JP2000295996A - プリンヌクレオチドの製造法 - Google Patents
プリンヌクレオチドの製造法Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 同一発酵槽内で効率よくヌクレオチドを製造
するためのプロセスの開発を課題とする。 【解決手段】 本発明によれば、プリンヌクレオチドの
前駆物質を生産する能力を有し、かつ該前駆物質よりプ
リンヌクレオチドを合成可能な酵素を誘導発現すること
のできるＤＮＡを導入した微生物を培地に培養し、該培
養物中にプリンヌクレオチドの前駆物質を生成蓄積させ
た後、該前駆物質よりプリンヌクレオチドを合成するこ
とのできる酵素を誘導発現させ、該培養物中に該前駆物
質よりプリンヌクレオチドを生成蓄積させ、該培養物中
より該プリンヌクレオチドを採取することを特徴とす
る、プリンヌクレオチドの製造法および該製造法におい
て用いることのできる微生物を提供することができる。
するためのプロセスの開発を課題とする。 【解決手段】 本発明によれば、プリンヌクレオチドの
前駆物質を生産する能力を有し、かつ該前駆物質よりプ
リンヌクレオチドを合成可能な酵素を誘導発現すること
のできるＤＮＡを導入した微生物を培地に培養し、該培
養物中にプリンヌクレオチドの前駆物質を生成蓄積させ
た後、該前駆物質よりプリンヌクレオチドを合成するこ
とのできる酵素を誘導発現させ、該培養物中に該前駆物
質よりプリンヌクレオチドを生成蓄積させ、該培養物中
より該プリンヌクレオチドを採取することを特徴とす
る、プリンヌクレオチドの製造法および該製造法におい
て用いることのできる微生物を提供することができる。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、調味料として大き
な需要のあるプリンヌクレオチドの製造法および該製造
法に用いることのできる微生物に関する。
な需要のあるプリンヌクレオチドの製造法および該製造
法に用いることのできる微生物に関する。
【０００２】
【従来の技術】５'−グアニル酸（以下、ＧＭＰと略
す）と５'−イノシン酸（以下、ＩＭＰと略す）は強い
呈味性を示すプリンヌクレオチドであり、化学調味料成
分として広く用いられている。
す）と５'−イノシン酸（以下、ＩＭＰと略す）は強い
呈味性を示すプリンヌクレオチドであり、化学調味料成
分として広く用いられている。
【０００３】これら呈味性ヌクレオチド類の製法とし
て、酵母菌体から抽出したＲＮＡをリボヌクレアーゼＰ
１により加水分解した後に必要な５'−ヌクレオチドを
分離精製する方法〔Food Techhnol., 18, 287 (196
4)〕、ＩＭＰを生産する能力を有する微生物を用いて、
ＩＭＰを直接発酵生産する方法〔Agricultural and Bio
logical Chemistry, 46, 2257 (1982)〕、イノシンやグ
アノシン等のヌクレオシド類を化学的リン酸化によりヌ
クレオチドに変換する方法〔Bulletin of the Chemical
Society of Japan, 42, 3505 (1969)〕、バチルス・メ
ガテリウムの変異株を用いて５−アミノ−４−イミダゾ
ールカルボキサミドリボシド（以下、ＡＩＣＡＲと略
す）を発酵法で生産し、ＡＩＣＡＲから化学的合成法に
よって製造する方法〔Biotechnol. Bioeng., 9, 329 (1
967)、J. Org. Chem., 32, 1825 (1967)〕、５'−キサ
ンチル酸（以下、ＸＭＰと略す）生産性のコリネバクテ
リウム・アンモニアゲネスの変異株を培地に培養してＸ
ＭＰを生成蓄積させ、次いでセルフクローニングにより
ＸＭＰアミナーゼ（別名ＧＭＰ合成酵素）活性を強化し
た大腸菌菌体を培養して酵素源とし、ＸＭＰから酵素反
応によってＧＭＰを製造する方法〔Biosci. Biotech. B
iochem., 61, 840 (1997)、特開昭63-233798〕等が知ら
れている。
て、酵母菌体から抽出したＲＮＡをリボヌクレアーゼＰ
１により加水分解した後に必要な５'−ヌクレオチドを
分離精製する方法〔Food Techhnol., 18, 287 (196
4)〕、ＩＭＰを生産する能力を有する微生物を用いて、
ＩＭＰを直接発酵生産する方法〔Agricultural and Bio
logical Chemistry, 46, 2257 (1982)〕、イノシンやグ
アノシン等のヌクレオシド類を化学的リン酸化によりヌ
クレオチドに変換する方法〔Bulletin of the Chemical
Society of Japan, 42, 3505 (1969)〕、バチルス・メ
ガテリウムの変異株を用いて５−アミノ−４−イミダゾ
ールカルボキサミドリボシド（以下、ＡＩＣＡＲと略
す）を発酵法で生産し、ＡＩＣＡＲから化学的合成法に
よって製造する方法〔Biotechnol. Bioeng., 9, 329 (1
967)、J. Org. Chem., 32, 1825 (1967)〕、５'−キサ
ンチル酸（以下、ＸＭＰと略す）生産性のコリネバクテ
リウム・アンモニアゲネスの変異株を培地に培養してＸ
ＭＰを生成蓄積させ、次いでセルフクローニングにより
ＸＭＰアミナーゼ（別名ＧＭＰ合成酵素）活性を強化し
た大腸菌菌体を培養して酵素源とし、ＸＭＰから酵素反
応によってＧＭＰを製造する方法〔Biosci. Biotech. B
iochem., 61, 840 (1997)、特開昭63-233798〕等が知ら
れている。
【０００４】以上をまとめると、これまで開発された呈
味性ヌクレオチドの生産法は原理的に次の３法に大別で
きる〔高尾彰一ら編、応用微生物学、文永堂出版（１９
９６）〕。即ち、 酵母ＲＮＡを微生物酵素または化学的に分解する方法
（ＲＮＡ分解法）、 糖と窒素源・リン酸源を含む培地で微生物の変異株を
培養し、ヌクレオチドを直接生産させる方法（直接発酵
法）、 発酵法でヌクレオチド合成の中間体を生産したのち、
化学的または酵素的にヌクレオチドに変換する方法（発
酵と化学合成または酵素転換の複合プロセス）である。
味性ヌクレオチドの生産法は原理的に次の３法に大別で
きる〔高尾彰一ら編、応用微生物学、文永堂出版（１９
９６）〕。即ち、 酵母ＲＮＡを微生物酵素または化学的に分解する方法
（ＲＮＡ分解法）、 糖と窒素源・リン酸源を含む培地で微生物の変異株を
培養し、ヌクレオチドを直接生産させる方法（直接発酵
法）、 発酵法でヌクレオチド合成の中間体を生産したのち、
化学的または酵素的にヌクレオチドに変換する方法（発
酵と化学合成または酵素転換の複合プロセス）である。
【０００５】上記のＲＮＡ分解法は、呈味性のプリン
ヌクレオチドとほぼ等量のピリミジンヌクレオチドが副
生してくることから、精製工程は煩雑とならざるを得な
い。の直接発酵法は、一般的にヌクレオチドの膜透過
性が障害となるため細胞外に著量のヌクレオチドを生成
蓄積できる高生産菌の育種が容易ではなく、経済的に満
足のいく生産性を得るのが難しい。特にＧＭＰについて
は、これまで直接生産については知られていない。ただ
し、ＸＭＰは例外的に著量生成蓄積することが知られて
いる[高尾彰一ら編、応用微生物学、文永堂出版（１９
９６）]。そのため、現在、経済的に有利な呈味性ヌク
レオチドの製造法として、の発酵と化学合成または酵
素転換との複合プロセスが工業的に広く用いられてい
る。
ヌクレオチドとほぼ等量のピリミジンヌクレオチドが副
生してくることから、精製工程は煩雑とならざるを得な
い。の直接発酵法は、一般的にヌクレオチドの膜透過
性が障害となるため細胞外に著量のヌクレオチドを生成
蓄積できる高生産菌の育種が容易ではなく、経済的に満
足のいく生産性を得るのが難しい。特にＧＭＰについて
は、これまで直接生産については知られていない。ただ
し、ＸＭＰは例外的に著量生成蓄積することが知られて
いる[高尾彰一ら編、応用微生物学、文永堂出版（１９
９６）]。そのため、現在、経済的に有利な呈味性ヌク
レオチドの製造法として、の発酵と化学合成または酵
素転換との複合プロセスが工業的に広く用いられてい
る。
【０００６】この複合プロセスでは、全体の生産性向上
の１つのポイントは、前段の発酵工程におけるヌクレオ
チド合成中間体の生産収率を高めることにある。従っ
て、ＸＭＰ、グアノシンまたはイノシンの高生産微生物
が数多く育種されている〔Agricultural and Biologica
l Chemistry, 42, 399 (1978)、Agricaltural and Biol
ogical Chemistry, 43, 1739 (1979)、Agricultural an
d Biological Chemistry, 46, 2347 (1982)〕。
の１つのポイントは、前段の発酵工程におけるヌクレオ
チド合成中間体の生産収率を高めることにある。従っ
て、ＸＭＰ、グアノシンまたはイノシンの高生産微生物
が数多く育種されている〔Agricultural and Biologica
l Chemistry, 42, 399 (1978)、Agricaltural and Biol
ogical Chemistry, 43, 1739 (1979)、Agricultural an
d Biological Chemistry, 46, 2347 (1982)〕。
【０００７】後段の工程、即ち化学的または酵素的にヌ
クレオチドに変換する工程も種々の方法が開発されてい
る。化学的方法としては、部位特異的なリン酸化反応
（ヌクレオシド→５'−ヌクレオチド）〔Bulletin of t
he Chemical Society of Japan, 42, 3505 (1969)〕が
工業的に用いられている。しかしながら、化学的リン酸
化反応のためには、リン酸基受容体であるヌクレオシド
を必要な純度まで精製する中間工程が必要であり、ま
た、発酵生産に用いた発酵槽とは別の化学反応槽も必要
となる。そのため、もう一方の酵素的アミノ化法および
リン酸化法が注目され、種々検討されている。これまで
にアミノ化に関してはＸＭＰアミナーゼによる方法が知
られている〔高尾彰一ら編、応用微生物学、文永堂出版
（１９９６）〕。
クレオチドに変換する工程も種々の方法が開発されてい
る。化学的方法としては、部位特異的なリン酸化反応
（ヌクレオシド→５'−ヌクレオチド）〔Bulletin of t
he Chemical Society of Japan, 42, 3505 (1969)〕が
工業的に用いられている。しかしながら、化学的リン酸
化反応のためには、リン酸基受容体であるヌクレオシド
を必要な純度まで精製する中間工程が必要であり、ま
た、発酵生産に用いた発酵槽とは別の化学反応槽も必要
となる。そのため、もう一方の酵素的アミノ化法および
リン酸化法が注目され、種々検討されている。これまで
にアミノ化に関してはＸＭＰアミナーゼによる方法が知
られている〔高尾彰一ら編、応用微生物学、文永堂出版
（１９９６）〕。
【０００８】また、リン酸化については、ホスホトラン
スフェラーゼ、キナーゼあるいはホスファターゼを利用
したリン酸化法が知られており、この中ではキナーゼあ
るいはホスファターゼを利用した反応がより効率の良い
方法として検討されている。例えば、エシェリヒア・コ
リのイノシングアノシンキナーゼをコードする遺伝子を
導入したエシェリヒア・コリ菌株を用いる５'−ヌクレ
オチドの製造法（WO91/08286号）、エキシグオバクテリ
ウム・アセチリカムのイノシングアノシンキナーゼをコ
ードする遺伝子を導入したコリネバクテリウム・アンモ
ニアゲネス菌株を用いる５'−ヌクレオチドの製造法(WO
96/30501号)、モルガネラ・モルガニのフォスファター
ゼ遺伝子にランダム変異を付与した遺伝子を導入したエ
シェリヒア・コリ菌株を用いる5'-ヌクレオチドの製造
法(特開平9-37785、特開平10-201481)がある。
スフェラーゼ、キナーゼあるいはホスファターゼを利用
したリン酸化法が知られており、この中ではキナーゼあ
るいはホスファターゼを利用した反応がより効率の良い
方法として検討されている。例えば、エシェリヒア・コ
リのイノシングアノシンキナーゼをコードする遺伝子を
導入したエシェリヒア・コリ菌株を用いる５'−ヌクレ
オチドの製造法（WO91/08286号）、エキシグオバクテリ
ウム・アセチリカムのイノシングアノシンキナーゼをコ
ードする遺伝子を導入したコリネバクテリウム・アンモ
ニアゲネス菌株を用いる５'−ヌクレオチドの製造法(WO
96/30501号)、モルガネラ・モルガニのフォスファター
ゼ遺伝子にランダム変異を付与した遺伝子を導入したエ
シェリヒア・コリ菌株を用いる5'-ヌクレオチドの製造
法(特開平9-37785、特開平10-201481)がある。
【０００９】リン酸基供与体としては、種々の化合物が
検討されており、例えば、Ｐ−ニトロフェニルリン酸を
用いる方法（特公昭39-2985号）、無機リン酸を用いる
方法（特公昭42-1186号、特公昭49-44350号）、ポリリ
ン酸を用いる方法（特開昭53-56390号）、アセチルリン
酸を用いる方法（特開昭56-82098号）、ＡＴＰを用いる
方法（特開昭63-230094号）、ポリリン酸、フェニルリ
ン酸、カルバミルリン酸を用いる方法（特開平9-37785
号）、ピロリン酸を用いる方法(特開平9-37785、特開平
10-201481)等が知られている。
検討されており、例えば、Ｐ−ニトロフェニルリン酸を
用いる方法（特公昭39-2985号）、無機リン酸を用いる
方法（特公昭42-1186号、特公昭49-44350号）、ポリリ
ン酸を用いる方法（特開昭53-56390号）、アセチルリン
酸を用いる方法（特開昭56-82098号）、ＡＴＰを用いる
方法（特開昭63-230094号）、ポリリン酸、フェニルリ
ン酸、カルバミルリン酸を用いる方法（特開平9-37785
号）、ピロリン酸を用いる方法(特開平9-37785、特開平
10-201481)等が知られている。
【００１０】しかしながら、これらの方法にあっては使
用する基質が高価または不安定であったり、反応副生物
が生じるため精製工程が煩雑になる等、工業的に有利な
方法とはいえない。このため、経済性を満たす実用的な
方法として、微生物が糖代謝の過程で無機リン酸を利用
してＡＭＰまたはＡＤＰからＡＴＰを再生させるＡＴＰ
再生系を利用したヌクレオチド生産システムが開発され
ている。例えば、ＸＭＰ生産菌が有しているグルコース
を代謝してＡＴＰを生合成する活性をＡＴＰ再生系とし
て用いる方法がある。このＡＴＰ再生系と、ＸＭＰおよ
びＡＴＰからＧＭＰを生成する能力を持つ微生物のＸＭ
Ｐアミナーゼ活性を共役させることによって、ＡＴＰの
代わりに安価なグルコースと無機リン酸をＡＴＰ再生基
