JP4035135B2 - ５’−キサンチル酸を生産する微生物 - Google Patents
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Description
本発明は、5'-キサンチル酸を生産する微生物自体に関し、より詳細にはコリネバクテリウム・アンモニアゲネス（Corynebacterium ammoniagenes）KCCM 10340の変異株であって、同一の条件下での増殖活性を増強する目的で、多段階の培養初期の増殖静止期を迅速に克服できる突然変異株を選別して、同一の発酵時間内に5'-キサンチル酸を高収率・高濃度で培養液中に直接蓄積させることができる微生物に関する。
5'-キサンチル酸は核酸生合成代謝系の中間物質であって、動植物の体内で生理的に重要な意味を有するだけでなく、食品・医薬品および各種の医療分野などの多方面において利用されている。本発明は、出願人の開発した公知の菌株、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス KCCM 10340から突然変異株を選別して、公知技術よりも直接発酵法で高濃度・高収率で5'-キサンチル酸を生産する菌株を開発し、本発明を完成した。
5'-キサンチル酸はプリンヌクレオチド生合成代謝系の中間生成物であって、5'-グアニル酸（GMP）を製造するための原料として重要な物質である。精製性が高く高品質の5'-グアニル酸の製造方法として現在広く利用されている方法は微生物発酵法であって、5'-キサンチル酸を最初に生産し、これを酵素的に5'-グアニル酸に転換して5'-グアニル酸を製造する方法である。これは最も経済的であるが、5'-グアニル酸に相当する量の5'-キサンチル酸を必要とする。従来の5'-キサンチル酸の製造方法としては、化学合成法、または酵母内のリボ核酸を分解して生成される5'-グアニル酸を脱アミノ化する製造方法、および発酵法として発酵培地中に前駆物質としてキサンチンを添加する方法、微生物変異株による製造方法、抗生物質添加による製造方法（特公昭第42-1477号、特公昭第44-20390号（特許文献１、２））、ならびに界面活性剤添加による製造方法（特公昭第42-3825号、特公昭第42-3838号（特許文献３、４））などが知られている。これらのうち、微生物変異株による5'-キサンチル酸の直接的な発酵製造方法が工業的に有利であるため、本発明者らは、既存のコリネバクテリウム・アンモニアゲネス KCCM 10340が有する性質を改良して、5'-キサンチル酸を最大限に生産しうる性質を付与することにより、5'-キサンチル酸の生産性が増大した変異株を開発した。
大部分の微生物は、充分な栄養成分が供給されて、一定の通気条件下で培養を持続すると、菌体量がそれ以上増加し得ない状態に至り、特に増殖依存的な生産物である１次代謝産物を生成する微生物においては、生産物の濃度がそれ以上増加しない状態に至る。これは主に、溶存酸素供給量の制限による現象である。溶存酸素供給量の制限を取り除くためには、通気条件および攪拌条件などを改善する方法があるが、これには実際の製造方法においては技術的および経済的な限界がある。このような限界を克服し、そして制限された溶存酸素供給量で、菌体量および微生物の種々の生理活性を増加させて5'-キサンチル酸の収率および濃度を増大させることは、同一条件下で増殖特性が優れた新規微生物を誘導することにより可能になるであろう、と本発明者らは判断した。従って本発明者らは、同一の条件下で多段階の培養初期の増殖静止期を迅速に克服できて、増殖特性が優れている突然変異株を誘導して選別する方法によって得られた変異株が、最も効果的であり、直接発酵法で既存技術に比べて5'-キサンチル酸を高濃度・高収率に生産できることを発見して、本発明を完成した。
特公昭第42-1477号
特公昭第44-20390号
特公昭第42-3825号
特公昭第42-3838号
