KR100344016B1

KR100344016B1 - 5'-크산틸산을 생산하는 미생물

Info

Publication number: KR100344016B1
Application number: KR1020000018387A
Authority: KR
Inventors: 민선식; 배상영; 윤덕병; 한종권; 박장희; 곽영현; 이재흥
Original assignee: 제일제당주식회사
Priority date: 2000-04-08
Filing date: 2000-04-08
Publication date: 2002-07-20
Also published as: KR20010089979A

Abstract

본 발명은 5'-크산틸산(XMP)를 생산하는 코리네박테리움 암모니아게네스(Corynebacterium ammoniagenes) KFCC 10743을 친주로 하여 자외선 조사, N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘(NTG) 등의 변이유발제로 통상적인 방법에 따라 처리하여 친주의 형질을 변형시켜, 세포벽 합성을 저해하는 바시트라신(bacitracin)에 대한 내성을 갖게 함으로써 친주에 비해 5'-크산틸산 생산능이 향상된 변이주에 관한 것이다.

Description

5'-크산틸산을 생산하는 미생물 {5'-Xanthylic acid producing microorganism}

본 발명은 5'-크산틸산(XMP)을 생산하는 미생물 자체에 관한 것이다. 보다 상세하게는 본 발명은 코리네박테리움 암모니아게네스(Corynebacterium ammoniagenes) KFCC 10743의 변이주로서 인지질(Lipid pyrophosphate)의 탈인산화를 저해하여 세포벽 합성을 저해하는 바시트라신(bacitracin) 내성을 갖는 특수한 미생물로서 기존 균주에 비해 5'-크산틸산의 생산능이 향상된 미생물에 관한 것이다.

5'-크산틸산은 퓨린뉴클레오타이드(Purine nucleotide) 생합성 대사계의 중간생성물로 5'-구아닐산(GMP)의 제조원료로서 중요한 물질이다. 정미성이 강하고 상품적 가치가 높은 5'-구아닐산의 제조방법으로서 현재 널리 이용되고 있는 방법은 미생물 발효법으로서, 5'-크산틸산을 생산하고 이를 효소학적으로 5'-구아닐산으로 전환시키는 과정이 가장 경제적이어서 5'-구아닐산의 수요만큼 5'-크산틸산도 필요하다. 종래 5'-크산틸산의 제조방법에는 화학합성법, 효모 중의 리보핵산을 분해하여 제조된 5'-구아닐산을 탈아미노화하는 방법 또는 발효법을 들 수 있으며, 발효법에는 발효배지내 전구물질로 크산틴(Xanthine)을 첨가하는 방법, 미생물 변이주에 의한 제조법, 항생물질 첨가에 의한 제조법(일본특허 소42-1477, 소44-20390) 및 계면활성제 첨가에 의한 제조법(일본특허 소42-3825, 소42-3838) 등이 알려져 있다. 이 중에서도 미생물 변이주에 의한 5'-크산틸산의 직접적인 발효제조방법이 공업적으로 유리하므로 본 발명자들은 기존의 코리네박테리움 암모니아게네스(KFCC 10743)가 보유하고 있는 형질을 개량하여 5'-크산틴산이 최대로 생산될 수 있는 형질을 부여함으로써 5'-크산틸산의 생산성이 월등히 증가한 변이주를 개발하였다.

따라서, 본 발명자들은 미생물로 하여금 세포내 5'-크산틸산이 축적될 경우 이의 세포외로의 분비가 원활하도록 세포벽 합성에 변화를 주어 5'-크산틸산을 다량 생산케하였다. 즉, 인지질의 탈인산화를 저해하여 미생물 세포벽 합성을 저해하는 바시트라신에 대한 내성을 부여하여 세포벽 투과성을 향상시킴으로써 코리네박테리움 암모니아게네스 KFCC 10743에 새로운 형질을 부여하여 종래의 균주가 보유하고 있는 5'-크산틸산의 생산성을 크게 향상시킨 변이주를 개발하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명에 따른 5'-크산틸산을 생산하는 미생물 B1045는, 코리네박테리움 암모니아게네스(Corynebacterium ammoniagenes) KFCC 10743을 친주로 하여 자외선 조사, N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘(NTG) 등의 변이유발제로 통상적인 방법에 따라 처리한 후 바시트라신이 농도별로 첨가된 (주3) 배지에서 생육할 수 있는 변이주들중에서 선별된 것이다. 이때 실험에 사용된 배지 중의 바시트라신 농도는 20㎎/ℓ까지 사용하였으며, 바시트라신 농도 5㎎/ℓ에서 생육하며, 5'-크산틸산 농도가 향상된 균주를 선별하여, 이 균주를 B1045로 명명하여 한국종균협회에 기탁하였다(수탁번호 KFCC-11138).