質とするＧＭＰの製法がある〔Biosci. Biotech. Bioch
em., 61, 840 (1997)〕。また、この方法で、酵素とし
てイノシンキナーゼを利用するＩＭＰの製造法もある
（特開昭63-230094）。
用する基質が高価または不安定であったり、反応副生物
が生じるため精製工程が煩雑になる等、工業的に有利な
方法とはいえない。このため、経済性を満たす実用的な
方法として、微生物が糖代謝の過程で無機リン酸を利用
してＡＭＰまたはＡＤＰからＡＴＰを再生させるＡＴＰ
再生系を利用したヌクレオチド生産システムが開発され
ている。例えば、ＸＭＰ生産菌が有しているグルコース
を代謝してＡＴＰを生合成する活性をＡＴＰ再生系とし
て用いる方法がある。このＡＴＰ再生系と、ＸＭＰおよ
びＡＴＰからＧＭＰを生成する能力を持つ微生物のＸＭ
Ｐアミナーゼ活性を共役させることによって、ＡＴＰの
代わりに安価なグルコースと無機リン酸をＡＴＰ再生基
質とするＧＭＰの製法がある〔Biosci. Biotech. Bioch
em., 61, 840 (1997)〕。また、この方法で、酵素とし
てイノシンキナーゼを利用するＩＭＰの製造法もある
（特開昭63-230094）。
【００１１】直接発酵によりＸＭＰ、グアノシンまたは
イノシンを生産させる発酵工程と、それら発酵産物を酵
素的にＧＭＰまたはＩＭＰに転換する反応工程からなる
ＧＭＰまたはＩＭＰの製造プロセスでは、２種の微生物
が用いられる。即ち、前段の発酵工程では、ＸＭＰ、グ
アノシンまたはイノシンの生産菌として育種された変異
株が用いられる。後段のアミノ化またはリン酸化を行う
反応工程では、ＸＭＰアミナーゼ活性またはイノシング
アノシンキナーゼ活性を有する蛋白質をコードする遺伝
子を高発現化させた微生物が用いられる。
イノシンを生産させる発酵工程と、それら発酵産物を酵
素的にＧＭＰまたはＩＭＰに転換する反応工程からなる
ＧＭＰまたはＩＭＰの製造プロセスでは、２種の微生物
が用いられる。即ち、前段の発酵工程では、ＸＭＰ、グ
アノシンまたはイノシンの生産菌として育種された変異
株が用いられる。後段のアミノ化またはリン酸化を行う
反応工程では、ＸＭＰアミナーゼ活性またはイノシング
アノシンキナーゼ活性を有する蛋白質をコードする遺伝
子を高発現化させた微生物が用いられる。
【００１２】後段の反応において必要となるＡＴＰは、
後段の転換菌だけでなく、発酵を終了した前段の生産菌
が有しているＡＴＰ再生活性が利用される。従って、後
段の反応工程はＸＭＰアミナーゼ活性またはイノシング
アノシンキナーゼ活性とＡＴＰ再生活性を２菌体間で共
役させたシステムとなっている。
後段の転換菌だけでなく、発酵を終了した前段の生産菌
が有しているＡＴＰ再生活性が利用される。従って、後
段の反応工程はＸＭＰアミナーゼ活性またはイノシング
アノシンキナーゼ活性とＡＴＰ再生活性を２菌体間で共
役させたシステムとなっている。
【００１３】全体のプロセスの概要は、以下の通りであ
る。まず大型発酵槽で生産菌を糖質と窒素源を主原料と
する培地に培養してＸＭＰ、グアノシンまたはイノシン
を生成蓄積させる。一方、別の小型発酵槽で転換菌を培
養する。前段の発酵が終了した時点で、この大型発酵槽
に別に培養した転換菌を添加して、安価なエネルギー供
与体およびリン酸基供与体存在下でリン酸化またはアミ
ノ化反応を行う。
る。まず大型発酵槽で生産菌を糖質と窒素源を主原料と
する培地に培養してＸＭＰ、グアノシンまたはイノシン
を生成蓄積させる。一方、別の小型発酵槽で転換菌を培
養する。前段の発酵が終了した時点で、この大型発酵槽
に別に培養した転換菌を添加して、安価なエネルギー供
与体およびリン酸基供与体存在下でリン酸化またはアミ
ノ化反応を行う。
【００１４】以上のような酵素反応による製造プロセス
は、化学的にリン酸化を行う方法に比べ前述の理由によ
り有利であるものの、転換菌を培養するための小型発酵
槽が必要である、転換菌を添加する分、前段の発酵工程
での液量を減らす必要があり、したがって目的ヌクレオ
チドのバッチ当たりの得量が低下する等の点で充分に効
率的なプロセスとはいえない。
は、化学的にリン酸化を行う方法に比べ前述の理由によ
り有利であるものの、転換菌を培養するための小型発酵
槽が必要である、転換菌を添加する分、前段の発酵工程
での液量を減らす必要があり、したがって目的ヌクレオ
チドのバッチ当たりの得量が低下する等の点で充分に効
率的なプロセスとはいえない。
【００１５】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、同一発酵槽
内で効率よくプリンヌクレオチドを製造するためのプロ
セスの開発を課題とする。
内で効率よくプリンヌクレオチドを製造するためのプロ
セスの開発を課題とする。
【００１６】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、プリンヌ
クレオチドの前駆物質よりプリンヌクレオチドを合成可
能な酵素の遺伝子を、プリンヌクレオチドの前駆物質を
生産する能力を有する発酵菌に保有させ、その発現を発
酵工程および反応工程の両工程間で制御できれば、一微
生物のみで、プリンヌクレオチドの前駆物質の発酵に引
き続いて、該前駆物質よりプリンヌクレオチドの転換反
応を一つの発酵槽内で行うことが可能な、より優れたプ
リンヌクレオチドの製造プロセスになる可能性があると
考え、鋭意検討を重ねた。その結果、本発明を完成する
に至った。
クレオチドの前駆物質よりプリンヌクレオチドを合成可
能な酵素の遺伝子を、プリンヌクレオチドの前駆物質を
生産する能力を有する発酵菌に保有させ、その発現を発
酵工程および反応工程の両工程間で制御できれば、一微
生物のみで、プリンヌクレオチドの前駆物質の発酵に引
き続いて、該前駆物質よりプリンヌクレオチドの転換反
応を一つの発酵槽内で行うことが可能な、より優れたプ
リンヌクレオチドの製造プロセスになる可能性があると
考え、鋭意検討を重ねた。その結果、本発明を完成する
に至った。
【００１７】即ち、本発明は以下（１）〜（１９）に関
する。 （１） プリンヌクレオチドの前駆物質を生産する能力
を有し、かつ該前駆物質よりプリンヌクレオチドを合成
可能な酵素を誘導発現することのできるＤＮＡを導入し
た微生物を培地に培養し、該培養物中にプリンヌクレオ
チドの前駆物質を生成蓄積させた後、該前駆物質よりプ
リンヌクレオチドを合成することのできる酵素を誘導発
現させ、該培養物中に該前駆物質よりプリンヌクレオチ
ドを生成蓄積させ、該培養物中より該プリンヌクレオチ
ドを採取することを特徴とする、プリンヌクレオチドの
製造法。
する。 （１） プリンヌクレオチドの前駆物質を生産する能力
を有し、かつ該前駆物質よりプリンヌクレオチドを合成
可能な酵素を誘導発現することのできるＤＮＡを導入し
た微生物を培地に培養し、該培養物中にプリンヌクレオ
チドの前駆物質を生成蓄積させた後、該前駆物質よりプ
リンヌクレオチドを合成することのできる酵素を誘導発
現させ、該培養物中に該前駆物質よりプリンヌクレオチ
ドを生成蓄積させ、該培養物中より該プリンヌクレオチ
ドを採取することを特徴とする、プリンヌクレオチドの
製造法。
【００１８】（２） プリンヌクレオチドの前駆物質が
５'−キサンチル酸、該前駆物質よりプリンヌクレオチ
ドを合成することのできる酵素が５'−キサンチル酸ア
ミナーゼ、プリンヌクレオチドが５'−グアニル酸であ
る、上記（１）記載の製造法。 （３） プリンヌクレオチドの前駆物質がグアノシン、
該前駆物質よりプリンヌクレオチドを合成することので
きる酵素がイノシングアノシンキナーゼまたはホスファ
ターゼ、プリンヌクレオチドが５'−グアニル酸であ
る、上記（１）記載の製造法。
５'−キサンチル酸、該前駆物質よりプリンヌクレオチ
ドを合成することのできる酵素が５'−キサンチル酸ア
ミナーゼ、プリンヌクレオチドが５'−グアニル酸であ
る、上記（１）記載の製造法。 （３） プリンヌクレオチドの前駆物質がグアノシン、
該前駆物質よりプリンヌクレオチドを合成することので
きる酵素がイノシングアノシンキナーゼまたはホスファ
ターゼ、プリンヌクレオチドが５'−グアニル酸であ
る、上記（１）記載の製造法。
【００１９】（４） プリンヌクレオチドの前駆物質が
イノシン、該前駆物質よりプリンヌクレオチドを合成す
ることのできる酵素がイノシングアノシンキナーゼまた
はホスファターゼ、プリンヌクレオチドが５'−イノシ
ン酸である、上記（１）記載の製造法。 （５） 微生物が、コリネバクテリウム属、エシェリヒ
ア属、バチルス属からなる属より選ばれる微生物であ
る、上記（１）記載の製造法。
イノシン、該前駆物質よりプリンヌクレオチドを合成す
ることのできる酵素がイノシングアノシンキナーゼまた
はホスファターゼ、プリンヌクレオチドが５'−イノシ
ン酸である、上記（１）記載の製造法。 （５） 微生物が、コリネバクテリウム属、エシェリヒ
ア属、バチルス属からなる属より選ばれる微生物であ
る、上記（１）記載の製造法。
【００２０】（６） 微生物が、コリネバクテリウム・
アンモニアゲネスである、上記（１）記載の製造法。 （７） プリンヌクレオチドを合成可能な酵素が、高
温、高ｐＨおよび高浸透圧から選ばれる条件に、または
糖質系の炭素源から非糖質系の炭素源に切り替えること
により誘導発現されることを特徴とする、上記（１）記
載の製造法。
アンモニアゲネスである、上記（１）記載の製造法。 （７） プリンヌクレオチドを合成可能な酵素が、高
温、高ｐＨおよび高浸透圧から選ばれる条件に、または
糖質系の炭素源から非糖質系の炭素源に切り替えること
により誘導発現されることを特徴とする、上記（１）記
載の製造法。
【００２１】（８） 非糖質系の炭素源が、酢酸または
酢酸塩である、上記（７）記載の製造法。 （９） プリンヌクレオチド前駆物質よりプリンヌクレ
オチドを合成可能な酵素を誘導発現することのできるＤ
ＮＡ。
酢酸塩である、上記（７）記載の製造法。 （９） プリンヌクレオチド前駆物質よりプリンヌクレ
オチドを合成可能な酵素を誘導発現することのできるＤ
ＮＡ。
【００２２】（１０） 高温、高ｐＨおよび高浸透圧か
ら選ばれる条件に、または糖質系の炭素源から非糖質系
の炭素源に切り替えることにより、プリンヌクレオチド
を合成可能な酵素を誘導発現することのできる、上記
（９）記載のＤＮＡ。 （１１） 非糖質系の炭素源が、酢酸または酢酸塩であ
る、上記（１０）記載のＤＮＡ。
ら選ばれる条件に、または糖質系の炭素源から非糖質系
の炭素源に切り替えることにより、プリンヌクレオチド
を合成可能な酵素を誘導発現することのできる、上記
（９）記載のＤＮＡ。 （１１） 非糖質系の炭素源が、酢酸または酢酸塩であ
る、上記（１０）記載のＤＮＡ。
【００２３】（１２） ＤＮＡが、ｐＬＡＣ８５７また
はｐＩＧＫ２である、上記（９）または（１０）記載の
ＤＮＡ。 （１３） プリンヌクレオチドの前駆物質を生産する能
力を有し、かつ該前駆物質よりプリンヌクレオチドを合
成可能な酵素を誘導発現することのできるＤＮＡを導入
した微生物。
はｐＩＧＫ２である、上記（９）または（１０）記載の
ＤＮＡ。 （１３） プリンヌクレオチドの前駆物質を生産する能
力を有し、かつ該前駆物質よりプリンヌクレオチドを合
成可能な酵素を誘導発現することのできるＤＮＡを導入
した微生物。
【００２４】（１４） プリンヌクレオチドの前駆物質
が５'−キサンチル酸、該前駆物質よりプリンヌクレオ
チドを合成することのできる酵素が５'−キサンチル酸
アミナーゼ、プリンヌクレオチドが５'−グアニル酸で
ある、上記（１３）記載の微生物。 （１５） プリンヌクレオチドの前駆物質がグアノシ
ン、該前駆物質よりプリンヌクレオチドを合成すること
のできる酵素がイノシングアノシンキナーゼまたはホス
ファターゼ、プリンヌクレオチドが５'−グアニル酸で
ある、上記（１３）記載の微生物。
が５'−キサンチル酸、該前駆物質よりプリンヌクレオ
チドを合成することのできる酵素が５'−キサンチル酸
アミナーゼ、プリンヌクレオチドが５'−グアニル酸で
ある、上記（１３）記載の微生物。 （１５） プリンヌクレオチドの前駆物質がグアノシ
ン、該前駆物質よりプリンヌクレオチドを合成すること
のできる酵素がイノシングアノシンキナーゼまたはホス
ファターゼ、プリンヌクレオチドが５'−グアニル酸で
ある、上記（１３）記載の微生物。
【００２５】（１６） プリンヌクレオチドの前駆物質
がイノシン、該前駆物質よりプリンヌクレオチドを合成
することのできる酵素がイノシングアノシンキナーゼま
たはホスファターゼ、プリンヌクレオチドが５'−イノ
シン酸である、上記（１３）記載の微生物。 （１７） 微生物が、コリネバクテリウム属、エシェリ
ヒア属、バチルス属からなる属より選ばれる微生物であ
る、上記（１３）記載の微生物。
がイノシン、該前駆物質よりプリンヌクレオチドを合成
することのできる酵素がイノシングアノシンキナーゼま
たはホスファターゼ、プリンヌクレオチドが５'−イノ
シン酸である、上記（１３）記載の微生物。 （１７） 微生物が、コリネバクテリウム属、エシェリ
ヒア属、バチルス属からなる属より選ばれる微生物であ
る、上記（１３）記載の微生物。
【００２６】（１８） 微生物が、コリネバクテリウム
・アンモニアゲネスである、上記（１３）記載の微生
物。 （１９）微生物が、コリネバクテリウム・アンモニアゲ
ネスＡＴＣＣ６８７２／ｐＬＡＣ８５７（ＦＥＲＭ Ｂ
Ｐ−６６３９）またはコリネバクテリウム・アンモニア
ゲネスＡＴＣＣ６８７２／ｐＩＧＫ２（ＦＥＲＭ ＢＰ
−６６３８）である、上記（１８）記載の微生物。 以下に本発明を詳細に説明する。
・アンモニアゲネスである、上記（１３）記載の微生
物。 （１９）微生物が、コリネバクテリウム・アンモニアゲ
ネスＡＴＣＣ６８７２／ｐＬＡＣ８５７（ＦＥＲＭ Ｂ
Ｐ−６６３９）またはコリネバクテリウム・アンモニア
ゲネスＡＴＣＣ６８７２／ｐＩＧＫ２（ＦＥＲＭ ＢＰ
−６６３８）である、上記（１８）記載の微生物。 以下に本発明を詳細に説明する。
【００２７】
【発明の実施の形態】本発明は、直接発酵によりプリン
ヌクレオチドの前駆物質を生産させる発酵工程と、該発
酵工程で生産された前駆物質を酵素的にプリンヌクレオ
チドに転換する反応工程を単一の微生物を用いて一つの
発酵槽内で連続的に行うプロセスである。
ヌクレオチドの前駆物質を生産させる発酵工程と、該発
酵工程で生産された前駆物質を酵素的にプリンヌクレオ
チドに転換する反応工程を単一の微生物を用いて一つの
発酵槽内で連続的に行うプロセスである。
【００２８】該プロセスを成立させるために、本発明者
らが見出した重要な要件は以下の３点である。即ち、第
１に、直接発酵によりプリンヌクレオチドの前駆物質を
生産させる発酵工程では、プリンヌクレオチドの前駆物