本発明はコリネバクテリウム・アンモニアゲネス（Corynebacterium ammoniagenes）KCCM 10340の変異株であって、5'-キサンチル酸を生産する微生物、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス CJXSP 0201（KCCM-10448）に関するものである。
本発明の微生物 CJXSP 0201は、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス KCCM 10340を親株として用いた突然変異誘導法により得られた変異株の中から選別されたものである。ここで、突然変異誘導法とは次の通りである。下記の栄養培地（註１）5mLを、直径18mmの試験管に分株し、常法により加圧殺菌した後、使用菌株コリネバクテリウム・アンモニアゲネス KCCM 10340を接種し、200rpm、30℃で18時間振とう培養し、これを種培養液として用いた。下記の最小培地（註２）40mLを入れ加圧殺菌した500mL容量の振とう用三角フラスコに、該種培養液50μLを接種した。その後、200rpm、30℃で、24時間培養して、初期対数増殖期に達した後、更にこの培養液から50μLを採取して、最小培地40mLの入った次の三角フラスコに接種した。そして、それが初期対数増殖期（光学密度 0.5（λ＝562nm））に再び達した後、この培養液から50μLを採取して、最小培地の入った三角フラスコに接種した。このような過程、即ちフラスコ間の継代培養を20回繰り返した。最終培養液を寒天1.5%を含有する最小培地（註２）の入ったペトリ皿に希釈塗抹して、30℃の培養器でコロニーが形成されるまで培養した。形成されたコロニーのうち、相対的に増殖速度が早いコロニーを優れた変異株として選別した。このようにして得た菌株群から5'-キサンチル酸の生産特性および増殖特性が優れた菌株１株を選別して、CJXSP 0201と命名し、ブダペスト条約の下、2002年11月21日付で韓国種菌協会（KCCM：Korean Culture Center of Microorganisms）に寄託して、寄託番号KCCM-10448を得た。既存の菌株KCCM 10340はコロニーの形成時間が38時間であるに対し、本発明の変異株CJXSP 0201（KCCM-10448）は31時間でコロニーを確認することができたので、相対的に増殖特性が優れた変異株であることが確認できた。
（註１）栄養培地：ブドウ糖20g/L，ペプトン10g/L，酵母エキス10g/L，塩化ナトリウム2.5g/L，尿素3g/L，アデニン150mg/L，グアニン150mg/L，pH7.2
（註２）最小培地：ブドウ糖20g/L，第一燐酸カリウム1g/L，第二燐酸カリウム1g/L，尿素2g/L，硫酸アンモニウム3g/L，硫酸マグネシウム1g/L，塩化カルシウム100mg/L，硫酸鉄20mg/L，硫酸マンガン10mg/L，硫酸亜鉛10mg/L，ビオチン30μg/L，チアミン酸塩0.1mg/L，硫酸銅0.8mg/L，アデニン20mg/L，グアニン20mg/L，pH7.2
（註１）栄養培地：ブドウ糖20g/L，ペプトン10g/L，酵母エキス10g/L，塩化ナトリウム2.5g/L，尿素3g/L，アデニン150mg/L，グアニン150mg/L，pH7.2
（註２）最小培地：ブドウ糖20g/L，第一燐酸カリウム1g/L，第二燐酸カリウム1g/L，尿素2g/L，硫酸アンモニウム3g/L，硫酸マグネシウム1g/L，塩化カルシウム100mg/L，硫酸鉄20mg/L，硫酸マンガン10mg/L，硫酸亜鉛10mg/L，ビオチン30μg/L，チアミン酸塩0.1mg/L，硫酸銅0.8mg/L，アデニン20mg/L，グアニン20mg/L，pH7.2
（実施例１）
使用菌株：本発明の微生物 コリネバクテリウム・アンモニアゲネス CJXSP 0201、およびコリネバクテリウム・アンモニアゲネス KCCM 10340
