KR850001232B1 - 발효에 의한 l-페닐알라닌의 제조방법 - Google Patents

Abstract

내용 없음.

Description

발효에 의한 L-페닐알라닌의 제조방법

본 발명은 에쉐리시아(Escherichia) 속에 속하는 L-페닐알라닌 생성변이주를 탄소원, 질소원, 미네랄 그 외에 미생물이 필요로 하는 각종 영양배지 중에서 호기적으로 배양하여 배지에 L-페닐알라닌을 생성, 축적시키는 제조방법에 관한 것이다.

발효에 의한 L-페닐알라닌의 제조방법은 브레비박테리움속, 마이크로박테리움속의 타이로신요구성 변이주의 개발에 의해 시작되었다(일특소 37-6345).

그 후 브레비박테리움속 혹은 마이크로박테리움속등의 타이로신요구성외에 페닐알라닌 아날로그에 내성을 갖는 변이주를 개발함으로서 L-페닐알라닌의 축적량을 증가시킬 수 있었으나, 그 수율 및 생산성이 낮고 각종 부산물이 축적됨으로 해서 고가의 생산원가가 불가피한 단점이 있었다(일특소 57-17519).

따라서 본 발명자들은 종래 이러한 발효에 의한 L-페닐알라닌의 제조방법을 개량하고자 연구한 결과, 에쉐리시아속에 속하며 페닐알라닌 아날로그에 내성 및 L-트립토판과 L-타이로신을 생육을 위해 동시에 요구하는 변이주를 개발하였으며, 이 변이주가 고농도, 고수율, 고생산성으로 L-페닐알라닌을 축적함은 물론이고, L-페닐알라닌 이외의 아미노산부산물은 거의 생성하지 않는다는 것을 발견하고 본 발명을 완성하였다.

본 발명을 상세히 설명하면 친주(W3110)를 루리아(Luria) 배지에서 10-15시간 배양한 후 원심분리하고, 다시금 0.1몰의 황산마그네슘용액에 현탁하고 자외선을 조사하여 변이시킨 후 페닐알라닌 아날로그를 함유(0.1-10mg/mℓ)하는 한천 최소배지에서 1-3일간 33℃에서 배양하였을 때 생육 가능한 콜로니(colony)로부터 1차 페닐알라닌 아날로그 내성변이주(KFCC 10067)를 분리하고, 이를 다시 자외선을 조사시킨 후 암피씰린(20㎍/mℓ)으로 2회 농축하고 L-타이로신에 대한 영양요구주를 공지의 레프리카 방법으로 선별한후, 다시금 페닐알라닌 아날로그 및 L-타이로신(10-50mg/ℓ) 함유 한천 최소배지에서 생육가능한 콜로니를 선택 분리하여 페닐알라닌 내성을 가지는 동시에 L-타이로신을 생육에 요구하는 2차 L-페닐알라닌 생성변이주(KFCC 10068)를 분리하였다.

2차 변이주(KFCC 10068)를 사용하여 같은 방법으로 자외선을 조사시킨 후 암피씰린으로 2회 농축하고 L-타이로신 및 L-트립토판을 동시에 요구하는 영양요구주를 분리하여 확인한 후, 페닐알라닌 아날로그, L-타이로신 및 L-트립토판 함유 한천 최소배지에서 생육가능한 콜로니를 선택 분리하여 페닐알라닌 아날로그에 내성을 가지는 동시에 L-타이로신 및 L-트립토판을 생육을 위해 요구하는 L-페닐알라닌 생성 3차 변이주(KFCC 10066)를 얻었다.

페닐알라닌 아날로그로서는 파라-플루오로페닐알라닌, 베타-2-티에닐알라닌 등을 사용할 수 있으며, 한천 최소배지의 조성으로는 포도당 5g/ℓ, 인산 제1수소칼륨 7g/ℓ, 인산 제2수소칼륨 2g/ℓ, 황산마그네슘 0.1g/ℓ, 구연산나트륨 0.5g/ℓ, 한천 20g/ℓ를 사용하였다.

본 발명에 사용한 배지 조성은 실시예에서 표시하는 바와 같은 탄소원, 질소원, 미네랄 그밖에 사용균주가 필요로 하는 각종 영양소를 적당히 함유하는 것이면 합성배지 또는 천연배지의 어느 것을 사용해도 좋다.

탄소원으로서는 포도당, 과당, 락토스, 맥아당, 전분효소분해액 등을 사용할 수 있으며 또한 구연산, 퓨말산, 초산, 호박산, 개미산 등 각종 유기산의 사용도 가능하다.

질소원으로서 암모니아, 암모니아수, 염화암모늄, 황산암모늄 등의 각종 유기 및 무기암모늄 및 그밖의 질소함유물, 즉 펩톤, 육즙, NZ-아민, 이스트익스트렉트, 콘스팁리커 등 각종 질소성 유기물 등 여러 종류가 사용 가능하다.