質よりプリンヌクレオチドを合成可能な酵素をコードす
る遺伝子の発現が発酵に実質的に影響を及ぼさないレベ
ルに抑えられていること。
らが見出した重要な要件は以下の３点である。即ち、第
１に、直接発酵によりプリンヌクレオチドの前駆物質を
生産させる発酵工程では、プリンヌクレオチドの前駆物
質よりプリンヌクレオチドを合成可能な酵素をコードす
る遺伝子の発現が発酵に実質的に影響を及ぼさないレベ
ルに抑えられていること。
【００２９】該酵素の発現が抑えられない場合には、該
酵素の活性により、発酵中に細胞内にプリンヌクレオチ
ドが生成蓄積し、下記理由により発酵収率が低下する。
プリンヌクレオチドとして、ＧＭＰが蓄積した場合に
は、プリン生合成経路上の鍵酵素のフィードバック制御
が誘発され、ＸＭＰの生産が止まってしまう。ＩＭＰが
蓄積した場合には、イノシン生成との間で無益サイクル
(Futile cycle)が形成され、ＡＴＰの浪費が起こる。こ
のように、細胞内でのプリンヌクレオチドの生成蓄積は
発酵収率の低下を招くことになり、経済的に不利とな
る。
酵素の活性により、発酵中に細胞内にプリンヌクレオチ
ドが生成蓄積し、下記理由により発酵収率が低下する。
プリンヌクレオチドとして、ＧＭＰが蓄積した場合に
は、プリン生合成経路上の鍵酵素のフィードバック制御
が誘発され、ＸＭＰの生産が止まってしまう。ＩＭＰが
蓄積した場合には、イノシン生成との間で無益サイクル
(Futile cycle)が形成され、ＡＴＰの浪費が起こる。こ
のように、細胞内でのプリンヌクレオチドの生成蓄積は
発酵収率の低下を招くことになり、経済的に不利とな
る。
【００３０】第２に、プリンヌクレオチドの前駆物質よ
りプリンヌクレオチドを合成する反応工程においては、
プリンヌクレオチドの前駆物質よりプリンヌクレオチド
を合成可能な酵素活性が充分に誘導されること。第３
に、発酵を終えかつ誘導処理を施した生産菌に充分なＡ
ＴＰ再生活性と転換反応にあずかるリン酸化またはアミ
ノ化活性が保持され、プリンヌクレオチドの前駆物質よ
りプリンヌクレオチドを合成する反応工程においてそれ
が十分に機能すること。
りプリンヌクレオチドを合成する反応工程においては、
プリンヌクレオチドの前駆物質よりプリンヌクレオチド
を合成可能な酵素活性が充分に誘導されること。第３
に、発酵を終えかつ誘導処理を施した生産菌に充分なＡ
ＴＰ再生活性と転換反応にあずかるリン酸化またはアミ
ノ化活性が保持され、プリンヌクレオチドの前駆物質よ
りプリンヌクレオチドを合成する反応工程においてそれ
が十分に機能すること。
【００３１】以上の３点である。本発明に用いられる微
生物は、プリンヌクレオチドの前駆物質を生産する能力
を有し、かつ、ＡＴＰ再生活性を持つ微生物であれば、
野生株、変異株、細胞融合株、形質導入株あるいは組換
えＤＮＡ技術を用いて造成した組換え株のいずれであっ
ても特に限定されない。該微生物として、好適には、核
酸発酵やアミノ酸発酵に用いられているコリネバクテリ
ウム属、エシェリヒア属、バチルス属に属する微生物を
あげることができる。強力なＡＴＰ再生活性を有するコ
リネバクテリウム・アンモニアゲネスは、更に好適な微
生物としてあげることができる。
生物は、プリンヌクレオチドの前駆物質を生産する能力
を有し、かつ、ＡＴＰ再生活性を持つ微生物であれば、
野生株、変異株、細胞融合株、形質導入株あるいは組換
えＤＮＡ技術を用いて造成した組換え株のいずれであっ
ても特に限定されない。該微生物として、好適には、核
酸発酵やアミノ酸発酵に用いられているコリネバクテリ
ウム属、エシェリヒア属、バチルス属に属する微生物を
あげることができる。強力なＡＴＰ再生活性を有するコ
リネバクテリウム・アンモニアゲネスは、更に好適な微
生物としてあげることができる。
【００３２】プリンヌクレオチドの前駆物質としては、
ＸＭＰ、グアノシン、イノシン、アデノシン等をあげる
ことができる。ＡＴＰ再生活性とは、微生物が糖質をエ
ネルギー供与基質として代謝する過程で無機リン酸を利
用してＡＭＰもしくはＡＤＰからＡＴＰを再生させる活
性のことをいう。このＡＴＰ再生系は、解糖系、ＴＣＡ
サイクル、電子伝達系等の糖代謝系およびエネルギー代
謝系の一部であり、ほとんどあらゆる微生物がその活性
を有している。
ＸＭＰ、グアノシン、イノシン、アデノシン等をあげる
ことができる。ＡＴＰ再生活性とは、微生物が糖質をエ
ネルギー供与基質として代謝する過程で無機リン酸を利
用してＡＭＰもしくはＡＤＰからＡＴＰを再生させる活
性のことをいう。このＡＴＰ再生系は、解糖系、ＴＣＡ
サイクル、電子伝達系等の糖代謝系およびエネルギー代
謝系の一部であり、ほとんどあらゆる微生物がその活性
を有している。
【００３３】本発明に用いられる微生物の具体例として
は、例えば以下の菌株およびこれらから誘導された変異
株をあげることができる。
は、例えば以下の菌株およびこれらから誘導された変異
株をあげることができる。
【００３４】 コリネバクテリウム・アンモニアゲネスATCC 6872 コリネバクテリウム・アンモニアゲネスATCC 21295 コリネバクテリウム・アンモニアゲネスATCC 21477 コリネバクテリウム・グルタミクムATCC 13032 コリネバクテリウム・グルタミクムATCC 14067 コリネバクテリウム・グルタミクムATCC 13869 エシェリヒア・コリATCC 14948 エシェリヒア・コリATCC 11303 エシェリヒア・コリATCC 9637 バチルス・サチルスATCC 14618
【００３５】本発明に用いられるプリンヌクレオチドの
前駆物質よりプリンヌクレオチドを合成可能な酵素とし
ては、プリンヌクレオチドの前駆物質よりプリンヌクレ
オチドを合成することのできる酵素であればいずれも用
いることができ、ＸＭＰアミナーゼ、イノシングアノシ
ンキナーゼ、ホスファターゼ、アデニレートキナーゼ等
をあげることができる。
前駆物質よりプリンヌクレオチドを合成可能な酵素とし
ては、プリンヌクレオチドの前駆物質よりプリンヌクレ
オチドを合成することのできる酵素であればいずれも用
いることができ、ＸＭＰアミナーゼ、イノシングアノシ
ンキナーゼ、ホスファターゼ、アデニレートキナーゼ等
をあげることができる。
【００３６】これら酵素をコードするＤＮＡとして、例
えば、以下のものをあげることができる。ＸＭＰアミナ
ーゼをコードする遺伝子として、エシェリヒア・コリに
由来するもの〔Nucleic Acids Res., 13, 1303 (198
5)〕、バチルス・サチリスに由来するもの〔Nucleic Ac
ids Res., 18, 6710 (1990)〕、コリネバクテリウム・
アンモニアゲネス（Genbank accesion no. g2765074）
に由来するもの等をあげることができる。
えば、以下のものをあげることができる。ＸＭＰアミナ
ーゼをコードする遺伝子として、エシェリヒア・コリに
由来するもの〔Nucleic Acids Res., 13, 1303 (198
5)〕、バチルス・サチリスに由来するもの〔Nucleic Ac
ids Res., 18, 6710 (1990)〕、コリネバクテリウム・
アンモニアゲネス（Genbank accesion no. g2765074）
に由来するもの等をあげることができる。
【００３７】イノシングアノシンキナーゼをコードする
遺伝子として、エシェリヒア・コリに由来するもの（WO
91/08286号）、エキシグオバクテリウム・アセチリカム
に由来するもの（WO96/30501号）等をあげることができ
る。ホスファターゼをコードする遺伝子としてモルガネ
ラ・モルガニに由来するもの(特開平9-37785、特開平10
-201481)等をあげることができる。アデニレートキナー
ゼをコードする遺伝子としてサッカロミセス・セレビシ
エに由来するもの〔J. Biol. Chem., 263, 19468 (198
8)〕をあげることができる。
遺伝子として、エシェリヒア・コリに由来するもの（WO
91/08286号）、エキシグオバクテリウム・アセチリカム
に由来するもの（WO96/30501号）等をあげることができ
る。ホスファターゼをコードする遺伝子としてモルガネ
ラ・モルガニに由来するもの(特開平9-37785、特開平10
-201481)等をあげることができる。アデニレートキナー
ゼをコードする遺伝子としてサッカロミセス・セレビシ
エに由来するもの〔J. Biol. Chem., 263, 19468 (198
8)〕をあげることができる。
【００３８】プリンヌクレオチドの前駆物質よりプリン
ヌクレオチドを合成可能な酵素をコードする遺伝子は、
公知の方法により取得することができる。例えば、ＸＭ
Ｐアミナーゼをコードする遺伝子の場合には、ＸＭＰア
ミナーゼ構造遺伝子の配列の両末端に位置する配列をも
とにプライマーを合成する。ついで本プライマーとエシ
ェリヒア・コリ染色体ＤＮＡ、バチルス・サチリス染色
体ＤＮＡまたはコリネバクテリウム・アンモニアゲネス
染色体ＤＮＡからポリメラーゼ・チェイン・リアクショ
ン法（ＰＣＲ法）によりＸＭＰアミナーゼ構造遺伝子を
取得できる。
ヌクレオチドを合成可能な酵素をコードする遺伝子は、
公知の方法により取得することができる。例えば、ＸＭ
Ｐアミナーゼをコードする遺伝子の場合には、ＸＭＰア
ミナーゼ構造遺伝子の配列の両末端に位置する配列をも
とにプライマーを合成する。ついで本プライマーとエシ
ェリヒア・コリ染色体ＤＮＡ、バチルス・サチリス染色
体ＤＮＡまたはコリネバクテリウム・アンモニアゲネス
染色体ＤＮＡからポリメラーゼ・チェイン・リアクショ
ン法（ＰＣＲ法）によりＸＭＰアミナーゼ構造遺伝子を
取得できる。
【００３９】イノシングアノシンキナーゼをコードする
遺伝子の場合には、イノシングアノシンキナーゼ構造遺
伝子の配列の両末端に位置する配列をもとに合成したプ
ライマーとエシェリヒア・コリ染色体ＤＮＡまたはエキ
シグオバクテリウム・アセチリカム染色体ＤＮＡからＰ
ＣＲ法によりイノシングアノシンキナーゼ構造遺伝子を
取得できる。同様に、ＰＣＲ法を用いることでモルガネ
ラ・モルガニ染色体ＤＮＡからホスファターゼ構造遺伝
子を、またサッカロミセス・セレビシエ染色体ＤＮＡか
らアデニレートキナーゼ構造遺伝子を取得できる。
遺伝子の場合には、イノシングアノシンキナーゼ構造遺
伝子の配列の両末端に位置する配列をもとに合成したプ
ライマーとエシェリヒア・コリ染色体ＤＮＡまたはエキ
シグオバクテリウム・アセチリカム染色体ＤＮＡからＰ
ＣＲ法によりイノシングアノシンキナーゼ構造遺伝子を
取得できる。同様に、ＰＣＲ法を用いることでモルガネ
ラ・モルガニ染色体ＤＮＡからホスファターゼ構造遺伝
子を、またサッカロミセス・セレビシエ染色体ＤＮＡか
らアデニレートキナーゼ構造遺伝子を取得できる。
【００４０】このようにして取得されたプリンヌクレオ
チドの前駆物質よりプリンヌクレオチドを合成可能な酵
素をコードする遺伝子を適当な誘導発現ベクターの誘導
発現制御が可能な転写・翻訳シグナルの支配下に配する
ことにより、該遺伝子の発現を制御できる組換え体プラ
スミドを得ることができる。
チドの前駆物質よりプリンヌクレオチドを合成可能な酵
素をコードする遺伝子を適当な誘導発現ベクターの誘導
発現制御が可能な転写・翻訳シグナルの支配下に配する
ことにより、該遺伝子の発現を制御できる組換え体プラ
スミドを得ることができる。
【００４１】誘導発現ベクターとしては、用いる微生物
内で複製可能であると同時に、以下の３条件を満たせば
特に限定されるものではない。第１に、直接発酵により
プリンヌクレオチドの前駆物質を生産させる発酵工程で
は、プリンヌクレオチドの前駆物質よりプリンヌクレオ
チドを合成可能な酵素をコードする遺伝子の発現を発酵
に実質的に影響を及ぼさないレベルに抑えられること。
内で複製可能であると同時に、以下の３条件を満たせば
特に限定されるものではない。第１に、直接発酵により
プリンヌクレオチドの前駆物質を生産させる発酵工程で
は、プリンヌクレオチドの前駆物質よりプリンヌクレオ
チドを合成可能な酵素をコードする遺伝子の発現を発酵
に実質的に影響を及ぼさないレベルに抑えられること。
【００４２】第２に、プリンヌクレオチドの前駆物質よ
りプリンヌクレオチドを合成する反応工程に移行する前
に行う誘導処理によって、プリンヌクレオチドの前駆物
質よりプリンヌクレオチドを合成可能な酵素の活性を充
分に誘導できること。第３に、該誘導方法が、誘導処理
後も生産菌に充分なＡＴＰ再生活性と転換活性が保持さ
れるような方法であること。
りプリンヌクレオチドを合成する反応工程に移行する前
に行う誘導処理によって、プリンヌクレオチドの前駆物
質よりプリンヌクレオチドを合成可能な酵素の活性を充
分に誘導できること。第３に、該誘導方法が、誘導処理
後も生産菌に充分なＡＴＰ再生活性と転換活性が保持さ
れるような方法であること。
【００４３】上記３条件を満たすベクターとして、例え
ば、PLプロモーター/cI857リプレッサー遺伝子を保有
し、高温で誘導されるｐＰＡＣ３１（WO98/12343号）、
lacプロモーター/lacItsリプレッサー遺伝子を保有し、
高温で誘導されるｐＢＢ１〔Gene, 70, 415 (1988)〕、
PLプロモーター/cI857リプレッサー遺伝子を保有し、高
ｐＨで誘導されるｐＲＫ２４８ｃＩｔｓ〔Gene, 97, 12
5 (1991)〕、ｐｒｏＵ発現制御領域を保有し、高浸透圧
下で誘導されるｐＯＳＥＸ２〔Gene, 151, 137(199
4)〕、trcプロモーター/lacIqリプレッサー遺伝子を保
有し、イソプロピル-β-D-チオガラクトシド（ＩＰＴ
Ｇ）で誘導されるｐＴｒｃ９９Ａ〔Gene, 69,301 (198
8)〕、araBADプロモーター/araCリプレッサー遺伝子を
保有し、L-アラビノースで誘導されるｐＡＬ９１８１
〔Appl. Microbiol. Biotechnol., 37, 205 (1992)〕、
糖質系の炭素源から非糖質系の炭素源に切り替えること
で誘導さるベクター等のエシェリヒア・コリで構築され
ている誘導発現ベクターをあげることができる。
ば、PLプロモーター/cI857リプレッサー遺伝子を保有
し、高温で誘導されるｐＰＡＣ３１（WO98/12343号）、
lacプロモーター/lacItsリプレッサー遺伝子を保有し、
高温で誘導されるｐＢＢ１〔Gene, 70, 415 (1988)〕、
PLプロモーター/cI857リプレッサー遺伝子を保有し、高
ｐＨで誘導されるｐＲＫ２４８ｃＩｔｓ〔Gene, 97, 12
5 (1991)〕、ｐｒｏＵ発現制御領域を保有し、高浸透圧
下で誘導されるｐＯＳＥＸ２〔Gene, 151, 137(199
4)〕、trcプロモーター/lacIqリプレッサー遺伝子を保
