KR900007942B1

KR900007942B1 - 글루타민산을 생산하는 미생물 및 이를 이용한 글루타민산의 제조방법

Info

Publication number: KR900007942B1
Application number: KR1019880016537A
Authority: KR
Inventors: 현형환; 이윤기; 정성오; 심재익; 오윤석
Original assignee: 제일제당 주식회사; 손영희
Priority date: 1988-12-12
Filing date: 1988-12-12
Publication date: 1990-10-23
Also published as: KR900009960A

Abstract

내용 없음.

Description

글루타민산을 생산하는 미생물 및 이를 이용한 글루타민산의 제조방법

본 발명은 글루타민산을 생산하는 미생물 및 이를 이용한 글루타민산의 제조방법에 관한 것으로, 좀더 구체적으로는 브레비박테리움 플라붐 ATCC 14067의 변이주로서 삼투압 내성을 가짐과 동시에 배지중에 비오틴이 과잉 존재하더라도 페니실린계 항생제나 계면활성제(양이온, 음이온, 비이온계 계면활성제)를 발효초기 또는 대수증식기 초기 내지 말기 사이에 첨가 또는 첨가하지 않아도 글루타민산을 고농도, 고수율로 생산하는 미생물에 관한 것이다.

종래 미생물을 이용하여 글루타민산을 생산하는 공업적 방법에서의 발효원료로는 포도당, 전분가스분해물, 폐당밀등을 사용하여 왔으나, 포도당 및 전분가수분해물이 고가라는 이유로 비오틴이 과잉(0.3-1.5μg/g)으로 존재하는 저렴한 가격의 폐당밀을 사용하므로써 발효초기 또는 대수증식기 초기 내지 말기 사이에 페니실린계 항생제나 계면활성제를 첨가하여 글루타민산을 생산하였다.

종래 방법에서 페니실린계 항생물질 등을 첨가하는 것은 이미 잘 알려진 바와같이 상기 물질이 세포벽 합성을 저해하기 때문에 세포벽의 구성물질인 펩티도글리칸 사슬(Peptidoglycan chain)의 가교결합 형성능이 불안전하게 되므로 세포내에서 생성된 글루타민산을 세포벽을 통해 용이하게 세포외로 분비시키기 때문인것이다.

일반적으로 글루타민산을 생산하는 브레비박테리움속이나 코리네박테리움속에 속하는 미생물들은 생장을 위해 비오틴을 요구하나 비오틴이 발효배지중에 과잉으로 존재할 경우에는 비오틴이 세포막합성을 촉진하기때문에 글루타민산의 세포의 분비가 억제되어 글루타민산의 생산이 어려워지므로 발효배지내의 비오틴 농도를 제한할 필요가 있으나, 폐당밀을 이용할 경우에는 비오틴이 너무 과잉으로 함유되어 있어 상술한 방법에 의해서는 글루타민산을 생산할 수 없으므로 발효초기 또는 대수증식기 초기 내지 말기 사이에 페니실린계 항생제나 계면활성제를 첨가해야 생산이 가능하였다.

따라서 본 발명자등은 상술한 종래 방법에 의한 단점을 제거하기 위해 발효배지중 비오틴 농도에 관계없이 글루타민산의 생산에 영향을 미치지 않음과 동시에 삼투압 내성을 갖는 신규의 미생물을 획득하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명 미생물이 갖는 특징중의 하나인 삼투압 내성은 호염성세균(Halophlilic bacteria)이 염분이 많은환경 즉, 세포내부와 세포외부와의 삼투의 차이가 높은 환경(배지에 염화나트륨의 농도가 높거나 또는 세포외 삼투압이 높은 환경)에서는 세포내에 특정 아미노산푸울(Amino Acid pool, 여기에서는 주로 글루타민산 또는 프롤린푸울)을 증가시켜서 세포내외의 삼투압 평형을 유지하여 생육할 수 있음에 주목하여 세포계의 Na-K 펌프등 여러 가지의 생태현상을 연구, 검토한 결과, 염화나트륨 내성균주를 유도하므로써 글루타민산 푸울에 의한 삼투압평형을 유지하기 위해 세포내 글루타민산을 강력하게 생산할 수 있도록 유도된 것이다.