(주1) 영양배지 : 포도당 20g/ℓ, 펩톤 10g/ℓ, 효모엑기스 10g/ℓ, 염화나트륨 2.5g/ℓ, 우레아 3g/ℓ, 아데닌 150㎎/ℓ, 구아닌 150㎎/ℓ, pH 7.2

(주2) 최소배지 : 포도당 20g/ℓ, 인산제1칼륨 1g/ℓ, 인산제2칼륨 1g/ℓ, 우레아 2g/ℓ, 황산암모늄 3g/ℓ, 황산마그네슘 1g/ℓ, 염화칼슘 100㎎/ℓ, 황산철 20㎎/ℓ, 황산망간 10㎎/ℓ, 황산아연 10㎎/ℓ, 비오틴 30㎍/ℓ, 티아민산염 0.1㎎/ℓ, 황산구리 0.8㎎/ℓ, 아데닌 20㎎/ℓ, 구아닌 20㎎/ℓ, pH 7.2

(주3) 바시트라신 첨가배지 : (주2) 최소배지에 바시트라신 1 내지 10㎎/ℓ을 첨가한 배지

본 발명에서 분리한 신규의 변이주 B1045의 생화학적 특성은 표 1의 기재와 같다.

바시트라신에 대한 내성 비교

	바시트라신 농도(㎎/ℓ)
	0	0.1	0.2	0.5	1.0	2.0	5.0	10.0
균주	KFCC 10743	+++	+++	++	+	±	-	-	-
균주	B1045	+++	+++	+++	+++	++	+	+	-
30℃에서 5일 배양+ ; 생육, - ; 생육치 못함

상기 표 1에 나타난 바와 같이, 본 발명의 미생물 B1045는 5㎎/ℓ농도의 바시트라신 첨가배지에서도 생육가능한 균주임을 알 수 있다.

실시예 1

사용균주 ; 본 발명의 미생물 B1045, KFCC 10743

종배지 ; 포도당 30g/ℓ, 펩톤 15g/ℓ, 효모엑기스 15g/ℓ, 염화나트륨 2.5g/ℓ, 우레아 3g/ℓ, 아데닌 150㎎/ℓ, 구아닌 150㎎/ℓ, pH 7.2

발효배지 ; (1) 본배지 ; 포도당 60g/ℓ, 황산마그네슘 10g/ℓ, 황산철 20㎎/ℓ, 황산아연 10㎎/ℓ, 황산망간 10㎎/ℓ, 아데닌 30㎎/ℓ, 구아닌 30㎎/ℓ, 비오틴 100㎍/ℓ, 황산구리 1㎎/ℓ, 티아민염산염 5㎎/ℓ, 염화칼슘 10㎎/ℓ, pH 7.2

(2) 별살배지 ; 인산제1칼륨 10g/ℓ, 인산제2칼륨 10g/ℓ, 우레아 7g/ℓ, 황산암모늄 5g/ℓ

발효방법 ; 상기 종배지 5㎖을 지름 18㎜ 시험관에 분주하고, 상법에 따라 가압, 살균한 후, 사용균주를 접종하고 150rpm으로 30℃에서 24시간 진탕 배양하여 종배양액으로 사용하였다. 발효배지 중 본배지와 별살배지를 각각 상법에 따라 살균하여 미리 가압 살균한 250㎖용량의 진탕용 삼각플라스크에 20㎖과 7㎖씩 분주하고 종배양액 3㎖을 식균한 다음 60 내지 70시간 배양하였다. 회전수는 170rpm, 온도 30℃로 조절하였다. 배양 완료 후, 5'-크산틸산의 배지내 축적량은 기존 균주 KFCC 10743이 17.8g/ℓ이며, 본 발명에 따른 변이주 B1045균주는 8% 증가된 19.3g/ℓ이었다(5'-크산틸산의 축적농도는 5'-크산틸산나트륨ㆍ7H₂O로 표시하였다).