有し、イソプロピル-β-D-チオガラクトシド（ＩＰＴ
Ｇ）で誘導されるｐＴｒｃ９９Ａ〔Gene, 69,301 (198
8)〕、araBADプロモーター/araCリプレッサー遺伝子を
保有し、L-アラビノースで誘導されるｐＡＬ９１８１
〔Appl. Microbiol. Biotechnol., 37, 205 (1992)〕、
糖質系の炭素源から非糖質系の炭素源に切り替えること
で誘導さるベクター等のエシェリヒア・コリで構築され
ている誘導発現ベクターをあげることができる。
【００４４】更に、これら誘導発現ベクター上の、発現
制御に関わる転写・翻訳シグナル領域が、変異技術また
は組換えＤＮＡ技術で改変されたベクターも、同様に用
いることができる。これら既知の誘導発現ベクターある
いは、それらから更に改良されたベクターを、大腸菌以
外の宿主で利用する場合には、該宿主で機能する複製起
点を挿入すればよい。例えばコリネバクテリウム・アン
モニアゲネスで利用する場合には、該ベクターにコリネ
バクテリウム・アンモニアゲネスで機能するコリネバク
テリウム・グルタミカム由来のプラスミドが有する複製
起点等を挿入すればよい。
制御に関わる転写・翻訳シグナル領域が、変異技術また
は組換えＤＮＡ技術で改変されたベクターも、同様に用
いることができる。これら既知の誘導発現ベクターある
いは、それらから更に改良されたベクターを、大腸菌以
外の宿主で利用する場合には、該宿主で機能する複製起
点を挿入すればよい。例えばコリネバクテリウム・アン
モニアゲネスで利用する場合には、該ベクターにコリネ
バクテリウム・アンモニアゲネスで機能するコリネバク
テリウム・グルタミカム由来のプラスミドが有する複製
起点等を挿入すればよい。
【００４５】コリネバクテリウム・グルタミカム由来の
プラスミドとしては、例えばｐＣＧ１（特開昭57-13450
0号）、ｐＣＧ２（特開昭58-35197号）、ｐＣＧ４（特
開昭57-183799号）、ＰＡＭ３３０（特開昭58-67699
号）、ｐＡＧ１、ｐＡＧ３、ｐＡＧ１４、ｐＡＧ５０
（特開昭62-166890号）があげられる。
プラスミドとしては、例えばｐＣＧ１（特開昭57-13450
0号）、ｐＣＧ２（特開昭58-35197号）、ｐＣＧ４（特
開昭57-183799号）、ＰＡＭ３３０（特開昭58-67699
号）、ｐＡＧ１、ｐＡＧ３、ｐＡＧ１４、ｐＡＧ５０
（特開昭62-166890号）があげられる。
【００４６】コリネバクテリウムにおいて、温度を上昇
させることにより誘導可能なベクターとしては、例えば
大腸菌において高温で誘導されるベクターであるｐＰＡ
Ｃ３１に含有されるPLプロモーター/cI857リプレッサー
遺伝子と、コリネバクテリウム内で自律複製可能なベク
ターとを連結して作製されるプラスミドベクター等をあ
げることができ、酢酸等の非糖質炭素源で誘導可能なベ
クターｐＣＥＸ２（特開平3-224259号）等を好適なベク
ターとしてあげることができる。一方、これらの誘導発
現ベクター上の遺伝子発現制御に関わる転写・翻訳シグ
ナルが、用いる微生物内で機能しないか、機能しても上
記３つの要件を十分に満たさない場合には、該転写・翻
訳シグナル領域を、変異技術または組換えＤＮＡ技術を
用いて、上記３つの要件を十分満たすように改良する
か、該微生物に適用可能な誘導発現システムを新たに開
発する必要がある。前者の場合には、用いる微生物で既
に知られている転写・翻訳シグナル配列を参考にして、
例えば、サイト・ダイレクテド・ミュータジェネシス(S
ite-directed mutagenesis)などの方法により実施する
ことができる。後者の場合には、エシェリヒア・コリ等
で構築された上述のような一般的な誘導発現システムの
開発方法に準じ開発構築することができる。
させることにより誘導可能なベクターとしては、例えば
大腸菌において高温で誘導されるベクターであるｐＰＡ
Ｃ３１に含有されるPLプロモーター/cI857リプレッサー
遺伝子と、コリネバクテリウム内で自律複製可能なベク
ターとを連結して作製されるプラスミドベクター等をあ
げることができ、酢酸等の非糖質炭素源で誘導可能なベ
クターｐＣＥＸ２（特開平3-224259号）等を好適なベク
ターとしてあげることができる。一方、これらの誘導発
現ベクター上の遺伝子発現制御に関わる転写・翻訳シグ
ナルが、用いる微生物内で機能しないか、機能しても上
記３つの要件を十分に満たさない場合には、該転写・翻
訳シグナル領域を、変異技術または組換えＤＮＡ技術を
用いて、上記３つの要件を十分満たすように改良する
か、該微生物に適用可能な誘導発現システムを新たに開
発する必要がある。前者の場合には、用いる微生物で既
に知られている転写・翻訳シグナル配列を参考にして、
例えば、サイト・ダイレクテド・ミュータジェネシス(S
ite-directed mutagenesis)などの方法により実施する
ことができる。後者の場合には、エシェリヒア・コリ等
で構築された上述のような一般的な誘導発現システムの
開発方法に準じ開発構築することができる。
【００４７】誘導発現系を備えた微生物として、好適に
は、大腸菌において高温で誘導されるベクターであるｐ
ＰＡＣ３１に含有されるPLプロモーター/cI857リプレッ
サー遺伝子と、コリネバクテリウム内で自律複製可能な
ベクターとを連結して作製される温度誘導型プラスミド
ベクター、または安価な酢酸の添加で発現を制御できる
ｐＣＥＸ２を遺伝子誘導発現システムとして用いて造成
したコリネバクテリウム・アンモニアゲネス等をあげる
ことができる。
は、大腸菌において高温で誘導されるベクターであるｐ
ＰＡＣ３１に含有されるPLプロモーター/cI857リプレッ
サー遺伝子と、コリネバクテリウム内で自律複製可能な
ベクターとを連結して作製される温度誘導型プラスミド
ベクター、または安価な酢酸の添加で発現を制御できる
ｐＣＥＸ２を遺伝子誘導発現システムとして用いて造成
したコリネバクテリウム・アンモニアゲネス等をあげる
ことができる。
【００４８】本発明では、上記３条件を満たせば、プリ
ンヌクレオチドの前駆物質よりプリンヌクレオチドを合
成可能な酵素をコードする遺伝子がベクタープラスミド
上に存在しても、染色体に組み込まれていても問題では
ない。即ち、該遺伝子の発現が所望なように制御可能で
あれば、プラスミドの保有株、遺伝子の染色体組込み株
のいずれであっても特に限定されない。
ンヌクレオチドの前駆物質よりプリンヌクレオチドを合
成可能な酵素をコードする遺伝子がベクタープラスミド
上に存在しても、染色体に組み込まれていても問題では
ない。即ち、該遺伝子の発現が所望なように制御可能で
あれば、プラスミドの保有株、遺伝子の染色体組込み株
のいずれであっても特に限定されない。
【００４９】プリンヌクレオチドの前駆物質よりプリン
ヌクレオチドを合成可能な酵素をコードする遺伝子を含
有する誘導発現プラスミドをプリンヌクレオチドの前駆
物質を生産する微生物に導入する方法として、プロトプ
ラスト法、電気パルス法、塩化カルシウム法、Molecula
r Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition,Col
d Spring Harbor Laboratory Press (1989)（以下、モ
レキュラー・クローニング第２版と略す）等に記載の、
通常使用される方法をあげることができる。
ヌクレオチドを合成可能な酵素をコードする遺伝子を含
有する誘導発現プラスミドをプリンヌクレオチドの前駆
物質を生産する微生物に導入する方法として、プロトプ
ラスト法、電気パルス法、塩化カルシウム法、Molecula
r Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition,Col
d Spring Harbor Laboratory Press (1989)（以下、モ
レキュラー・クローニング第２版と略す）等に記載の、
通常使用される方法をあげることができる。
【００５０】例えば、宿主菌としてコリネバクテリウム
属細菌を用いる場合には、プロトプラスト法（特開昭57
-183799号）、電気パルス法（特開平2-207791号）が特
に有効である。宿主菌としてエシェリヒア・コリを用い
る場合には、塩化カルシウム法〔J.Mol.Biol., 53, 159
(1970)〕等も用いることができる。
属細菌を用いる場合には、プロトプラスト法（特開昭57
-183799号）、電気パルス法（特開平2-207791号）が特
に有効である。宿主菌としてエシェリヒア・コリを用い
る場合には、塩化カルシウム法〔J.Mol.Biol., 53, 159
(1970)〕等も用いることができる。
【００５１】このようにして得られたプリンヌクレオチ
ドの前駆物質よりプリンヌクレオチドを合成可能な酵素
をコードする遺伝子を導入した本発明の形質転換体を、
炭素源、窒素源、無機物、更に必要に応じて有機微量栄
養素を含有する通常の培地で培養し、プリンヌクレオチ
ドの前駆物質を生成蓄積後、熱処理または酢酸添加等の
誘導処理を施すことにより、プリンヌクレオチドの前駆
物質よりプリンヌクレオチドを合成可能な酵素を誘導発
現できる。
ドの前駆物質よりプリンヌクレオチドを合成可能な酵素
をコードする遺伝子を導入した本発明の形質転換体を、
炭素源、窒素源、無機物、更に必要に応じて有機微量栄
養素を含有する通常の培地で培養し、プリンヌクレオチ
ドの前駆物質を生成蓄積後、熱処理または酢酸添加等の
誘導処理を施すことにより、プリンヌクレオチドの前駆
物質よりプリンヌクレオチドを合成可能な酵素を誘導発
現できる。
【００５２】上記発酵工程で用いられる培地の炭素源と
しては、グルコース、フラクトース、シュークロース、
糖蜜、廃糖蜜、澱粉加水分解物等の炭水化物、エタノー
ル、グリセリン、ソルビトール等のアルコール類、ピル
ビン酸、乳酸等の有機酸、グリシン、アラニン、グルタ
ミン酸、アスパラギン酸等のアミノ酸等、該微生物が資
化可能であるものであればいずれも使用できる。これら
の使用濃度は、５〜３０％が好ましい。
しては、グルコース、フラクトース、シュークロース、
糖蜜、廃糖蜜、澱粉加水分解物等の炭水化物、エタノー
ル、グリセリン、ソルビトール等のアルコール類、ピル
ビン酸、乳酸等の有機酸、グリシン、アラニン、グルタ
ミン酸、アスパラギン酸等のアミノ酸等、該微生物が資
化可能であるものであればいずれも使用できる。これら
の使用濃度は、５〜３０％が好ましい。
【００５３】窒素源としては、アンモニア、塩化アンモ
ニウム、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、炭酸ア
ンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等
の各種無機および有機アンモニウム塩、尿素、各種アミ
ノ酸、ペプトン、NZアミン、肉エキス、酵母エキス、コ
ーンスティープリカー、カゼイン加水分解物、フィッシ
ュミール又はその消化物等の種々のものが使用できる。
ニウム、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、炭酸ア
ンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等
の各種無機および有機アンモニウム塩、尿素、各種アミ
ノ酸、ペプトン、NZアミン、肉エキス、酵母エキス、コ
ーンスティープリカー、カゼイン加水分解物、フィッシ
ュミール又はその消化物等の種々のものが使用できる。
【００５４】無機物としては、リン酸一カリウム、リン
酸二カリウム、硫酸マグネシウム、リン酸マグネシウ
ム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸
亜鉛、炭酸カルシウム等を用いることができる。用いる
微生物がアミノ酸、核酸、ビタミン等特定の栄養物質を
生育に要求する場合には、培地にこれら物質を適量添加
する。
酸二カリウム、硫酸マグネシウム、リン酸マグネシウ
ム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸
亜鉛、炭酸カルシウム等を用いることができる。用いる
微生物がアミノ酸、核酸、ビタミン等特定の栄養物質を
生育に要求する場合には、培地にこれら物質を適量添加
する。
【００５５】培養は、振盪培養または通気攪拌培養等の
好気条件下に行う。培養温度は一般に２６℃〜３７℃が
最適である。培養期間は、通常１日〜５日間である。プ
リンヌクレオチドの前駆物質よりプリンヌクレオチドを
合成可能な酵素をコードする遺伝子を発現させるための
誘導処理条件としては、例えば、ｐＰＡＣ３１またはｐ
ＢＢ１を利用する場合には、通気攪拌条件下、３７℃〜
４２℃で１〜２４時間、ｐＲＫ２４８ｃＩｔｓを利用す
る場合には、ｐＨ９で１〜２４時間、ｐＯＳＥＸ２を利
用する場合には、５０ｍｍｏｌ／Ｌ〜３００ｍｍｏｌ／
Ｌ ＮａＣｌ存在下で１〜２４時間、ｐＴｒｃ９９Ａを
利用する場合には０．１ｍｍｏｌ／Ｌ〜０．５ｍｍｏｌ
／Ｌ ＩＰＴＧ存在下で１〜２４時間、ｐＡＬ９１８１
を利用する場合には０．２％ Ｌ−アラビノース添加条
件下で１〜２４時間、ｐＣＥＸ２を用いる場合には０．
１％〜２％ 酢酸アンモニウムまたは酢酸ナトリウム添
加条件下で１〜２４時間、処理することが望ましい。
好気条件下に行う。培養温度は一般に２６℃〜３７℃が
最適である。培養期間は、通常１日〜５日間である。プ
リンヌクレオチドの前駆物質よりプリンヌクレオチドを
合成可能な酵素をコードする遺伝子を発現させるための
誘導処理条件としては、例えば、ｐＰＡＣ３１またはｐ
ＢＢ１を利用する場合には、通気攪拌条件下、３７℃〜
４２℃で１〜２４時間、ｐＲＫ２４８ｃＩｔｓを利用す
る場合には、ｐＨ９で１〜２４時間、ｐＯＳＥＸ２を利
用する場合には、５０ｍｍｏｌ／Ｌ〜３００ｍｍｏｌ／
Ｌ ＮａＣｌ存在下で１〜２４時間、ｐＴｒｃ９９Ａを
利用する場合には０．１ｍｍｏｌ／Ｌ〜０．５ｍｍｏｌ
／Ｌ ＩＰＴＧ存在下で１〜２４時間、ｐＡＬ９１８１
を利用する場合には０．２％ Ｌ−アラビノース添加条
件下で１〜２４時間、ｐＣＥＸ２を用いる場合には０．
１％〜２％ 酢酸アンモニウムまたは酢酸ナトリウム添
加条件下で１〜２４時間、処理することが望ましい。
【００５６】プリンヌクレオチドの前駆物質よりプリン
ヌクレオチドを合成する反応工程において、界面活性剤
を添加することが好ましい。該界面活性剤としては、ポ
リオキシエチレン・ステアリルアミン（例えばナイミー
ンＳ−２１５日本油脂社製）、セチルトリメチルアンモ
ニウム・ブロマイド、カチオンＦＢ、カチオンＦ２−４
０Ｅ等のカチオン性界面活性剤、ナトリウムオレイルア
ミド硫酸、ニューレックスＴＡＢ、ラピゾール８０等の
アニオン性界面活性剤、ポリオキシエチレンソルビタン
