된 것을 특징으로 하는 L-쓰레오닌의 제조방법.
L-쓰레오닌을 생산하는 에스케리키아 콜리(Escherichia. coli) pGm-PPC16 (KFCC-11229).