KR100402321B1

KR100402321B1 - 5'-크산틸산을 고수율로 생산하는 미생물 코리네박테리움암모니아게네스 에이제트120-62-25 및 그를 이용한5'-크산틸산 생산방법

Info

Publication number: KR100402321B1
Application number: KR10-2001-0000514A
Authority: KR
Inventors: 심재익; 이광호; 한종권; 이진호; 김정환; 오윤석; 박장희; 장재영; 곽영현; 이재흥
Original assignee: 씨제이 주식회사
Priority date: 2001-01-05
Filing date: 2001-01-05
Publication date: 2003-10-22
Also published as: KR20020057471A

Abstract

본 발명은 5'-크산틸산(5'-xanthylic acid, XMP)를 생산하는 코리네박테리움 암모니아게네스(Corynebacterium ammoniagenes) KFCC-10743을 친주로 자외선 조사, N-메틸-N`-니트로-N-니트로소구아니딘(NTG) 등의 변이 유발제로 통상적인 방법에 따라 처리하여 친주의 형질을 변형시켜 퓨린계 합성시스템에서 필수적으로 요구되는 글루타민(glutamin)에 대한 유사체(analoge)인 아자세린(azaserine) 내성주를 선별하여 보다 더 효율적으로 글루타민을 이용함으로써 5’-크산틸산을 고수율, 고 농도로 배양액중에 직접 축적시키는 미생물 및 그를 이용한 5'-크산틸산 생산방법에 관한 것이다.

Description

5'-크산틸산을 고수율로 생산하는 미생물 코리네박테리움 암모니아게네스 에이제트120-62-25 및 그를 이용한 5'-크산틸산 생산방법{A microorganism Corynebacterium ammoniagenes Az120-62-25 being capable of producing 5'-xanthylic acid in higher yield and a producing method of 5'-xanthylic acid by using the same}

본 발명은 5'-크산틸산(XMP)을 생산하는 미생물 및 그를 이용한 5'-크산틸산 생산방법에 관한 것으로, 좀더 구체적으로 코리네박테리움 암모니아게네스(Corynebacterium ammoniagenes) KFCC-10743의 변이주로서 아자세린(Azaserine)에 대한 내성을 가지는 특수한 미생물로서 퓨린계 합성시스템에서 필수적으로 요구되는 글루타민(glutamin)에 대한 유사체(analoge)인 아자세린(azaserine)내성주를 선별하여 보다 더 효율적으로 글루타민을 이용함으로써 기존 균주에 비해 5’-크산틸산의 생산능이 향상된 미생물 및 그를 이용한 5'-크산틸산 생산방법에 관한 것이다.

5’-크산틸산은 퓨린 뉴클레오타이드(Purine nucleotide) 생합성 대사계의 중간 생성물로 5'-구아닐산(GMP)의 제조원료로서 중요한 물질이다. 정미성이 강하고 상품적 가치가 높은 5'-구아닐산의 제조방법으로서 현재 널리 이용되고 있는 방법은 미생물 발효법으로서, 5'-크산틸산을 생산하고 이를 효소학적으로 5'-구아닐산으로 전환시키는 과정이 가장 경제적이어서 5'-구아닐산의 수요만큼 5'-크산틸산도 필요하다. 종래 5'-크산틸산의 제조방법에는 화학합성법, 또는 효모중의 리보핵산을 분해하여 제조된 5'-구아닐산을 탈아미노화하는 제조법, 그리고 발효법으로는 발효배지내 전구물질로 크산틴(Xanthine)을 첨가하는 방법과 미생물 변이주에 의한 제조법, 항생물질 첨가에 의한 제조법(일본특허 소42-1477, 소 44-20390) 및 계면활성제 첨가에 의한 제조법(일본특허 소42-3825, 소42-3838) 등이 알려져 있다. 이 중에서도 미생물 변이주에 의한 5'-크산틸산의 직접적인 발효 제조 방법이 공업적으로 유리하므로 본 발명자들은 기존의 코리네박테리움 암모니아게네스 KFCC-10743이 소유하고 있는 형질을 개량하여 XMP가 최대로 생산될 수 있는 형질을 부여함으로써 XMP의 생산성이 월등히 증가한 변이주를 개발하였다.