・モノステアレート（例えばノニオンST221）等の両性
界面活性剤等、プリンヌクレオチドの細胞膜透過を促進
するものが好ましい。該界面活性剤は、通常０．１〜５
０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは１〜２０ｍｇ／ｍｌの濃度で
用いられる。
ヌクレオチドを合成する反応工程において、界面活性剤
を添加することが好ましい。該界面活性剤としては、ポ
リオキシエチレン・ステアリルアミン（例えばナイミー
ンＳ−２１５日本油脂社製）、セチルトリメチルアンモ
ニウム・ブロマイド、カチオンＦＢ、カチオンＦ２−４
０Ｅ等のカチオン性界面活性剤、ナトリウムオレイルア
ミド硫酸、ニューレックスＴＡＢ、ラピゾール８０等の
アニオン性界面活性剤、ポリオキシエチレンソルビタン
・モノステアレート（例えばノニオンST221）等の両性
界面活性剤等、プリンヌクレオチドの細胞膜透過を促進
するものが好ましい。該界面活性剤は、通常０．１〜５
０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは１〜２０ｍｇ／ｍｌの濃度で
用いられる。
【００５７】プリンヌクレオチドの前駆物質よりプリン
ヌクレオチドを合成する工程の反応は、ｐＨ６〜８に調
整し、温度２０〜４０℃に保ち１〜４８時間行う。反応
終了後、反応液中に生成蓄積したプリンヌクレオチドを
採取する方法は、菌体を除去して濃縮晶析する方法、活
性炭処理法、あるいはイオン交換樹脂法等の公知の方法
により実施できる〔遠藤 勲ら、化学工学会（編）「バ
イオセパレーションプロセス便覧」、共立出版 (199
6)〕。
ヌクレオチドを合成する工程の反応は、ｐＨ６〜８に調
整し、温度２０〜４０℃に保ち１〜４８時間行う。反応
終了後、反応液中に生成蓄積したプリンヌクレオチドを
採取する方法は、菌体を除去して濃縮晶析する方法、活
性炭処理法、あるいはイオン交換樹脂法等の公知の方法
により実施できる〔遠藤 勲ら、化学工学会（編）「バ
イオセパレーションプロセス便覧」、共立出版 (199
6)〕。
【００５８】以下に本発明の実施例を示すが、本発明は
これらの実施例に限定されるものではない。遺伝子工学
的手法は断らない限り、モレキュラー・クローニング第
２版記載の方法に準じて行った。
これらの実施例に限定されるものではない。遺伝子工学
的手法は断らない限り、モレキュラー・クローニング第
２版記載の方法に準じて行った。
【００５９】実施例１ ＰLプロモーター支配下にエシ
ェリヒア・コリのＸＭＰアミナーゼ遺伝子を有するコリ
ネバクテリウム・アンモニアゲネスのＸＭＰ生産菌の造
成および該微生物によるＧＭＰの生産 (1) ＸＭＰアミナーゼ遺伝子の発現を温度によって制御
可能な誘導発現プラスミドｐＬＡＣ８５７の造成 熱誘導発現プラスミドｐＬＡＣ８５７は、公知のプラス
ミドｐＰＬＡ６６から以下の２つのステップを経て構築
した。ｐＰＬＡ６６は、ＰLプロモーターおよびｔｒｐ
ＬのＳＤ配列の下流にＸＭＰアミナーゼ遺伝子を連結す
ることにより造成されたＸＭＰアミナーゼの高発現プラ
スミドである〔Biosci. Biotech. Biochem., 61, 840
(1997)〕。
ェリヒア・コリのＸＭＰアミナーゼ遺伝子を有するコリ
ネバクテリウム・アンモニアゲネスのＸＭＰ生産菌の造
成および該微生物によるＧＭＰの生産 (1) ＸＭＰアミナーゼ遺伝子の発現を温度によって制御
可能な誘導発現プラスミドｐＬＡＣ８５７の造成 熱誘導発現プラスミドｐＬＡＣ８５７は、公知のプラス
ミドｐＰＬＡ６６から以下の２つのステップを経て構築
した。ｐＰＬＡ６６は、ＰLプロモーターおよびｔｒｐ
ＬのＳＤ配列の下流にＸＭＰアミナーゼ遺伝子を連結す
ることにより造成されたＸＭＰアミナーゼの高発現プラ
スミドである〔Biosci. Biotech. Biochem., 61, 840
(1997)〕。
【００６０】温度感受性リプレッサー遺伝子ｃＩ８５７
をプラスミドｐＰＬＡ６６へ、以下の方法で挿入した。
ｐＰＬＡ６６ １μｇをＥｃｏＲＩ（５単位）およびＢ
ｇｌＩＩ（５単位）で切断した。該切断物をアガロース
ゲル電気泳動法で分離し、ＰLプロモーターおよびエシ
ェリヒア・コリ由来のＸＭＰアミナーゼ遺伝子（ｇｕａ
Ａ遺伝子）部分を含むＤＮＡ断片をＱＩＡＧＥＮ社製Ｑ
ＩＡＥＸＩＩを用いてゲルから回収した。ｃＩ８５７遺
伝子を含有するプラスミドｐＰＡＣ３１（ＷＯ９８／１
２３４３号）１μｇをＥｃｏＲＩ（５単位）およびＢａ
ｍＨＩ（５単位）で切断した。該切断物をアガロースゲ
ル電気泳動で分離し、ｃＩ８５７遺伝子、アンピシリン
耐性遺伝子およびエシェリヒア・コリ由来の複製起点を
含有するＤＮＡ断片をゲルから回収した。
をプラスミドｐＰＬＡ６６へ、以下の方法で挿入した。
ｐＰＬＡ６６ １μｇをＥｃｏＲＩ（５単位）およびＢ
ｇｌＩＩ（５単位）で切断した。該切断物をアガロース
ゲル電気泳動法で分離し、ＰLプロモーターおよびエシ
ェリヒア・コリ由来のＸＭＰアミナーゼ遺伝子（ｇｕａ
Ａ遺伝子）部分を含むＤＮＡ断片をＱＩＡＧＥＮ社製Ｑ
ＩＡＥＸＩＩを用いてゲルから回収した。ｃＩ８５７遺
伝子を含有するプラスミドｐＰＡＣ３１（ＷＯ９８／１
２３４３号）１μｇをＥｃｏＲＩ（５単位）およびＢａ
ｍＨＩ（５単位）で切断した。該切断物をアガロースゲ
ル電気泳動で分離し、ｃＩ８５７遺伝子、アンピシリン
耐性遺伝子およびエシェリヒア・コリ由来の複製起点を
含有するＤＮＡ断片をゲルから回収した。
【００６１】該遺伝子を含有するＤＮＡ断片と先に調製
したｇｕａＡ遺伝子を含有するＤＮＡ断片を宝酒造社製
のライゲーションキットを用いて連結処理した。該連結
処理液を用いてエシェリヒア・コリJM109(宝酒造社製)
を形質転換後、１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬ
寒天培地上に塗布し、アンピシリンに耐性となった形質
転換体を得た。
したｇｕａＡ遺伝子を含有するＤＮＡ断片を宝酒造社製
のライゲーションキットを用いて連結処理した。該連結
処理液を用いてエシェリヒア・コリJM109(宝酒造社製)
を形質転換後、１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬ
寒天培地上に塗布し、アンピシリンに耐性となった形質
転換体を得た。
【００６２】得られた形質転換体からアルカリ溶菌法に
よりプラスミドＤＮＡを抽出した。該プラスミドを各種
制限酵素で切断解析した結果、ＰLプロモーター支配下
に連結されたＸＭＰアミナーゼ遺伝子、ｃＩ８５７遺伝
子、アンピシリン耐性遺伝子およびエシェリヒア・コリ
内で自律複製可能なプラスミドの複製起点からなる構造
を有するプラスミドｐＬＡ８５７を取得した。
よりプラスミドＤＮＡを抽出した。該プラスミドを各種
制限酵素で切断解析した結果、ＰLプロモーター支配下
に連結されたＸＭＰアミナーゼ遺伝子、ｃＩ８５７遺伝
子、アンピシリン耐性遺伝子およびエシェリヒア・コリ
内で自律複製可能なプラスミドの複製起点からなる構造
を有するプラスミドｐＬＡ８５７を取得した。
【００６３】該ｐＬＡ８５７へ、コリネバクテリウム内
で自律複製可能なプラスミドの複製起点を、以下の方法
で挿入した。ｐＬＡ８５７ １μｇを本プラスミド上に
唯一存在するＰｓｔ１（５単位）で切断し、該切断物を
アガロースゲル電気泳動法で分離し、ゲルから回収し、
ｐＬＡ８５７のＰｓｔ１切断物を取得した。
で自律複製可能なプラスミドの複製起点を、以下の方法
で挿入した。ｐＬＡ８５７ １μｇを本プラスミド上に
唯一存在するＰｓｔ１（５単位）で切断し、該切断物を
アガロースゲル電気泳動法で分離し、ゲルから回収し、
ｐＬＡ８５７のＰｓｔ１切断物を取得した。
【００６４】コリネバクテリウム・アンモニアゲネスで
複製可能なプラスミドベクターｐＣＧ１１６（特開平1-
265892号）１μgをＰｓｔ１(5単位)で切断し、再結合を
防止するためアルカリホスファターゼ処理によるＤＮＡ
の脱リン酸化後、フェノール抽出処理、エタノール沈殿
を行い、ｐＣＧ１１６のＰｓｔ１切断物を取得した。
複製可能なプラスミドベクターｐＣＧ１１６（特開平1-
265892号）１μgをＰｓｔ１(5単位)で切断し、再結合を
防止するためアルカリホスファターゼ処理によるＤＮＡ
の脱リン酸化後、フェノール抽出処理、エタノール沈殿
を行い、ｐＣＧ１１６のＰｓｔ１切断物を取得した。
【００６５】上記で取得した、ｐＬＡ８５７のＰｓｔ１
切断物とｐＣＧ１１６のＰｓｔ１切断物をライゲーショ
ンキット（同上）を用いて連結処理した。該連結処理に
より取得したＤＮＡ １μgを用い、電気パルス法〔App
l. Microbiol. Biotechnol., 30, 283 (1989)〕によっ
てコリネバクテリウム・アンモニアゲネスATCC 6872株
を形質転換し、スペクチノマイシン１００μｇ／ｍｌを
含むＡ寒天培地〔グルコース ０．５％、ペプトン １
％、肉エキス ０．５％、酵母エキス ０．５％、塩化ナ
トリウム ０．２５％、寒天 １．５％、アデニン １０
ｍｇ／L、グアニン １０ｍｇ／L（ｐＨ７．２）〕に塗
布した。
切断物とｐＣＧ１１６のＰｓｔ１切断物をライゲーショ
ンキット（同上）を用いて連結処理した。該連結処理に
より取得したＤＮＡ １μgを用い、電気パルス法〔App
l. Microbiol. Biotechnol., 30, 283 (1989)〕によっ
てコリネバクテリウム・アンモニアゲネスATCC 6872株
を形質転換し、スペクチノマイシン１００μｇ／ｍｌを
含むＡ寒天培地〔グルコース ０．５％、ペプトン １
％、肉エキス ０．５％、酵母エキス ０．５％、塩化ナ
トリウム ０．２５％、寒天 １．５％、アデニン １０
ｍｇ／L、グアニン １０ｍｇ／L（ｐＨ７．２）〕に塗
布した。
【００６６】スペクチノマイシンに耐性となった形質転
換体からアルカリ溶菌法によりプラスミドＤＮＡを抽出
した。該プラスミドを各種制限酵素で切断解析し、得ら
れた形質転換株が図１に示した目的の構造を有するプラ
スミドｐＬＡＣ８５７を保有していることを確認した。
換体からアルカリ溶菌法によりプラスミドＤＮＡを抽出
した。該プラスミドを各種制限酵素で切断解析し、得ら
れた形質転換株が図１に示した目的の構造を有するプラ
スミドｐＬＡＣ８５７を保有していることを確認した。
【００６７】ｐＬＡＣ８５７を有するコリネバクテリウ
ム・アンモニアゲネスＡＴＣＣ６８７２／ｐＬＡＣ８５
７はブダペスト条約に基づいて、平成１１年２月５日付
けで工業技術院生命工学技術研究所、日本国茨城県つく
ば市東１丁目１番３号（郵便番号３０５-００４６）に
ＦＥＲＭ ＢＰ−６６３９として寄託されている。
ム・アンモニアゲネスＡＴＣＣ６８７２／ｐＬＡＣ８５
７はブダペスト条約に基づいて、平成１１年２月５日付
けで工業技術院生命工学技術研究所、日本国茨城県つく
ば市東１丁目１番３号（郵便番号３０５-００４６）に
ＦＥＲＭ ＢＰ−６６３９として寄託されている。
【００６８】(2) ＦＥＲＭ ＢＰ−１２６１株にｐＬＡ
Ｃ８５７を導入した株の有するＸＭＰアミナーゼ活性の
測定 コリネバクテリウム・アンモニアゲネスＡＴＣＣ６８７
２／ｐＬＡＣ８５７（ＦＥＲＭ ＢＰ−６６３９）から
アルカリ溶菌法によりｐＬＡＣ８５７を抽出した。
Ｃ８５７を導入した株の有するＸＭＰアミナーゼ活性の
測定 コリネバクテリウム・アンモニアゲネスＡＴＣＣ６８７
２／ｐＬＡＣ８５７（ＦＥＲＭ ＢＰ−６６３９）から
アルカリ溶菌法によりｐＬＡＣ８５７を抽出した。
【００６９】該プラスミドを用い、電気パルス法（上
記）によってコリネバクテリウム・アンモニアゲネスの
ＸＭＰ生産菌ＦＥＲＭ ＢＰ−１２６１（特許番号第２
６１８３８３号：アデニンのリーキー要求性およびグア
ニン要求性）を形質転換した。スペクチノマイシンに耐
性となった形質転換体からアルカリ溶菌法によりプラス
ミドＤＮＡを抽出した。
記）によってコリネバクテリウム・アンモニアゲネスの
ＸＭＰ生産菌ＦＥＲＭ ＢＰ−１２６１（特許番号第２
６１８３８３号：アデニンのリーキー要求性およびグア
ニン要求性）を形質転換した。スペクチノマイシンに耐
性となった形質転換体からアルカリ溶菌法によりプラス
ミドＤＮＡを抽出した。
【００７０】該プラスミドを各種制限酵素で切断解析
し、得られた形質転換株がｐＬＡＣ８５７を保有してい
ることを確認した。ｐＬＡＣ８５７を有するＸＭＰ生産
菌ＦＥＲＭ ＢＰ−１２６１株を、スペクチノマイシン
１００μｇ／ｍｌを含むＡ培地（Ａ寒天培地から寒天を
除いたもの）で、３０℃および３７℃条件下、２４時
間、振盪培養した。
し、得られた形質転換株がｐＬＡＣ８５７を保有してい
ることを確認した。ｐＬＡＣ８５７を有するＸＭＰ生産
菌ＦＥＲＭ ＢＰ−１２６１株を、スペクチノマイシン
１００μｇ／ｍｌを含むＡ培地（Ａ寒天培地から寒天を
除いたもの）で、３０℃および３７℃条件下、２４時
間、振盪培養した。
【００７１】培養後、遠心分離により菌体を取得した。
該菌体を１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）
で２回洗浄後、同緩衝液１０ｍｌに懸濁した。該菌体懸
濁液にガラスビーズ（シンマルエンタープライゼス社製
０．１〜０．２φ）１０ｇを添加し、氷冷しながらホモ
ゲナイザー（日本精機社製）で１０分間破砕処理した。
該菌体を１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）
で２回洗浄後、同緩衝液１０ｍｌに懸濁した。該菌体懸
濁液にガラスビーズ（シンマルエンタープライゼス社製
０．１〜０．２φ）１０ｇを添加し、氷冷しながらホモ
ゲナイザー（日本精機社製）で１０分間破砕処理した。
【００７２】得られた処理液を４℃にて１０分間遠心
（１４０００×ｇ）し、上清を細胞抽出液として回収し
た。予め４２℃に保温した細胞抽出液を添加した反応液
〔１６０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．
６）、１２ｍｍｏｌ／Ｌ ＡＴＰ Ｎａ2 ３Ｈ2Ｏ、１６
ｍｍｏｌ／Ｌ ＭｇＳＯ4 ７Ｈ2Ｏ、４０ｍｍｏｌ／Ｌ
（ＮＨ4）2ＳＯ4〕１．１５ｍｌに０．１ｍｌの０．３
ｍｏｌ／Ｌ ＸＭＰを加えて４２℃で反応を開始した。
１５分後に、反応液に３．９ｍｌの３．５％過塩素酸を
加えて反応を停止させた。
（１４０００×ｇ）し、上清を細胞抽出液として回収し
た。予め４２℃に保温した細胞抽出液を添加した反応液
〔１６０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．
６）、１２ｍｍｏｌ／Ｌ ＡＴＰ Ｎａ2 ３Ｈ2Ｏ、１６
ｍｍｏｌ／Ｌ ＭｇＳＯ4 ７Ｈ2Ｏ、４０ｍｍｏｌ／Ｌ
（ＮＨ4）2ＳＯ4〕１．１５ｍｌに０．１ｍｌの０．３