즉, 본 발명의 미생룰(KFCC 10655)은 브레비박테리움 플라붐 ATCC 14067을 친주로 하여 자외선 조사, N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘(NTG)등의 변이유발제로 통상적인 방법으로 처리하여 대부분의 균주들이 생육할 수 없는 염화나트륨이 1.6-2.0몰 농도로 함유되어 있는 염화나트륨 첨가배지(포도당20g/l, 인산제1칼륨 1g/l, 인산제2 칼륨 0.5g/l, 황산암모늄 0.5g/l, 요소 1.0g/l, 황산철 20mg/l, 황산마그네슘 0.5g/l, 황산망간 20mg/l, 티아민염산염 200μg/l, 비오틴 20μg/l, 당밀 5g/l, 염화나트륨 1.6-2.0몰, pH 7.0)에서 3-5일간 배양하고 배양액을 원심분리한 후 염화나트륨의 농도가 2.0몰인 상태에서도 생육이 가능한 균체를 회수, 세정한 다음, 염화나트륨이 1.6-2.0몰 농도 함유된 한천배지(염화나트륨 첨가배지조성중 한천을 20g/l 첨가한 배지)에 도말하여 콜로니를 형성시키고 형성된 콜로니를 순수분리하여 이를 다시 염화나트륨 첨가배지에서 확인을 하므로써 염화나트륨농도 1.6-2.0몰에서도 생육이 가능한 1차 변이주를 얻은 다음, 이를 다시 상술한 변이유발제로 처리한 후 배지의 조성이 포도당 30g/l, 인산제1칼륨 1g/l, 인산제2칼륨 0.5g/l, 황산암모늄 0.5g/l, 요소 3.0g/l, 황산칠 20μg/l, 황산마그네슘 0.5g/l, 황산망간20mg/l, 티아민염산염 200μg/l, 당밀 5g/l, 대두박가수분해물 2g/l, 비오틴 0-200μg/l, PH 7.0인 배지(이하 대두박가수분해물 첨가배지라 한다)에서 비오틴의 농도에 관계없이 항상 글루타민산을 생산할 수 있는 변이주를 획득하고 1988.12. 6 자로 한국종균협회에 기탁하였다(기탁번호 KFCC 10655).

본 발명 미생물의 특성은 다음의 표에 기재된 바와 같다.

염화나트륨에 대한 내성비교

[표 1]

＜주＞ 사용배지 ; 한천배지

+ ; 생육 - ; 생육치 못함

비오틴농도에 따른 글루타민산 생산비교

[표 2]

＜주＞ 배지는 대두박가수분해물 첨가배지를 사용하여 글루타민산의 생산을 확인하였으며 종배양배지는 염화나트륨첨가 배지의 조성중 염화나트륨을 제거시킨 배지를 사용, 균주를 접종배양하였으며 OD₅₆₂에서 약 4.0정도가 될때 원심분리하여 균체를 회수한 후 생리식염수르 2-3회 세정하여 배지중 잔존비오틴을 완전히 제거한 후 종균으로 사용하였다. 글루타민산의 생산확인은 대두박가수분해물 첨가배치를 250ml용량의 삼각플라스크에 각 40ml씩 분주하여 살균, 냉각후 사용하였으며 rpm 220,30℃에서 72시간 진탕배양하였다.

다음의 실시예에서 본 발명을 좀더 구체적으로 설명한다.

실시예 1

사용균주; 본 발명 미생물(KFCC 10655), ATCC 14067

종배지; 폐당밀 0.5%, 포도당 2.0%, MgSO₄0.5g/l, 요소 0.1%, FeSO₄20mg/l, K₂HPO₄0.5g/l, KH₂PO₄1g/1, (NH₄)₂SO₄0.5%, 티아민염산염 200μg/l, 비오틴 20μg/l, MnSO₄20mg/l,pH 7.0

발효배지; 폐당밀(전화당으로)4%, KH₂PO₄1g/l, K₂HPO₄0.5g/l, (NH₄)₂SO₄0.5g/l, FeSO₄20mg/l, MgSO₄0.5g/l, MnSO₄20mg/l, 요소 30g/l, 티아민염산염 200μg/l, 대두박추출물 2g/l,pH 7.0

종배양; 상기 종배지 40ml를 250ml 용량의 배양용 삼각플라스크에 분주하고 살균, 냉각후 상기 균주를 식균하여 약 16-20시간(30℃, 180rpm)진탕배양하여 종균으로 사용하였다.

발효방법; 발효배지를 250ml용량의 삼각플라스크에 40ml씩 분주하여 살균(121℃, 10분), 냉각한 후 종균을 1ml씩 식균하고 약 72시간(32℃,220rpm)진탕배양하였다.

배양완료액중 글루타민산의 축적량은 표 3의 기재와 같다.