퓨린계열의 핵산의 선구물질인 PRPP(5-phosphoribosyl-α-1-phosphate)로부터 5'-크산틸산을 합성하는데는 2분자의 글루타민을 필요로 한다. 그런데 글루탐산나트륨으로부터 글루탐산을 합성하는 효소인 글루타민 신서테이즈(glutamin synthetase)는 글리닌, 알라닌, 히스티딘등의 아미노산 및 CTP, AMP등에 의해서 대단히 정교하게 조절(Escherichia coli Salmonella typhimurium, 1987, p302-320)을 받기 때문에 5'-크산틸산을 합성하는데 있어서 글루타민의 원활한 공급은 필수적이다.

또한 생산된 글루타민은 여러반응의 전구체로서 대단히 많이 사용되고있다.

따라서 5'-크산틸산 합성이 보다더 효율적으로 이루어지기 위해서는 글루타민산의 원활한 합성 및 글루타민을 요구하는 여러 반응 중에서도 5'-크산틸산을 합성하는데 관여하는 PRPP 아미도트랜스퍼라제(amidotransferase) 및 FGAR 아미도트랜스퍼라제(amidotransferase) 두 효소가 다른 효소들보다도 글루타민에 대한 친화력(affinity)을 높이는 것이 대단히 중요하다고 사료된다.

본 발명자들은 먼저 여러 가지의 아미노산이 직접발효에 의한 5'-크산틸산을 생산하는데 어떠한 효과를 나타내는지에 대한 실험을 해 본 결과 L-글루타민을 5'-크산틸산 발효배지에 첨가하여 발효실험을 한 결과 L-글루타민을 첨가하면 5'-크산틸산의 발효농도가 증가함을 확인하고, 현 균주에서 L-글루타민의 적절한 공급이 5'-크산틸산 생산에 있어서의 속도조절단계 (rate-limiting step) 임을 확인하고 L-글루타민의 유사체로 작용하는 아자세린(azaserine)내성을 부여하여, 아자세린에 대한 내성을 부여한 균주가 직접발효법에 의해 5'-크산틸산을 기존에 비해서 고농도, 고수율로 생산할수 있음을 발견하여 본 발명을 완성하였다.

다음에서 본 발명의 미생물분리 및 획득방법을 좀더 구체적으로 설명한다.

본 발명의 미생물 코리네박테리움 암모니아게네스 Az120-62-25는 코리네박테리움 암모니아게네스(Corynebacterium ammoniagenes) KFCC-10743을 친주로하여 자외선조사, N-메틸-N`-니트로-N-니트로소구아니딘 (NTG)등의 변이 유발제로 통상적인 방법에 따라 처리한 후 아자세린이 농도별로 첨가된 (주 3)배지에서 생육할 수 있는 변이주들 중에서 선별된 것이다. 이때 실험에 사용된 배지중의 아자세린의 농도는 300mg/l까지 사용하였으며, 아자세린 농도 200mg/l에서 생육하는 5'-크산틸산 농도가 향상된 균주를 선별하여, 이 균주를 Az120-62-25라 명명하여 제 3자에게 일반분양될 수 있도록 서울시 서대문구 홍제동 소재의 한국종균협회에 2000년 12월 15일자로 수탁번호 제 KFCC-11249호로 기탁하였다.

(주 1) 영양배지 : 포도당 20g/l, 펩톤 10g/l, 효모엑기스 10g/l, 염화나트륨 2.5g/l, 우레아 3g/l, 아데닌 150mg/l, 구아닌 150mg/l, pH 7.2.