ｍｏｌ／Ｌ ＸＭＰを加えて４２℃で反応を開始した。
１５分後に、反応液に３．９ｍｌの３．５％過塩素酸を
加えて反応を停止させた。
【００７３】該反応停止液を、３０００ｒｐｍで１０分
間遠心分離後、上清の２９０ｎｍにおける吸光度を測定
した。１分間に１μｍｏｌのＧＭＰを生成させる活性を
１単位（Ｕ）とし、蛋白質１ｍｇ当たりの比活性を算出
した。蛋白量は、プロテイン・アッセイキット（バイオ
ラッド社製）を用いて定量した。
間遠心分離後、上清の２９０ｎｍにおける吸光度を測定
した。１分間に１μｍｏｌのＧＭＰを生成させる活性を
１単位（Ｕ）とし、蛋白質１ｍｇ当たりの比活性を算出
した。蛋白量は、プロテイン・アッセイキット（バイオ
ラッド社製）を用いて定量した。
【００７４】結果を第１表に示した。３０℃で培養した
菌体では活性が検出されなかったのに対し、３７℃で培
養した菌体では活性が検出された。本結果は、ｐＬＡＣ
８５７を有するＦＥＲＭ ＢＰ−１２６１株において、
ＸＭＰアミナーゼ遺伝子の発現がＰLプロモーターの支
配下にあり、該酵素活性を温度によって制御できること
を示している。
菌体では活性が検出されなかったのに対し、３７℃で培
養した菌体では活性が検出された。本結果は、ｐＬＡＣ
８５７を有するＦＥＲＭ ＢＰ−１２６１株において、
ＸＭＰアミナーゼ遺伝子の発現がＰLプロモーターの支
配下にあり、該酵素活性を温度によって制御できること
を示している。
【００７５】
【表１】
【００７６】(3) ｐＬＡＣ８５７を有するＸＭＰ生産
菌ＦＥＲＭ ＢＰ−１２６１株によるＧＭＰの生産 ｐＬＡＣ８５７を有するＦＥＲＭ ＢＰ−１２６１株を
ストレプトマイシン２０μｇ／ｍｌを含有するＡ寒天培
地上で３０℃、２日間培養後、得られた菌体をストレプ
トマイシン２０μｇ／ｍｌを含有する６０ｍｌのＣシー
ド培地〔グルコース ５％、酵母エキス １％、ペプトン
１％、ＮａＣｌ ０．２５％、尿素 ０．３％、アデニ
ン １５０ｍｇ／L、グアニン １５０ｍｇ／L（ｐＨ７．
２）〕を添加した２５０ｍｌ容三角フラスコに植菌し、
３０℃、２４時間浸とう培養した。
菌ＦＥＲＭ ＢＰ−１２６１株によるＧＭＰの生産 ｐＬＡＣ８５７を有するＦＥＲＭ ＢＰ−１２６１株を
ストレプトマイシン２０μｇ／ｍｌを含有するＡ寒天培
地上で３０℃、２日間培養後、得られた菌体をストレプ
トマイシン２０μｇ／ｍｌを含有する６０ｍｌのＣシー
ド培地〔グルコース ５％、酵母エキス １％、ペプトン
１％、ＮａＣｌ ０．２５％、尿素 ０．３％、アデニ
ン １５０ｍｇ／L、グアニン １５０ｍｇ／L（ｐＨ７．
２）〕を添加した２５０ｍｌ容三角フラスコに植菌し、
３０℃、２４時間浸とう培養した。
【００７７】得られた培養液全量を、０．９４ＬのＤシ
ード培地〔グルコース ８．８％、肉エキス １．７％、
ペプトン １．７％、ＫＨ2ＰＯ4 ０．１６７％、Ｋ2Ｈ
ＰＯ4０．１６７％、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．１６７
％、アデニン ３３３ｍｇ／L、グアニン ３５０ｍｇ／
L、ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ３３ｍｇ／L、ＺｎＳＯ4・７Ｈ
2Ｏ １７ｍｇ／L、ＭｎＳＯ4・４〜６Ｈ2Ｏ ６．７ｍｇ
／L、β−アラニン ２５ｍｇ／L、Ｌ−システイン ３３
ｍｇ／L、ビオチン １６７μｇ／L、ＣｕＳＯ4・５Ｈ2
Ｏ １．３ｍｇ／L、チアミン８．３ｍｇ／L（ｐＨ７．
２）〕を添加した２Ｌ容発酵槽に植菌し、５．５ｍｏｌ
／Ｌアンモニア水でｐＨを７．２に保ちつつ、３０℃、
攪拌６００ｒｐｍ、通気１Ｌ／ｍｉｎの条件で２４時間
培養を行った。
ード培地〔グルコース ８．８％、肉エキス １．７％、
ペプトン １．７％、ＫＨ2ＰＯ4 ０．１６７％、Ｋ2Ｈ
ＰＯ4０．１６７％、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．１６７
％、アデニン ３３３ｍｇ／L、グアニン ３５０ｍｇ／
L、ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ３３ｍｇ／L、ＺｎＳＯ4・７Ｈ
2Ｏ １７ｍｇ／L、ＭｎＳＯ4・４〜６Ｈ2Ｏ ６．７ｍｇ
／L、β−アラニン ２５ｍｇ／L、Ｌ−システイン ３３
ｍｇ／L、ビオチン １６７μｇ／L、ＣｕＳＯ4・５Ｈ2
Ｏ １．３ｍｇ／L、チアミン８．３ｍｇ／L（ｐＨ７．
２）〕を添加した２Ｌ容発酵槽に植菌し、５．５ｍｏｌ
／Ｌアンモニア水でｐＨを７．２に保ちつつ、３０℃、
攪拌６００ｒｐｍ、通気１Ｌ／ｍｉｎの条件で２４時間
培養を行った。
【００７８】得られた培養液１２０ｍｌを、０．８８Ｌ
のＦ発酵培地〔グルコース ８％、オルソリン酸１．６
７％、ＫＯＨ １．２９％、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ １．２
％、ＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ １２３ｍｇ／L、ＦｅＳＯ4・
７Ｈ2Ｏ ２４．６ｍｇ／L、ＭｎＳＯ4・４〜６Ｈ2Ｏ １
２．３ｍｇ／L、ＺｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ １２．３ｍｇ／
L、β−アラニン １８．５ｍｇ／L、Ｌ−システイン ２
４．６ｍｇ／L、ニコチン酸アミド ６．２ｍｇ／L、ヒ
スチジン ２４．６ｍｇ／L、ビオチン １８５μｇ／L、
ＣｕＳＯ4・５Ｈ2Ｏ ２．５ｍｇ／L、アデニン ２０３
ｍｇ／L、グアニン１０ｍｇ／L（ｐＨ７．２）〕を添加
した２Ｌ容発酵槽に植菌し、５．５ｍｏｌ／Ｌアンモニ
ア水でｐＨ７．２に保ちつつ、２８℃、攪拌６００ｒｐ
ｍ、通気１Ｌ／ｍｉｎの条件で４４時間培養を行った。
のＦ発酵培地〔グルコース ８％、オルソリン酸１．６
７％、ＫＯＨ １．２９％、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ １．２
％、ＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ １２３ｍｇ／L、ＦｅＳＯ4・
７Ｈ2Ｏ ２４．６ｍｇ／L、ＭｎＳＯ4・４〜６Ｈ2Ｏ １
２．３ｍｇ／L、ＺｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ １２．３ｍｇ／
L、β−アラニン １８．５ｍｇ／L、Ｌ−システイン ２
４．６ｍｇ／L、ニコチン酸アミド ６．２ｍｇ／L、ヒ
スチジン ２４．６ｍｇ／L、ビオチン １８５μｇ／L、
ＣｕＳＯ4・５Ｈ2Ｏ ２．５ｍｇ／L、アデニン ２０３
ｍｇ／L、グアニン１０ｍｇ／L（ｐＨ７．２）〕を添加
した２Ｌ容発酵槽に植菌し、５．５ｍｏｌ／Ｌアンモニ
ア水でｐＨ７．２に保ちつつ、２８℃、攪拌６００ｒｐ
ｍ、通気１Ｌ／ｍｉｎの条件で４４時間培養を行った。
【００７９】培養終了後の、培地上清中のＸＭＰおよび
ＧＭＰの蓄積量を、ＨＰＬＣを用いて次のようにして定
量した。 ＨＰＬＣ分析 カラム：Asahipak GS-320H（旭化成社製） 溶出液：０．２ｍｏｌ／Ｌ ＮａＨ2ＰＯ4（ｐＨ３．
０） 流速：１ｍｌ／ｍｉｎ 検出：ＵＶ２５４ｎｍ ＸＭＰおよびＧＭＰの蓄積量は、ＵＶ２５４ｎｍの吸光
度により測定し、吸光強度をスタンダードと比較するこ
とにより定量した。
ＧＭＰの蓄積量を、ＨＰＬＣを用いて次のようにして定
量した。 ＨＰＬＣ分析 カラム：Asahipak GS-320H（旭化成社製） 溶出液：０．２ｍｏｌ／Ｌ ＮａＨ2ＰＯ4（ｐＨ３．
０） 流速：１ｍｌ／ｍｉｎ 検出：ＵＶ２５４ｎｍ ＸＭＰおよびＧＭＰの蓄積量は、ＵＶ２５４ｎｍの吸光
度により測定し、吸光強度をスタンダードと比較するこ
とにより定量した。
【００８０】ＨＰＬＣ分析の結果、ＸＭＰは２７．２ｇ
／L生成蓄積していたが、ＧＭＰは検出されなかった。
ＸＭＰアミナーゼ遺伝子を誘導発現させるために、培養
ブロスを４０℃に昇温し５．５Ｍアンモニア水でｐＨ
７．２に保ちつつ、攪拌６００ｒｐｍ、通気１Ｌ／ｍｉ
ｎの条件で６時間熱処理を行った。
／L生成蓄積していたが、ＧＭＰは検出されなかった。
ＸＭＰアミナーゼ遺伝子を誘導発現させるために、培養
ブロスを４０℃に昇温し５．５Ｍアンモニア水でｐＨ
７．２に保ちつつ、攪拌６００ｒｐｍ、通気１Ｌ／ｍｉ
ｎの条件で６時間熱処理を行った。
【００８１】該熱誘導処理を施したＸＭＰの発酵液に、
グルコース ２．５％、フィチン酸１０ｇ／L、ＭｇＳＯ
4・７Ｈ2Ｏ ４．４ｇ／L、Ｎａ2ＨＰＯ4 ９．３６ｇ／
L、アデニン ９６．９ｍｇ／L、ナイミーンＳ−２１５
１０ｇ／Lを添加した後、５．５Ｍアンモニア水でｐＨ
を７．４に保ちつつ、４０℃、攪拌６００ｒｐｍ、通気
１Ｌ／ｍｉｎの条件で２４時間反応を行った。反応後、
培地上清中のＧＭＰの蓄積量を、上記ＨＰＬＣ分析条件
で定量した。ＨＰＬＣ分析の結果、２０．８ｇ／LのＧ
ＭＰの生成蓄積が認められた。
グルコース ２．５％、フィチン酸１０ｇ／L、ＭｇＳＯ
4・７Ｈ2Ｏ ４．４ｇ／L、Ｎａ2ＨＰＯ4 ９．３６ｇ／
L、アデニン ９６．９ｍｇ／L、ナイミーンＳ−２１５
１０ｇ／Lを添加した後、５．５Ｍアンモニア水でｐＨ
を７．４に保ちつつ、４０℃、攪拌６００ｒｐｍ、通気
１Ｌ／ｍｉｎの条件で２４時間反応を行った。反応後、
培地上清中のＧＭＰの蓄積量を、上記ＨＰＬＣ分析条件
で定量した。ＨＰＬＣ分析の結果、２０．８ｇ／LのＧ
ＭＰの生成蓄積が認められた。
【００８２】実施例２ イソシトレートリアーゼ遺伝子
のプロモーター支配下にコリネバクテリウム・アンモニ
アゲネスのＸＭＰアミナーゼ遺伝子を有するコリネバク
テリウム・アンモニアゲネスのＸＭＰ生産菌の造成およ
び該微生物によるＧＭＰの生産 （１） ＰＣＲ法によるＸＭＰアミナーゼ遺伝子の増幅
とクローニング コリネバクテリウム・アンモニアゲネスのＸＭＰアミナ
ーゼ遺伝子の単離は、塩基配列に基づきＰＣＲ法によ
り、次のようにして行った。
のプロモーター支配下にコリネバクテリウム・アンモニ
アゲネスのＸＭＰアミナーゼ遺伝子を有するコリネバク
テリウム・アンモニアゲネスのＸＭＰ生産菌の造成およ
び該微生物によるＧＭＰの生産 （１） ＰＣＲ法によるＸＭＰアミナーゼ遺伝子の増幅
とクローニング コリネバクテリウム・アンモニアゲネスのＸＭＰアミナ
ーゼ遺伝子の単離は、塩基配列に基づきＰＣＲ法によ
り、次のようにして行った。
【００８３】まず、ＸＭＰアミナーゼ遺伝子の両末端に
位置し、それぞれ制限酵素ＡｆｌＩＩ、ＢａｍＨＩ切断
部位を有する配列番号１および２に示すオリゴヌクレオ
チドを合成した。また、鋳型とするコリネバクテリウム
・アンモニアゲネスＡＴＣＣ６８７２の染色体ＤＮＡの
調整は、グリシン存在下で培養した菌体をリゾチームと
アクロモペプチダーゼ処理し、プロトプラストを調製す
る方法（特開平6-225776）に従って行った。
位置し、それぞれ制限酵素ＡｆｌＩＩ、ＢａｍＨＩ切断
部位を有する配列番号１および２に示すオリゴヌクレオ
チドを合成した。また、鋳型とするコリネバクテリウム
・アンモニアゲネスＡＴＣＣ６８７２の染色体ＤＮＡの
調整は、グリシン存在下で培養した菌体をリゾチームと
アクロモペプチダーゼ処理し、プロトプラストを調製す
る方法（特開平6-225776）に従って行った。
【００８４】染色体ＤＮＡ ０．１μｇとプライマーと
して該オリゴヌクレオチド各０．２５μｍｏｌ／Ｌおよ
びタックＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造社製）２．５ユニ
ットをｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ各２０
０μｍｏｌ／Ｌ、５０ｍｍｏｌ／Ｌ 塩化カリウム、
１．５ｍｍｏｌ／Ｌ 塩化マグネシウムおよび０．００
０１％ゼラチンを含有する１０ｍｍｏｌ／Ｌ トリス−
塩酸緩衝液（ｐＨ８．３）０．１ｍｌに添加し、ＰＣＲ
を行った。
して該オリゴヌクレオチド各０．２５μｍｏｌ／Ｌおよ
びタックＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造社製）２．５ユニ
ットをｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ各２０
０μｍｏｌ／Ｌ、５０ｍｍｏｌ／Ｌ 塩化カリウム、
１．５ｍｍｏｌ／Ｌ 塩化マグネシウムおよび０．００
０１％ゼラチンを含有する１０ｍｍｏｌ／Ｌ トリス−
塩酸緩衝液（ｐＨ８．３）０．１ｍｌに添加し、ＰＣＲ
を行った。
【００８５】ＰＣＲは、９４℃で９０秒間、５０℃で１
２０秒間、７２℃で１２０秒間の反応を１サイクルとし
て、１０サイクル繰り返し、９４℃で９０秒間、４０℃
で１２０秒間、７２℃で１２０秒間の反応を１サイクル
として、１０サイクル繰り返し、更に、９４℃で９０秒
間、４０℃で１２０秒間、７２℃で１８０秒間の反応を
１サイクルとして、２０サイクル繰り返した後、７２℃
で３６０秒間反応する条件で行った。
２０秒間、７２℃で１２０秒間の反応を１サイクルとし
て、１０サイクル繰り返し、９４℃で９０秒間、４０℃
で１２０秒間、７２℃で１２０秒間の反応を１サイクル
として、１０サイクル繰り返し、更に、９４℃で９０秒
間、４０℃で１２０秒間、７２℃で１８０秒間の反応を
１サイクルとして、２０サイクル繰り返した後、７２℃
で３６０秒間反応する条件で行った。
【００８６】得られた反応液を用い、アガロースゲル電
気泳動を行い、目的とする約１．６ｋｂのＤＮＡ断片を
回収した。該ＤＮＡ断片を制限酵素ＡｆｌＩＩ（５単
位）およびＢａｍＨＩ（５単位）で切断し、ＤＮＡ断片
の両端がＡｆｌＩＩまたはＢａｍＨＩで処理された約
１．６ｋｂの切断物をアガロースゲル電気泳動法により
分離、回収した。
気泳動を行い、目的とする約１．６ｋｂのＤＮＡ断片を
回収した。該ＤＮＡ断片を制限酵素ＡｆｌＩＩ（５単
位）およびＢａｍＨＩ（５単位）で切断し、ＤＮＡ断片
の両端がＡｆｌＩＩまたはＢａｍＨＩで処理された約
１．６ｋｂの切断物をアガロースゲル電気泳動法により
分離、回収した。
【００８７】(2) ＸＭＰアミナーゼ遺伝子の発現を炭素
源によって制御可能な誘導発現プラスミドｐＧＵＡ２の
造成 誘導発現ベクターｐＣＥＸ２（特開平3-224259号）を用
い、ＸＭＰアミナーゼ遺伝子の発現を炭素源によって制
御できるプラスミドを、以下のようにして構築した。
源によって制御可能な誘導発現プラスミドｐＧＵＡ２の
造成 誘導発現ベクターｐＣＥＸ２（特開平3-224259号）を用
い、ＸＭＰアミナーゼ遺伝子の発現を炭素源によって制
御できるプラスミドを、以下のようにして構築した。
【００８８】ｐＣＥＸ２は、コリネバクテリウム・グル
タミカムのイソシトレートリアーゼ遺伝子の発現制御領