種培地：ブドウ糖30g/L，ペプトン15g/L，酵母エキス15g/L，塩化ナトリウム2.5g/L，尿素3g/L，アデニン150mg/L，グアニン150mg/L，pH7.2
発酵培地：（１）本培地：ブドウ糖60g/L，硫酸マグネシウム10g/L，硫酸鉄20mg/L，硫酸亜鉛10mg/L，硫酸マンガン10mg/L，アデニン30mg/L，グアニン30mg/L，ビオチン100μg/L，硫酸銅1mg/L，チアミン塩酸塩5mg/L，塩化カルシウム10mg/L，pH7.2
（２）別培地：第一燐酸カリウム10g/L，第二燐酸カリウム10g/L，尿素7g/L，硫酸アンモニウム5g/L
使用菌株：本発明の微生物 コリネバクテリウム・アンモニアゲネス CJXSP 0201、およびコリネバクテリウム・アンモニアゲネス KCCM 10340
種培地：ブドウ糖30g/L，ペプトン15g/L，酵母エキス15g/L，塩化ナトリウム2.5g/L，尿素3g/L，アデニン150mg/L，グアニン150mg/L，pH7.2
発酵培地：（１）本培地：ブドウ糖60g/L，硫酸マグネシウム10g/L，硫酸鉄20mg/L，硫酸亜鉛10mg/L，硫酸マンガン10mg/L，アデニン30mg/L，グアニン30mg/L，ビオチン100μg/L，硫酸銅1mg/L，チアミン塩酸塩5mg/L，塩化カルシウム10mg/L，pH7.2
（２）別培地：第一燐酸カリウム10g/L，第二燐酸カリウム10g/L，尿素7g/L，硫酸アンモニウム5g/L
発酵方法：前記種培地5mLを直径18mmの試験管に分株し、常法により加圧殺菌した後に使用菌株コリネバクテリウム・アンモニアゲネス KCCM 10340およびコリネバクテリウム・アンモニアゲネス CJXSP 0201をそれぞれ接種して、180rpm、30℃で、18時間振とう培養し、種培養液として用いた。発酵培地として、本培地と別培地をそれぞれ常法により加圧殺菌し、予め加圧殺菌した500mL容量の振とう用３角フラスコに本培地29mLと別培地10mLを入れて、上記種培養液1mLを殺菌した後、90時間培養した。回転数は200rpm、温度は30℃に調節した。培養終了後の5'-キサンチル酸の培地中の蓄積量は既存の菌株KCCM 10340が23.0g/Lであり、本発明の変異株CJXSP 0201菌株は24.7g/Lであった（5'-キサンチル酸の蓄積濃度は5'-キサンチル酸ナトリウム・7H2Oで表される）。
（実施例２）
使用菌株：実施例１と同一
１次種培地：実施例１の種培地と同一
２次種培地：ブドウ糖60g/L，第一燐酸カリウム2g/L，第二燐酸カリウム2g/L，硫酸マグネシウム1g/L，硫酸鉄22mg/L，硫酸亜鉛15mg/L，硫酸マンガン10mg/L，硫酸銅1mg/L，塩化カルシウム100mg/L，ビオチン150μg/L，アデニン150mg/L，グアニン150mg/L，チアミン酸塩5mg/L，消泡剤0.6mL/L，pH7.2
発酵培地：ブドウ糖151g/L，燐酸32g/L，水酸化カリウム25g/L，アデニン198mg/L，グアニン119mg/L，硫酸鉄60mg/L，硫酸亜鉛42mg/L，硫酸マンガン15mg/L，硫酸銅2.4mg/L，アラニン塩22mg/L，NCA 7.5mg/L，ビオチン0.4mg/L，硫酸マグネシウム15g/L，シスチン塩30mg/L，ヒスチジン塩30mg/L，塩化カルシウム149mg/L，チアミン塩15mg/L，消泡剤0.7mL/L，CSL27mL/L，つむぶり（マグロ）エキス6g/L，pH7.3
使用菌株：実施例１と同一
１次種培地：実施例１の種培地と同一
２次種培地：ブドウ糖60g/L，第一燐酸カリウム2g/L，第二燐酸カリウム2g/L，硫酸マグネシウム1g/L，硫酸鉄22mg/L，硫酸亜鉛15mg/L，硫酸マンガン10mg/L，硫酸銅1mg/L，塩化カルシウム100mg/L，ビオチン150μg/L，アデニン150mg/L，グアニン150mg/L，チアミン酸塩5mg/L，消泡剤0.6mL/L，pH7.2