(주 2) 최소배지; 포도당 20g/l, 인산제1칼륨 1g/l, 인산제2칼륨 1g/l, 우레아 2g/l, 황산암모늄 3g/l, 황산마그네슘 1g/l, 염화칼슘 100mg/l, 황산철 20mg/l, 황산망간 10mg/l, 황산아연 10mg/l, 비오틴 30μg/l, 티아민산염 0.1mg/l, 황산구리 0.8mg/l, 아데닌 20mg/l, 구아닌 20mg/l, pH 7.2.

(주 3) 아자세린 첨가배지 : (주2) 최소배지에 아자세린 50-300mg/l 첨가한 배지.

본 발명에서 분리한 신규 변이주 코리네박테리움 암모니아게네스 Az20-62-25의 생화학적 특성은 표 1의 기재와 같으며 이들 내용에 의하면 본 발명의 미생물은 200mg/l 농도의 아자세린 첨가배지에서도 생육 가능한 균주임을 알 수 있다.

본 발명 미생물의 특성은 다음의 표 1에 기재된 바와 같다.

아자세린에 대한 내성 비교

	아자세린 농도(mg/l)
	0	50	100	150	200	250	300
KFCC-10743	+++	++	-	-	-	-	-
Az120-62-25	+++	+++	+++	++	+	-	-

(주) +: 생육; - : 생육치 못함, 30℃에서 5일 배양.

실시예 1

사용 균주: 본 발명의 미생물 Az120-62-25, KFCC-10743.

종배지: 포도당 30g/l, 펩톤 15g/l, 효모엑기스 15g/l, 염화나트륨 2.5g/l, 우레아 3g/l, 아데닌 150mg/l, 구아닌 150mg/l, pH 7.2

발효배지:

① 본배지 : 포도당 60g/l, 황산마그네슘 10g/l, 황산철 20mg/l, 황산아연 10mg/l, 황산망간 10mg/l, 아데닌 30mg/l, 구아닌 30mg/l, 비오틴 100μg/l, 황산구리 1mg/l, 티아민염산염 5mg/l, 염화칼슘 10mg/l, pH 7.2

② 별살배지 :인산제1칼륨 10g/l, 인산제2칼륨 10g/l, 우레아 7g/l, 황산암모늄 5g/l.

발효방법

상기 종배지 5ml을 지름 18mm 시험관에 분주하고 상법에 따라 가압 살균한 후 사용 균주를 접종하고 180rpm으로 30℃에서 18시간 진탕 배양하여 종배양액으로 사용하였다. 발효배지 중 본배지와 별살배지를 각각 상법에 따라 가압 살균하여 미리 가압 살균한 500ml 용량의 진탕용 삼각 플라스크에 29ml과 10ml 씩 분주하고 종배양액 1ml을 식균한 다음 90시간 배양하였다. 회전수는 200rpm, 온도 30℃로 조절하였다. 배양 완료 후 5'-크산틸산의 배지내 축적량은 기존 균주 KFCC-10743이 22.3g/l 이며, 본 발명 변이주 Az120-62-25균주는 11% 향상된 25.1g/l 이었다(5'-크산틸산의 축적농도는 5'-크산틸산 나트륨·7H₂O로 표시하였다).

실시예 2

사용균주: 실시예 1과 동일.

1차 종배지: 실시예 1의 1차 종배지와 동일.

2차 종배지: 포도당 60g/l, 인산제1칼륨 2g/l, 인산제2칼륨 2g/l, 황산마그네슘 1g/l, 황산철 22mg/l, 황산아연 15mg/l, 황산망간 10mg/l, 황산구리 1mg/l, 염화칼슘 100mg/l, 비오틴 150ug/l, 아데닌 150mg/l, 구아닌 150mg/l, 티아민산염 5mg/l, 소포제 0.6ml/l, pH 7.2.

발효배지: 포도당 151g/l, 인산 32g/l, 수산화칼륨 25g/l, 아데닌 198mg/l, 구아닌 119mg/l, 황산철 60mg/l, 황산아연 42mg/l, 황산망간 15mg/l, 황산구리 2.4mg/l, 알라닌염 22mg/l, NCA 7.5mg/l, 비오틴 0.4mg/l, 황산마그네슘 15g/l, 시스틴염 30mg/l, 히스티딘염 30mg/l, 염화칼슘 149mg/l, 티아민염 15mg/l, 소포제 0.7ml/l, CSL 27ml/l, 참치엑기스 6g/l, pH 7.3.