域および転写終結シグナル配列を含むベクターで、マル
チクローニング部位に挿入された外来遺伝子の発現は、
糖質存在下では抑制され、酢酸等の非糖質存在下で誘導
される。
タミカムのイソシトレートリアーゼ遺伝子の発現制御領
域および転写終結シグナル配列を含むベクターで、マル
チクローニング部位に挿入された外来遺伝子の発現は、
糖質存在下では抑制され、酢酸等の非糖質存在下で誘導
される。
【００８９】ｐＣＥＸ２ベクターＤＮＡ １μｇをＡｆ
ｌＩＩ（０．５単位）で部分切断した後、ＢａｍＨＩ
（５単位）で切断し、イソシトレートリアーゼ遺伝子の
発現制御領域、転写終了シグナル領域、スペクチノマイ
シン耐性遺伝子およびコリネバクテリウム・グルタミカ
ム内で自律複製可能なプラスミドの複製起点を含む７．
６ｋｂのＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動法により
分離、回収した。
ｌＩＩ（０．５単位）で部分切断した後、ＢａｍＨＩ
（５単位）で切断し、イソシトレートリアーゼ遺伝子の
発現制御領域、転写終了シグナル領域、スペクチノマイ
シン耐性遺伝子およびコリネバクテリウム・グルタミカ
ム内で自律複製可能なプラスミドの複製起点を含む７．
６ｋｂのＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動法により
分離、回収した。
【００９０】該ＤＮＡ断片と上記実施例２（１）で取得
したＸＭＰアミナーゼ遺伝子のＰＣＲ増幅断片を連結処
理し、連結ＤＮＡを取得した。該連結ＤＮＡ １μｇを
用い、電気パルス法を用いてコリネバクテリウム・アン
モニアゲネスＡＴＣＣ６８７２株を形質転換し、スペク
チノマイシン１００μｇ／ｍｌを含むＡ寒天培地に塗布
した。
したＸＭＰアミナーゼ遺伝子のＰＣＲ増幅断片を連結処
理し、連結ＤＮＡを取得した。該連結ＤＮＡ １μｇを
用い、電気パルス法を用いてコリネバクテリウム・アン
モニアゲネスＡＴＣＣ６８７２株を形質転換し、スペク
チノマイシン１００μｇ／ｍｌを含むＡ寒天培地に塗布
した。
【００９１】スペクチノマイシンに耐性となった形質転
換体からアルカリ溶菌法によりプラスミドＤＮＡを抽出
した。該プラスミドＤＮＡを各種制限酵素で切断解析
し、得られた形質転換株が図２に示した目的の構造を有
するプラスミドｐＧＵＡ２を有することを確認した。
換体からアルカリ溶菌法によりプラスミドＤＮＡを抽出
した。該プラスミドＤＮＡを各種制限酵素で切断解析
し、得られた形質転換株が図２に示した目的の構造を有
するプラスミドｐＧＵＡ２を有することを確認した。
【００９２】(3) ＦＥＲＭ ＢＰ−１２６１株にｐＧＵ
Ａ２を導入した株の有するＸＭＰアミナーゼ活性の測定 ｐＧＵＡ２を有するコリネバクテリウム・アンモニアゲ
ネスＡＴＣＣ６８７２株からアルカリ溶菌法によりｐＧ
ＵＡ２を抽出した。
Ａ２を導入した株の有するＸＭＰアミナーゼ活性の測定 ｐＧＵＡ２を有するコリネバクテリウム・アンモニアゲ
ネスＡＴＣＣ６８７２株からアルカリ溶菌法によりｐＧ
ＵＡ２を抽出した。
【００９３】該プラスミドを用い、電気パルス法によっ
てコリネバクテリウム・アンモニアゲネスのＸＭＰ生産
菌ＦＥＲＭ ＢＰ−１２６１（アデニンのリーキー要求
性およびグアニン要求性）を形質転換した。スペクチノ
マイシンに耐性となった形質転換体からアルカリ溶菌法
によりプラスミドＤＮＡを抽出した。
てコリネバクテリウム・アンモニアゲネスのＸＭＰ生産
菌ＦＥＲＭ ＢＰ−１２６１（アデニンのリーキー要求
性およびグアニン要求性）を形質転換した。スペクチノ
マイシンに耐性となった形質転換体からアルカリ溶菌法
によりプラスミドＤＮＡを抽出した。
【００９４】該プラスミドを各種制限酵素で切断解析し
た結果、形質転換株がｐＧＵＡ２を保有していることを
確認した。ｐＧＵＡ２を有するＸＭＰ生産菌ＦＥＲＭ
ＢＰ−１２６１株を、スペクチノマイシン１００μｇ／
ｍｌを含むＡ培地および該培地のグルコースを酢酸アン
モニウムに代替した培地の２種類の培地で、３０℃にて
２４時間、振盪培養した。
た結果、形質転換株がｐＧＵＡ２を保有していることを
確認した。ｐＧＵＡ２を有するＸＭＰ生産菌ＦＥＲＭ
ＢＰ−１２６１株を、スペクチノマイシン１００μｇ／
ｍｌを含むＡ培地および該培地のグルコースを酢酸アン
モニウムに代替した培地の２種類の培地で、３０℃にて
２４時間、振盪培養した。
【００９５】得られた培養液から、それぞれ菌体を取得
し、実施例１（２）と同様にして細胞抽出液を調製し
た。これら抽出液を用い、これら抽出液中のＸＭＰアミ
ナーゼ活性を実施例１（２）に記載の方法に準じて測定
した。
し、実施例１（２）と同様にして細胞抽出液を調製し
た。これら抽出液を用い、これら抽出液中のＸＭＰアミ
ナーゼ活性を実施例１（２）に記載の方法に準じて測定
した。
【００９６】結果を第２表に示した。グルコースを炭素
源として培養した菌体では、極めて低レベルの活性しか
検出されなかったのに対し、２％ 酢酸アンモニウムを
炭素源として培養した菌体では高レベルの活性が検出さ
れた。
源として培養した菌体では、極めて低レベルの活性しか
検出されなかったのに対し、２％ 酢酸アンモニウムを
炭素源として培養した菌体では高レベルの活性が検出さ
れた。
【００９７】該結果は、ｐＧＵＡ２を有するＦＥＲＭ
ＢＰ−１２６１株において、ＸＭＰアミナーゼ遺伝子の
発現がイソシトレートリアーゼ遺伝子のプロモーター支
配下にあり、該酵素活性を炭素源によって制御できるこ
とを示している。
ＢＰ−１２６１株において、ＸＭＰアミナーゼ遺伝子の
発現がイソシトレートリアーゼ遺伝子のプロモーター支
配下にあり、該酵素活性を炭素源によって制御できるこ
とを示している。
【００９８】
【表２】
【００９９】(4) ＸＭＰ生産菌ＦＥＲＭ ＢＰ−１２
６１株にｐＧＵＡ２を導入した株によるＧＭＰの生産 ｐＧＵＡ２を有するＦＥＲＭ ＢＰ−１２６１株を用
い、実施例１（３）と同様な培養条件でＸＭＰ発酵を行
った。培養終了後の培地上清中のＸＭＰおよびＧＭＰの
生成蓄積量を実施例１（３）と同様な方法により定量し
た。
６１株にｐＧＵＡ２を導入した株によるＧＭＰの生産 ｐＧＵＡ２を有するＦＥＲＭ ＢＰ−１２６１株を用
い、実施例１（３）と同様な培養条件でＸＭＰ発酵を行
った。培養終了後の培地上清中のＸＭＰおよびＧＭＰの
生成蓄積量を実施例１（３）と同様な方法により定量し
た。
【０１００】その結果、ＸＭＰの蓄積量は、１８．４ｇ
／Ｌであった。ＧＭＰは検出されなかった。発酵終了
後、ＸＭＰアミナーゼ遺伝子を誘導発現させるために、
酢酸アンモニウムを最終濃度が２％になるように添加
し、５．５ｍｏｌ／Ｌ アンモニア水でｐＨ７．２に保
ちつつ、攪拌６００ｒｐｍ、通気１Ｌ／ｍｉｎの条件で
１０時間培養を継続した。
／Ｌであった。ＧＭＰは検出されなかった。発酵終了
後、ＸＭＰアミナーゼ遺伝子を誘導発現させるために、
酢酸アンモニウムを最終濃度が２％になるように添加
し、５．５ｍｏｌ／Ｌ アンモニア水でｐＨ７．２に保
ちつつ、攪拌６００ｒｐｍ、通気１Ｌ／ｍｉｎの条件で
１０時間培養を継続した。
【０１０１】酢酸アンモニウムで誘導処理を施した該培
養液に、グルコース ２．５％、フィチン酸 １０ｇ／
Ｌ、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ４．４ｇ／Ｌ、Ｎａ2ＨＰＯ4
９．３６ｇ／Ｌ、アデニン ９６．９ｍｇ／Ｌ、ナイミ
ーンＳ−２１５ １０ｇ／Ｌを添加した後、５．５ｍｏ
ｌ／Ｌ アンモニア水でｐＨを７．４に保ちつつ、４０
℃、攪拌６００ｒｐｍ、通気１Ｌ／ｍｉｎの条件で２４
時間反応を行った。
養液に、グルコース ２．５％、フィチン酸 １０ｇ／
Ｌ、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ４．４ｇ／Ｌ、Ｎａ2ＨＰＯ4
９．３６ｇ／Ｌ、アデニン ９６．９ｍｇ／Ｌ、ナイミ
ーンＳ−２１５ １０ｇ／Ｌを添加した後、５．５ｍｏ
ｌ／Ｌ アンモニア水でｐＨを７．４に保ちつつ、４０
℃、攪拌６００ｒｐｍ、通気１Ｌ／ｍｉｎの条件で２４
時間反応を行った。
【０１０２】反応後、該反応液の培地上清中のＧＭＰの
蓄積量を実施例１（３）に記載の方法に準じて定量し
た。該反応液に、ＧＭＰは１４．４ｇ／Ｌの生成蓄積さ
れていた。
蓄積量を実施例１（３）に記載の方法に準じて定量し
た。該反応液に、ＧＭＰは１４．４ｇ／Ｌの生成蓄積さ
れていた。
【０１０３】実施例３ イソシトレートリアーゼ遺伝子
のプロモーター支配下にエシェリヒア・コリのイノシン
グアノシンキナーゼ遺伝子を有するコリネバクテリウム
・アンモニアゲネスのイノシン生産菌の造成および該微
生物によるＩＭＰの生産 (1)ＰＣＲ法によるイノシングアノシンキナーゼ遺伝子
の増幅とクローニング エシェリヒア・コリのイノシングアノシンキナーゼ遺伝
子の単離は、公知の塩基配列（ＷＯ９１／０８２８６
号）に基づきＰＣＲ法により、次のようにして行った。
のプロモーター支配下にエシェリヒア・コリのイノシン
グアノシンキナーゼ遺伝子を有するコリネバクテリウム
・アンモニアゲネスのイノシン生産菌の造成および該微
生物によるＩＭＰの生産 (1)ＰＣＲ法によるイノシングアノシンキナーゼ遺伝子
の増幅とクローニング エシェリヒア・コリのイノシングアノシンキナーゼ遺伝
子の単離は、公知の塩基配列（ＷＯ９１／０８２８６
号）に基づきＰＣＲ法により、次のようにして行った。
【０１０４】イノシングアノシンキナーゼ遺伝子の両末
端に位置し、それぞれ制限酵素ＡｆｌＩＩおよびＢａｍ
ＨＩ切断部位を有する配列番号３および４に示すオリゴ
ヌクレオチドを合成した。イノシングアノシンキナーゼ
遺伝子の鋳型として、エシェリヒア・コリＨＭ７０／ｐ
ＢＭ２株（ＷＯ９１／０８２８６号）が保有するプラス
ミドｐＢＭ２を用いた。
端に位置し、それぞれ制限酵素ＡｆｌＩＩおよびＢａｍ
ＨＩ切断部位を有する配列番号３および４に示すオリゴ
ヌクレオチドを合成した。イノシングアノシンキナーゼ
遺伝子の鋳型として、エシェリヒア・コリＨＭ７０／ｐ
ＢＭ２株（ＷＯ９１／０８２８６号）が保有するプラス
ミドｐＢＭ２を用いた。
【０１０５】該プラスミドＤＮＡ ０．１μｇとプライ
マーとして該オリゴヌクレオチド各０．２５μｍｏｌ／
ＬおよびタックＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造社製）２．
５ユニットをｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ
各２００μｍｏｌ／Ｌ、５０ｍｍｏｌ／Ｌ 塩化カリウ
ム、１．５ｍｍｏｌ／Ｌ 塩化マグネシウムおよび０．
０００１％ ゼラチンを含有する１０ｍｍｏｌ／Ｌ トリ
ス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．３）０．１ｍｌに添加し、
ＰＣＲを行った。
マーとして該オリゴヌクレオチド各０．２５μｍｏｌ／
ＬおよびタックＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造社製）２．
５ユニットをｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ
各２００μｍｏｌ／Ｌ、５０ｍｍｏｌ／Ｌ 塩化カリウ
ム、１．５ｍｍｏｌ／Ｌ 塩化マグネシウムおよび０．
０００１％ ゼラチンを含有する１０ｍｍｏｌ／Ｌ トリ
ス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．３）０．１ｍｌに添加し、
ＰＣＲを行った。
【０１０６】ＰＣＲは、９４℃で９０秒間、５０℃で１
２０秒間、７２℃で１２０秒間の反応を１サイクルとし
て、１０サイクル繰り返した後、９４℃で９０秒間、４
０℃で１２０秒間、７２℃で１２０秒間の反応を１サイ
クルとして、１０サイクル繰り返し、更に、９４℃で９
０秒間、４０℃で１２０秒間、７２℃で１８０秒間の反
応を１サイクルとして、２０サイクル繰り返した後、７
２℃で３６０秒間反応する条件で行った。
２０秒間、７２℃で１２０秒間の反応を１サイクルとし
て、１０サイクル繰り返した後、９４℃で９０秒間、４
０℃で１２０秒間、７２℃で１２０秒間の反応を１サイ
クルとして、１０サイクル繰り返し、更に、９４℃で９
０秒間、４０℃で１２０秒間、７２℃で１８０秒間の反
応を１サイクルとして、２０サイクル繰り返した後、７
２℃で３６０秒間反応する条件で行った。
【０１０７】得られたＰＣＲ反応産物とＰＣＲ産物クロ
ーニング用ベクターｐＴ−Ａｄｖベクター（クローンテ
ック社製）とを連結処理した。該連結処理により取得し
たＤＮＡ １μgを用い、エシェリヒア・コリＤＨ５αを
形質転換し、アンピシリン１００μｇ／ｍｌを含むＬ寒
天培地に塗布した。
ーニング用ベクターｐＴ−Ａｄｖベクター（クローンテ
ック社製）とを連結処理した。該連結処理により取得し
たＤＮＡ １μgを用い、エシェリヒア・コリＤＨ５αを
形質転換し、アンピシリン１００μｇ／ｍｌを含むＬ寒
天培地に塗布した。
【０１０８】アンピシリンに耐性となった形質転換体か
ら、アルカリ溶菌法によりプラスミドｐＴ−ＡＩを抽出
した。該プラスミドｐＴ−ＡＩの構造を、各種制限酵素
を用いて解析し、該プラスミドがイノシングアノシンキ
ナーゼ遺伝子（１．３ｋｂ）、アンピシリン耐性遺伝
子、カナマイシン耐性遺伝子、およびエシェリヒア・コ
リ由来の複製起点を有することを確認した。
ら、アルカリ溶菌法によりプラスミドｐＴ−ＡＩを抽出
した。該プラスミドｐＴ−ＡＩの構造を、各種制限酵素
を用いて解析し、該プラスミドがイノシングアノシンキ
ナーゼ遺伝子（１．３ｋｂ）、アンピシリン耐性遺伝
子、カナマイシン耐性遺伝子、およびエシェリヒア・コ
リ由来の複製起点を有することを確認した。
【０１０９】(2) イノシングアノシンキナーゼ遺伝子の
発現を炭素源によって制御可能な誘導発現プラスミドｐ
ＩＧＫ２の造成 誘導発現ベクターｐＣＥＸ２（特開平3-224259号）を用
い、イノシングアノシンキナーゼ遺伝子の発現を炭素源
によって制御できるプラスミドを、以下のようにして構
築した。
発現を炭素源によって制御可能な誘導発現プラスミドｐ
ＩＧＫ２の造成 誘導発現ベクターｐＣＥＸ２（特開平3-224259号）を用
い、イノシングアノシンキナーゼ遺伝子の発現を炭素源
によって制御できるプラスミドを、以下のようにして構
築した。
【０１１０】ｐＣＥＸ２ベクターＤＮＡ １μｇをＫｐ
ｎＩ（５単位）で切断し、イソシトレートリアーゼ遺伝
子の発現制御領域、転写終了シグナル領域、スペクチノ
マイシン耐性遺伝子およびコリネバクテリウム・グルタ
ミカム由来の複製起点を含む７．６ｋｂのＤＮＡ断片を
アガロースゲル電気泳動法により分離、回収した。