発酵培地：ブドウ糖151g/L，燐酸32g/L，水酸化カリウム25g/L，アデニン198mg/L，グアニン119mg/L，硫酸鉄60mg/L，硫酸亜鉛42mg/L，硫酸マンガン15mg/L，硫酸銅2.4mg/L，アラニン塩22mg/L，NCA 7.5mg/L，ビオチン0.4mg/L，硫酸マグネシウム15g/L，シスチン塩30mg/L，ヒスチジン塩30mg/L，塩化カルシウム149mg/L，チアミン塩15mg/L，消泡剤0.7mL/L，CSL27mL/L，つむぶり（マグロ）エキス6g/L，pH7.3
１次種培養：１次種培地50mLを500mLの振とう用三角フラスコに分株し、121℃で20分間加圧殺菌し、冷却した後、使用菌株コリネバクテリウム・アンモニアゲネス KCCM 10340およびコリネバクテリウム・アンモニアゲネス CJXSP 0201をそれぞれ接種して、30℃、180rpmで24時間振とう培養した。
２次種培養：２次種培地を5L容量の実験用発酵槽に2Lずつ分株し、121℃で10分間加圧殺菌した後、冷却し、１次種培養の培養終了液50mLを接種し、空気を0.5vvmで供給しながら900rpm、31℃で24時間培養した。培養中のpHはアンモニア水溶液で7.3に調節した。
２次種培養：２次種培地を5L容量の実験用発酵槽に2Lずつ分株し、121℃で10分間加圧殺菌した後、冷却し、１次種培養の培養終了液50mLを接種し、空気を0.5vvmで供給しながら900rpm、31℃で24時間培養した。培養中のpHはアンモニア水溶液で7.3に調節した。
発酵方法：前記発酵培地を30L容量の実験用発酵槽に8Lずつ分株し、121℃で20分間加圧殺菌し、冷却した後、２次種培養液を1.5Lずつ接種した後、空気を1vvmで供給しながら400rpm、33℃で培養した。培養中の残存糖濃度が1％以下になれば、殺菌済みのブドウ糖を供給して発酵培地中の全糖濃度を30％になるように調節した。培養中のpHはアンモニア水溶液で7.3に調節して90時間培養した。培養終了後の5'-キサンチル酸の培地中の蓄積量は、従来の菌株 KCCM 10340が137.2g/Lであり、本発明の変異株 CJXSP 0201が146.8g/Lであった（5'-キサンチル酸の蓄積濃度は5'-キサンチル酸ナトリウム・7H2Oで表される）。
本発明においては、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス（Corynebacterium ammoniagenes）KCCM 10340を親株として用い、紫外線照射、N-メチル-N'-ニトロ-N-ニトロソグアニジン（NTG）などの変異誘発剤で、通常の方法により処理して親株の性質を改良して、培養過程で添加した高濃度のブドウ糖および種々の炭素源、ならびに培養後半で培養液内に蓄積される5'-キサンチル酸により、菌体外部の浸透圧が増加して、5'-キサンチル酸生産細胞の正常な生理活性が阻害され、菌体の生産能が低下して、5'-キサンチル酸の生成率が低下するのを防止しうる耐浸透圧性の性質が付与された菌株KCCM 10340を得ることができた。これにより、同一条件下での増殖活性を増強するために多段階の培養初期の増殖静止期を迅速に克服する突然変異株を選別して、同一の発酵時間内に5'-キサンチル酸を高収率・高濃度で培養液中に直接蓄積させることができるという効果がえられる。
Claims (2)
- 5'-キサンチル酸を生産する、培養初期の増殖静止期を迅速に克服できるコリネバクテリウム・アンモニアゲネス（Corynebacterium Ammoniagenes）CJXSP 0201（受託番号：KCCM-10448）。
- 請求項１に記載のコリネバクテリウム・アンモニアゲネス CJXSP 0201（受託番号：KCCM-10448）を利用して5'-キサンチル酸を生産する方法。
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