[표 3]

본 실시예에서 사용한 당밀은 필리핀산 사탕수수당밀로써 비오틴의 함량은 당밀 1g당 1.4μg이었고 발효배지중의 비오틴농도는 98μg/l이었다.

본 실시예의 결과, 본 발명의 미생물은 발효배지중 비오틴의 농도가 과잉이라 할지라도 페니실린계 항생제 또는 계면활성제를 첨가하지 않아도 고농도의 글루타민산을 생산할 수 있음이 확인되었다.

실시예 2

사용균주; 실시예 1과 동일

1차종배지; 폐당밀 0.5%, 포도당 2.0%, MgSO₄0.5g/l, 요소 0.1%, FeSO₄20mg/l, MnSO₄20mg/l, K₂HPO₄0.5g/l, KH₂PO₄1g/l, (NH₄)₂SO₄0.5%, 티아민염산염 200μg/l, 비오틴 20μg/l, pH 7.0

2차 종배지; 폐당밀(전화당으르) 2.0%, 글루코오스 1%, 콘스팁리커 3%, MgSO₄0.5g/l, 요소 0.2%, KH₂PO₄1g/l, K₂HPO₄0.5g/l, FeSO₄10mg/l, MnSO₄10mg/l, (NH₄)₂SO₄0.3%, 티아민염산염 200μg/l, 비오틴 100μg/l, 소포제 약간, pH 7.0

발효배지; 폐당밀(전화당으로) 8%, (NH₄)H₂PO₄0.15%, FeSO₄10mg/l, MnSO₄10mg/l, 콘스팁리커 3%, (NH₄)₂SO₄0.3%, 티아민염산염 200μg/l, 소포제 약간, PH 7.0

1차종배양; 1차 종배지를 40ml씩 삼각플라스크에 넣고 살균후 균주를 접종하여 180rpm, 30℃에서 20-24시간 진탕배양하였다.

2차종배양; 2차 종배지를 2.6리터 용량의 시험용발효조에 각 1.2리터씩 분주하고 121℃에서 10분간 살균, 냉각후 1차 종배양의 배양완료액을 5ml씌 접종한 후 공기를 매분당 0.5-1.0리터 공급하면서 900rpm, 30℃에서 12-15시간 진탕배양하였다.

발효방법; 상기 발효배지를 5리터 용량의 시험발효조에 1.8리터씩 분주하고 121℃에서 10분간 살균, 냉각하여 2차 종배양액을 약 150ml씩 접종한 후, 공기를 매분당 1-2.5리터 공급하면서 900rpm, 30-37℃에서 진탕배양하였다.

상기 조건으로 배양하여 대수증식기 초기 내지 말기 [OD₅₆₂0.15-0.4(OD₅₆₂×100)] 사이에 페니실린을 0.3-1.2u/ml 첨가하고 배양하며 배양중 배양액의 pH는 암모니아수로 pH 7.8이 되도록 계속 조절하였다.

배양중 잔존당의 농도가 0.5-1.5%가 되면 살균된 폐당밀 또는 폐당밀과 원당을 일정비율로 혼합한 당을 수시로 공급하였다.

추가한 당밀 또는 혼합당과 초기의 발효배지에 첨가된 당의 합계가 발효액량 대비 19%가 될 때까지 계속배양하였다. 배양완료후 글루타민산의 농도는 ATCC 14067이 100.7g/l, KFCC 10655가 133.8g/l이었다.

실시예 3

사용균주, 1차 및 2차종배지, 발효배지, 1차 및 2차 종배양은 실시예2와 동일하게 행하였다.

발효방법; OD가 0.1-0.3(OD₅₆₂×100)정도가 될 때 비이온계 계면활성제 트윈 40을 발효액 대비 50-100μg/ml가 되도록 첨가하여 배양한 것을 제외하고는 실시예 2와 동일하게 행한 결과, 발효완료액의 글루타민산의 농도는 ATCC 14067이 98.8g/l, KFCC 10655가 136.1g/l이었다.

Claims

삼투압내성을 가짐과 동시에 폐당 및 발효배지내 비오틴 농도 98μg/l 존재하에서, 페니실린 항생제 또는 계면활성제를 첨가하지 않아도 글루타민산을 생산함을 특징으로 하는 브레비 박테리움 플라붐 KFCC 10655.
브레비박테리움 플라붐의 KFCC 10655를 폐당밀, 포도당, 전분가수분해물 및 원당등이 포함된 배지중에서 배양하여 배양물로부터 글루타민산을 채취하는 것을 특징으로 하는 미생물을 이용한 글루타민산의 제조방법.