그외 무기물로서는 인산 제1수소칼륨, 인산 제2수소칼륨, 황산마그네슘, 황산칼륨, 염화나트륨, 황산제1철, 황산망간, 염화철, 염화마그네슘, 황산구리, 황산아연, 붕산, 염화망간 등이 사용될 수 있으며 비타민, 아미노산 등의 미량 영양원소를 필요로 하는 균주는 이러한 영양원을 가해주어야 하나 전술한 그외의 배지성분에 의해서 배지에 공급되면 특별히 첨가하지 않아도 좋다.

변이주의 배양은 호기적 조건하에서 통기진탕 또는 교반 배양하며 배양온도는 일반적으로 25-40℃가 좋다. 배양중 pH는 중성부근을 유지하는 것이 좋고, 필요에 따라서 발효진행과정중 온도와 pH를 적절히 변화시키면서 배양할 수도 있다.

통상 1-3일 배양시키면 발효배지에 L-페닐알라닌이 축적된다.

L-페닐알라닌의 정량은 페퍼크로마토법으로 분리하고 닌하이드린 발색시약을 사용, 발색시킨 후 양성부분을 절단하고 에탄올을 용매로 추출하여 비색정량하였다.

실시예에서 이를 구체적으로 설명한다.

[실시예 1]

에쉐리시아속 친주(W3110)와 본 발명에서 얻은 L-페닐알라닌생성 1차 변이주(KFCC 10067), 2차 변이주(KFCC 10068), 3차 변이주(KFCC 10066)를 각각 루리아배지(포도당 5g/ℓ, 이스트익스트렉트 10g/ℓ, 트립톤 10g/ℓ, 소금 10g/ℓ)를 종 배양배지로 31℃에서 10시간 배양한 후, 각각 0.1ℓ를 1.9gℓ의 발효배지에 접종해서 33℃와 pH 7.0 조건하에서 33-40시간 동안 호기적으로 교반 배양하여 L-페닐알라닌의 생성량, 수율, 생산성을 표 1에 표시하였다.

이때 발효조의 교반속도는 500-700rpm, 용존산소는 30%(D. O. T) 이상, 통기량은 1vvm으로 하였다.

본 발효배지의 조성은 포도당 95g/ℓ, 인산 제1수소칼륨 1.5g/ℓ, 황산칼륨 0.4g/ℓ, 염화마그네슘 0.8g/ℓ, 염화암모늄 5.8g/ℓ, 구연산나트륨 1.2g/ℓ, 염화철 15mg/ℓ, 이스트익스트렉트 1g/ℓ, 치아민 0.2mg/ℓ이다.

[표 1]

친주 및 각 변이주의 특징과 L-페닐알라닌 생성량

주) + : 있음, - : 없음

표에서와 같이 본 발명에서 얻어진 3차 변이주(KFCC 10066)의 L-페닐알라닌 생성량 및 대당수율이 1차 변이주(KFCC 10067)와 2차 변이주(KFCC 10068)보다 월등하였다.

[실시예 2]

2차 변이주(KFCC 10068)를 사용하여 실시예 1과 같은 조건으로 배양하고 발효 본배지 조성을 포도당 95g/ℓ, 인산제1수소칼륨 1.5g/ℓ, 황산칼륨 0.5g/ℓ, 염화마그네슘 0.8g/ℓ, 염화암모늄 5.8g/ℓ, 염화철 10mg/ℓ, 이스트익스트렉트 1g/ℓ, L-트립토판 50mg/ℓ, 치아민 0.2mg/ℓ로 하였을 때 L-페닐알라닌의 축적량은 10.8g/ℓ이었다.

[실시예 3]

본 발명의 사용균주인 3차 변이주(KFCC 10066)를 사용하여 실시예 1과 같은 조건으로 배양하고 발효 본배지 조성을 포도당 95g/ℓ, 인산제1수소칼륨 2.0g/ℓ, 황산칼륨 0.4g/ℓ, 염화마그네슘 0.8g/ℓ, 염화암모늄 6.5g/ℓ, 구연산나트륨 1.2g/ℓ, 염화철 15mg/ℓ, 이스트익스트렉트 1g/ℓ로 하였을 때 L-페닐알라닌의 축적량은 13.2g/ℓ이었다.

[실시예 4]

본 발명의 사용균주인 3차 변이주(KFCC 10066)를 사용하여 실시예 1과 같은 조건으로 배양하고 발효 본배지의 탄소원을 포도당, 과당, 락토스, 맥아당으로, 질소원을 암모니아수, 염화암모늄, 황산암모늄으로 하였을 때 L-페닐알라닌의 축적량을 표 2에 표시하였다.

[표 2]

탄소원 및 질소원에 따른 L-페닐알라닌 생성량

Claims (1)

1. 에쉐리시아속에 속하는 페닐알라닌 아날로그에 내성 및 생육에 L-타이로신 및 L-트립토판을 동시에 요구하는 변이주 KFCC 10066를 각종 영양배지에서 호기적으로 배양하여 배지중에 L-페닐알라닌을 생성, 축적시키는 것을 특징으로 하는 발효에 의한 L-페닐알라닌의 제조방법.