실시예 2

사용균주 ; 실시예 1과 동일

1차 종배지 ; 실시예 1의 종배지와 동일

2차 종배지 ; 포도당 60g/ℓ, 인산제1칼륨 2g/ℓ, 인산제2칼륨 2g/ℓ, 황산마그네슘 1g/ℓ, 황산철 22㎎/ℓ, 황산아연 15㎎/ℓ, 황산망간 10㎎/ℓ, 황산구리 1㎎/ℓ, 염화칼슘 100㎎/ℓ, 비오틴 150㎍/ℓ, 아데닌 150㎎/ℓ, 구아닌 150㎎/ℓ, 티아민산염 5㎎/ℓ, 소포제 0.6㎖/ℓ, pH 7.2

발효배지 ; 포도당 151g/ℓ, 인산 32g/ℓ, 수산화칼륨 25g/ℓ, 아데닌 198㎎/ℓ, 구아닌 119㎎/ℓ, 황산철 60㎎/ℓ, 황산아연 42㎎/ℓ, 황산망간 15㎎/ℓ, 황산구리 2.4㎎/ℓ, 알라닌염 22㎎/ℓ, NCA 7.5㎎/ℓ, 비오틴 0.4㎎/ℓ, 황산마그네슘 15g/ℓ, 시스틴염 30㎎/ℓ, 히스티딘염 30㎎/ℓ, 염화칼슘 149㎎/ℓ, 티아민염 15㎎/ℓ, 소포제 0.7㎖/ℓ, CSL 27㎖/ℓ, 참치엑기스 6g/ℓ, pH 7.3

1차 종배양 ; 상기 1차 종배양 배지 50㎖을 500㎖ 진탕용 삼각플라스크에 분주하고 121℃에서 20분간 가압 살균하여 냉각한 후 사용균주를 접종하고, 30℃에서 150rpm으로 24시간 진탕 배양하였다.

2차 종배양 ; 2차 종배지를 5ℓ 용량의 실험용 발효조에 2ℓ씩 분주하고, 121℃에서 20분간 가압 살균한 후, 냉각하여 1차 종배양액의 배양완료액 50㎖을 접종한 후, 공기를 0.5vvm으로 공급하면서 900rpm, 33℃에서 24시간 진탕 배양하였다. 배양 중 pH는 암모니아수로 7.3으로 조절하였다.

발효방법 ; 상기 발효배지를 30ℓ용량의 실험용 발효조에 8ℓ씩 분주하고, 121℃에서 20분간 가압살균한 뒤 냉각하여 2차 종배양액을 1.5ℓ씩 접종한 후 공기를 1vvm으로 공급하면서 400rpm, 33℃에서 배양하되, 배양 중 잔존 당농도가 1% 이하가 되면 살균된 포도당을 공급하여 발효배지에 첨가된 총당의 합계를 30%로 조절하였다.배양 중 pH는 암모니아수로 7.3으로 조절하여 70시간 배양하였다. 배양 완료 후, 5'-크산틸산의 배지내 축적량은 종래 균주 KFCC 10743 균주는 109g/ℓ이고, 본 발명의 변이주 B1045는 11% 향상된 121g/ℓ이었다(5'-크산틸산의 축적농도는 5'-크산틸산나트륨ㆍ7H₂O로 표시하였다).

상기한 바와 같이, 본 발명에 따른 변이주 B1045는 5'-크산틴산의 생산에 있어서 종래의 균주인 KFCC 10743에 비하여 10% 내외의 증가된 생산성을 나타냄을 확인할 수 있었다.

따라서, 본 발명에 의하면 5'-크산틴산의 생산성의 증가가 기대되는 미생물을 제공하는 효과가 있다.

이상에서 본 발명은 기재된 구체예에 대해서만 상세히 설명되었지만 본 발명의 기술사상 범위 내에서 다양한 변형 및 수정이 가능함은 당업자에게 있어서 명백한 것이며, 이러한 변형 및 수정이 첨부된 특허청구범위에 속함은 당연한 것이다.

Claims

코리네박테리움 암모니아게네스의 변이주로서 5'-크산틸산을 생산하는 미생물 B1045(한국종균협회 수탁번호 KFCC-11138).
제 1 항에 있어서,

바시트라신 농도 5㎎/ℓ에서 생육하는 미생물 B1045.