1차 종배양: 상기 1차 종배양 배지 50ml을 500ml 진탕용 삼각 플라스크에 분주하고 121℃에서 20분간 가압 살균하여 냉각한 후 사용균주를 접종하고 30℃에서180rpm으로 24시간 진탕 배양하였다.

2차 종배양: 2차 종배지를 5리터 용량의 실험용 발효조에 2리터씩 분주하고 121℃에서 10분간 가압 살균한 후 냉각하여 1차 종배양액의 배양완료액 50ml을 접종한 후 공기를 0.5vvm으로 공급하면서 900rpm, 31℃에서 24시간 배양하였다. 배양 중 pH는 암모니아수로 7.3로 조절하였다.

발효방법

상기 발효배지를 30리터 용량의 실험용 발효조에 8리터씩 분주하고 121℃에서 20분간 가압살균한 뒤 냉각하여 2차 종배양액을 1.5리터씩 접종한 후 공기를 1vvm으로 공급하면서 400rpm, 33℃에서 배양하되 배양중 잔존 당농도가 1% 이하가 되면 살균된 포도당을 공급하여 발효배지에 첨가된 총당의 합계가 30%로 조절하였다. 배양 중 pH는 암모니아수로 7.3로 조절하여 90시간 배양하였다. 배양완료 후 5'-크산틸산의 배지내 축적량은 종래균주 KFCC-10743 균주는 124g/l이고 본 발명의 변이주 코리네박테리움 암모니아게네스 Az120-62-25는 종래균주에 비해 약 13% 향상된 140g/l 이었다(5'-크산틸산의 축적농도는 5'-크산틸산 나트륨·7H₂O로 표시하였다).

본 발명은 5'-크산틸산(XMP)을 생산하는 미생물 및 그를 이용한 5'-크산틸산 생산방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는 코리네박테리움 암모니아게네스(Corynebacterium ammoniagenes) KFCC-10743의 변이주로서아자세린(Azaserine)에 대한 내성을 가지는 특수한 미생물로서 퓨린계 합성시스템에서 필수적으로 요구되는 글루타민(glutamin)에 대한 유사체(analoge)인 아자세린(azaserine)내성주를 선별하여 보다 더 효율적으로 글루타민을 이용함으로써 기존 균주에 비해 5’-크산틸산의 생산능이 향상된 미생물 및 그를 이용한 5'-크산틸산 생산방법에 관한 것으로, 기존의 코리네박테리움 암모니아게네스 KFCC-10743이 소유하고 있는 형질을 개량하여 XMP가 최대로 생산될 수 있는 형질을 부여함으로써 XMP의 생산성이 월등히 증가한 변이주를 개발하였다.

Claims

5'-크산틸산(XMP)을 생산하고, 아자세린에 내성을 갖는 코리네박테리움 암모니아게네스 변이주 Az120-62-25(KFCC-11249).
제 1항에 있어서, 극미량 내지 200mg/l의 아자세린 존재하에서 생육가능한 것을 특징으로 하는 코리네박테리움 암모니아게네스 변이주 Az120-62-25(KFCC-11249).
제 1항에 따른 미생물 코리네박테리움 암모니아게네스 변이주 Az120-62-25(KFCC-11249)를 1차 종배지에서 30℃, 180rpm, pH 7.3에서 24시간 진탕배양한 후, 2차 종배지에서 31℃, 900rpm, pH 7.3에서 24시간 진탕배양하여 활성화시킨 후, 발효배지에서 33℃, 400rpm에서 90시간동안 진탕배양하면서, 배양액내 잔존 당농도가 1%이하이면 포도당이 첨가된 추가당을 배양액내 총당함량이 30%가 되도록 첨가하여 배양하는 것을 특징으로 하는 5'-크산틸산의 생산방법.