ｎＩ（５単位）で切断し、イソシトレートリアーゼ遺伝
子の発現制御領域、転写終了シグナル領域、スペクチノ
マイシン耐性遺伝子およびコリネバクテリウム・グルタ
ミカム由来の複製起点を含む７．６ｋｂのＤＮＡ断片を
アガロースゲル電気泳動法により分離、回収した。
【０１１１】上記実施例３（１）で得たイノシングアノ
シンキナーゼ遺伝子を含有するプラスミドｐＴ−ＡＩ１
μｇをＫｐｎＩ（５単位）で切断した後、脱リン酸処理
した。該ＫｐｎＩ切断ＤＮＡ断片と上記ｐＣＥＸ２のＫ
ｐｎＩ切断断片を連結処理した。得られた連結混合液を
用い、エシェリヒア・コリＤＨ５αを形質転換後、１０
０μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬ寒天培地上に塗布
し、アンピシリン耐性となった形質転換株を得た。
シンキナーゼ遺伝子を含有するプラスミドｐＴ−ＡＩ１
μｇをＫｐｎＩ（５単位）で切断した後、脱リン酸処理
した。該ＫｐｎＩ切断ＤＮＡ断片と上記ｐＣＥＸ２のＫ
ｐｎＩ切断断片を連結処理した。得られた連結混合液を
用い、エシェリヒア・コリＤＨ５αを形質転換後、１０
０μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬ寒天培地上に塗布
し、アンピシリン耐性となった形質転換株を得た。
【０１１２】得られた形質転換体から、アルカリ溶菌法
によりプラスミドを抽出した。該プラスミドを各種制限
酵素で切断解析した結果、図３に示した目的の構造を有
するプラスミドｐＩＧＫ２を得た。該ＤＮＡ １μｇを
用い電気パルス法によってコリネバクテリウム・アンモ
ニアゲネスＡＴＣＣ６８７２株を形質転換し、スペクチ
ノマイシン１００μｇ／ｍｌを含むＡ寒天培地に塗布し
た。
によりプラスミドを抽出した。該プラスミドを各種制限
酵素で切断解析した結果、図３に示した目的の構造を有
するプラスミドｐＩＧＫ２を得た。該ＤＮＡ １μｇを
用い電気パルス法によってコリネバクテリウム・アンモ
ニアゲネスＡＴＣＣ６８７２株を形質転換し、スペクチ
ノマイシン１００μｇ／ｍｌを含むＡ寒天培地に塗布し
た。
【０１１３】スペクチノマイシンに耐性となった形質転
換体からアルカリ溶菌法によりプラスミドＤＮＡを抽出
し、ｐＩＧＫ２を有することを確認した。ｐＩＧＫ２を
有するコリネバクテリウム・アンモニアゲネスＡＴＣＣ
６８７２／ｐＩＧＫ２はブダペスト条約に基づいて、平
成１１年２月５日付けで工業技術院生命工学技術研究
所、日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号（郵便番号
３０５−００４６）にＦＥＲＭ ＢＰ−６６３８号とし
て寄託されている。
換体からアルカリ溶菌法によりプラスミドＤＮＡを抽出
し、ｐＩＧＫ２を有することを確認した。ｐＩＧＫ２を
有するコリネバクテリウム・アンモニアゲネスＡＴＣＣ
６８７２／ｐＩＧＫ２はブダペスト条約に基づいて、平
成１１年２月５日付けで工業技術院生命工学技術研究
所、日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号（郵便番号
３０５−００４６）にＦＥＲＭ ＢＰ−６６３８号とし
て寄託されている。
【０１１４】（３） ＦＥＲＭ ＢＰ−２２１７株にｐ
ＩＧＫ２を導入した株の有するイノシングアノシンキナ
ーゼ活性の測定 コリネバクテリウム・アンモニアゲネスＡＴＣＣ６８７
２／ｐＩＧＫ２（ＦＥＲＭ ＢＰ−６６３８号）からア
ルカリ溶菌法によりプラスミドｐＩＧＫ２を抽出した。
ＩＧＫ２を導入した株の有するイノシングアノシンキナ
ーゼ活性の測定 コリネバクテリウム・アンモニアゲネスＡＴＣＣ６８７
２／ｐＩＧＫ２（ＦＥＲＭ ＢＰ−６６３８号）からア
ルカリ溶菌法によりプラスミドｐＩＧＫ２を抽出した。
【０１１５】該プラスミドを用い、電気パルス法によっ
てコリネバクテリウム・アンモニアゲネスのイノシン生
産菌ＦＥＲＭ ＢＰ−２２１７（特許番号第２５７８４
９６号：アデニンのリーキー要求性およびグアニン要求
性）を形質転換した。スペクチノマイシンに耐性となっ
た形質転換体からアルカリ溶菌法によりプラスミドＤＮ
Ａを抽出した。
てコリネバクテリウム・アンモニアゲネスのイノシン生
産菌ＦＥＲＭ ＢＰ−２２１７（特許番号第２５７８４
９６号：アデニンのリーキー要求性およびグアニン要求
性）を形質転換した。スペクチノマイシンに耐性となっ
た形質転換体からアルカリ溶菌法によりプラスミドＤＮ
Ａを抽出した。
【０１１６】該プラスミドを各種制限酵素で切断解析
し、得られた形質転換株がｐＩＧＫ２を保有しているこ
とを確認した。ｐＩＧＫ２を有するイノシン生産菌ＦＥ
ＲＭ ＢＰ−２２１７株をスペクチノマイシン１００μ
ｇ／ｍｌを含むＡ培地および該培地のグルコースを酢酸
アンモニウムに代替した培地の２種類の培地で、３０
℃、２４時間培養した。
し、得られた形質転換株がｐＩＧＫ２を保有しているこ
とを確認した。ｐＩＧＫ２を有するイノシン生産菌ＦＥ
ＲＭ ＢＰ−２２１７株をスペクチノマイシン１００μ
ｇ／ｍｌを含むＡ培地および該培地のグルコースを酢酸
アンモニウムに代替した培地の２種類の培地で、３０
℃、２４時間培養した。
【０１１７】得られた培養液より、菌体を取得し、これ
ら菌体から実施例１（２）に記載の方法に準じて細胞抽
出液を調製した。これら抽出液中のイノシングアノシン
キナーゼの活性を以下の方法で測定した。予め３０℃に
保温した反応液〔１００ｍｍｏｌ／Ｌ ＨＥＰＥＳ緩衝
液（ｐＨ７．２）、１０ｍｍｏｌ／Ｌ ＭｇＳＯ4、５０
ｍｍｏｌ／Ｌ ＫＣｌ、１ｍｍｏｌ／Ｌ ＡＴＰ、１ｍｍ
ｏｌ／Ｌ イノシン〕０．１ｍｌに細胞抽出液０．０１
ｍｌを添加し、３０℃、３０分間程度反応させた。
ら菌体から実施例１（２）に記載の方法に準じて細胞抽
出液を調製した。これら抽出液中のイノシングアノシン
キナーゼの活性を以下の方法で測定した。予め３０℃に
保温した反応液〔１００ｍｍｏｌ／Ｌ ＨＥＰＥＳ緩衝
液（ｐＨ７．２）、１０ｍｍｏｌ／Ｌ ＭｇＳＯ4、５０
ｍｍｏｌ／Ｌ ＫＣｌ、１ｍｍｏｌ／Ｌ ＡＴＰ、１ｍｍ
ｏｌ／Ｌ イノシン〕０．１ｍｌに細胞抽出液０．０１
ｍｌを添加し、３０℃、３０分間程度反応させた。
【０１１８】反応の間、経時的に反応液の一部をサンプ
リングし、０．２ｍｏｌ／Ｌ ＮａＨ2ＰＯ4（Ｈ3ＰＯ4
でｐＨ２．６に調整）を用い、サンプリング液を１／２
０に希釈して反応を停止させた。該反応停止液中のイノ
シンおよびＩＭＰの生成量を、以下のＨＰＬＣ分析条件
で定量した。
リングし、０．２ｍｏｌ／Ｌ ＮａＨ2ＰＯ4（Ｈ3ＰＯ4
でｐＨ２．６に調整）を用い、サンプリング液を１／２
０に希釈して反応を停止させた。該反応停止液中のイノ
シンおよびＩＭＰの生成量を、以下のＨＰＬＣ分析条件
で定量した。
【０１１９】ＨＰＬＣ分析条件 カラム：Asahipak GS-320H（旭化成社製） 溶出液：０．２ｍｏｌ／Ｌ ＮａＨ2ＰＯ4 （ｐＨ２．
６） 流速：１ｍｌ／ｍｉｎ 検出：ＵＶ２５４ｎｍ イノシンおよびＩＭＰの蓄積量は、ＵＶ２５４ｎｍの吸
光度により測定し、吸光強度をスタンダードと比較する
ことにより定量した。１分間に１μｍｏｌのＩＭＰを生
成させる活性を１単位（Ｕ）とし、蛋白質１ｍｇ当たり
の比活性を算出した。
６） 流速：１ｍｌ／ｍｉｎ 検出：ＵＶ２５４ｎｍ イノシンおよびＩＭＰの蓄積量は、ＵＶ２５４ｎｍの吸
光度により測定し、吸光強度をスタンダードと比較する
ことにより定量した。１分間に１μｍｏｌのＩＭＰを生
成させる活性を１単位（Ｕ）とし、蛋白質１ｍｇ当たり
の比活性を算出した。
【０１２０】蛋白量は、プロテイン・アッセイキット
（バイオラッド社製）を用いて定量した。結果を第３表
に示した。グルコースを炭素源として培養した菌体で
は、極めて低レベルの活性しか検出されなかったのに対
し、２％ 酢酸アンモニウムを炭素源として培養した菌
体では高レベルの活性が検出された。本結果は、ｐＩＧ
Ｋ２を有するＦＥＲＭ ＢＰ−２２１７株において、イ
ノシングアノシンキナーゼ遺伝子の発現がイソシトレー
トリアーゼ遺伝子のプロモーター支配下にあり、該酵素
活性を炭素源によって制御できることを示している。
（バイオラッド社製）を用いて定量した。結果を第３表
に示した。グルコースを炭素源として培養した菌体で
は、極めて低レベルの活性しか検出されなかったのに対
し、２％ 酢酸アンモニウムを炭素源として培養した菌
体では高レベルの活性が検出された。本結果は、ｐＩＧ
Ｋ２を有するＦＥＲＭ ＢＰ−２２１７株において、イ
ノシングアノシンキナーゼ遺伝子の発現がイソシトレー
トリアーゼ遺伝子のプロモーター支配下にあり、該酵素
活性を炭素源によって制御できることを示している。
【０１２１】
【表３】
【０１２２】（４） ｐＩＧＫ２を有するイノシン生産
菌ＦＥＲＭ ＢＰ−２２１７株によるＩＭＰの生産 ｐＩＧＫ２を有するＦＥＲＭ ＢＰ−２２１７株をスト
レプトマイシンを２０μｇ／ｍｌ含有するＡ寒天培地上
で３０℃、２日間培養した。
菌ＦＥＲＭ ＢＰ−２２１７株によるＩＭＰの生産 ｐＩＧＫ２を有するＦＥＲＭ ＢＰ−２２１７株をスト
レプトマイシンを２０μｇ／ｍｌ含有するＡ寒天培地上
で３０℃、２日間培養した。
【０１２３】培養後、得られた菌体を、６０ｍｌのスト
レプトマイシンを２０μｇ／ｍｌ含有するＣＩシード培
地〔グルコース ５％、酵母エキス １％、ペプトン １
％、ＮａＣｌ ０．２５％、尿素 ０．２５％、アデニン
３００ｍｇ／Ｌ、グアニン１００ｍｇ／Ｌ（ｐＨ７．
２）〕を添加した２５０ｍｌ容三角フラスコに植菌し、
３０℃、２４時間浸とう培養した。
レプトマイシンを２０μｇ／ｍｌ含有するＣＩシード培
地〔グルコース ５％、酵母エキス １％、ペプトン １
％、ＮａＣｌ ０．２５％、尿素 ０．２５％、アデニン
３００ｍｇ／Ｌ、グアニン１００ｍｇ／Ｌ（ｐＨ７．
２）〕を添加した２５０ｍｌ容三角フラスコに植菌し、
３０℃、２４時間浸とう培養した。
【０１２４】得られた培養液全量を、０．９４ＬのＤＩ
シード培地〔グルコース ７％、肉エキス １％、ペプト
ン １％、ＫＨ2ＰＯ4 ０．１％、Ｋ2ＨＰＯ4 ０．１
％、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．１％、アデニン ３００ｍ
ｇ／Ｌ、グアニン ３００ｍｇ／Ｌ、ＦｅＳＯ4・７Ｈ2
Ｏ １０ｍｇ／Ｌ、ＺｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ １０ｍｇ／Ｌ、
ＭｎＳＯ4・４〜６Ｈ2Ｏ １０ｍｇ／Ｌ、β−アラニン
１６ｍｇ／Ｌ、Ｌ−システイン ２０ｍｇ／Ｌ、ビオチ
ン ３０μｇ／Ｌ、ＣｕＳＯ4・５Ｈ2Ｏ ２ｍｇ／Ｌ、チ
アミン ６ｍｇ／Ｌ（ｐＨ７．２）〕を添加した２Ｌ容
発酵槽に植菌し、５．５ｍｏｌ／Ｌアンモニア水でｐＨ
を７．２に保ちつつ、３０℃、攪拌６００ｒｐｍ、通気
１Ｌ／ｍｉｎの条件で２４時間培養した。
シード培地〔グルコース ７％、肉エキス １％、ペプト
ン １％、ＫＨ2ＰＯ4 ０．１％、Ｋ2ＨＰＯ4 ０．１
％、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．１％、アデニン ３００ｍ
ｇ／Ｌ、グアニン ３００ｍｇ／Ｌ、ＦｅＳＯ4・７Ｈ2
Ｏ １０ｍｇ／Ｌ、ＺｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ １０ｍｇ／Ｌ、
ＭｎＳＯ4・４〜６Ｈ2Ｏ １０ｍｇ／Ｌ、β−アラニン
１６ｍｇ／Ｌ、Ｌ−システイン ２０ｍｇ／Ｌ、ビオチ
ン ３０μｇ／Ｌ、ＣｕＳＯ4・５Ｈ2Ｏ ２ｍｇ／Ｌ、チ
アミン ６ｍｇ／Ｌ（ｐＨ７．２）〕を添加した２Ｌ容
発酵槽に植菌し、５．５ｍｏｌ／Ｌアンモニア水でｐＨ
を７．２に保ちつつ、３０℃、攪拌６００ｒｐｍ、通気
１Ｌ／ｍｉｎの条件で２４時間培養した。
【０１２５】得られた培養液１２０ｍｌを、０．８８Ｌ
のＦＩ発酵培地〔グルコース ８％、ＣＳＬ ２．０７
％、ＫＨ2ＰＯ4 ０．２１％、Ｋ2ＨＰＯ4 ０．２１％、
ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．４３％、ＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ
１０５ｍｇ／Ｌ、ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ １０．４ｍｇ／
Ｌ、ＭｎＳＯ4・４〜６Ｈ2Ｏ ２０．７ｍｇ／Ｌ、Ｚｎ
ＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ５．２ｍｇ／Ｌ、パントテン酸カルシ
ウム １０．４ｍｇ／Ｌ、Ｌ−システイン ２０．７ｍｇ
／Ｌ、ニコチン酸 ５．２ｍｇ／Ｌ、ビオチン９３．８
μｇ／Ｌ、ＣｕＳＯ4・５Ｈ2Ｏ ０．５１ｍｇ／Ｌ、ア
デニン３１３ｍｇ／Ｌ（ｐＨ７．２）〕を添加した２Ｌ
容発酵槽に植菌し、５．５Ｍ アンモニア水でｐＨ７．
２に保ちつつ、２８℃、攪拌６００ｒｐｍ、通気１Ｌ／
ｍｉｎの条件で４４時間培養した。
のＦＩ発酵培地〔グルコース ８％、ＣＳＬ ２．０７
％、ＫＨ2ＰＯ4 ０．２１％、Ｋ2ＨＰＯ4 ０．２１％、
ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．４３％、ＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ
１０５ｍｇ／Ｌ、ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ １０．４ｍｇ／
Ｌ、ＭｎＳＯ4・４〜６Ｈ2Ｏ ２０．７ｍｇ／Ｌ、Ｚｎ
ＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ５．２ｍｇ／Ｌ、パントテン酸カルシ
ウム １０．４ｍｇ／Ｌ、Ｌ−システイン ２０．７ｍｇ
／Ｌ、ニコチン酸 ５．２ｍｇ／Ｌ、ビオチン９３．８
μｇ／Ｌ、ＣｕＳＯ4・５Ｈ2Ｏ ０．５１ｍｇ／Ｌ、ア
デニン３１３ｍｇ／Ｌ（ｐＨ７．２）〕を添加した２Ｌ
容発酵槽に植菌し、５．５Ｍ アンモニア水でｐＨ７．
２に保ちつつ、２８℃、攪拌６００ｒｐｍ、通気１Ｌ／
ｍｉｎの条件で４４時間培養した。
【０１２６】培養終了後、該培養上清中のイノシンおよ
びＩＭＰの生成蓄積量を実施例３（３）に記載の方法に
準じて定量した。培養上清中のイノシンの生成蓄積量
は、２３．１ｇ／Ｌであり、ＩＭＰは検出されなかっ
た。
びＩＭＰの生成蓄積量を実施例３（３）に記載の方法に
準じて定量した。培養上清中のイノシンの生成蓄積量
は、２３．１ｇ／Ｌであり、ＩＭＰは検出されなかっ
た。
【０１２７】培養終了後、イノシングアノシンキナーゼ
遺伝子を誘導発現させるために、酢酸アンモニウムを最
終濃度が２％になるように添加し、５．５ｍｏｌ／Ｌア
ンモニア水でｐＨ７．２に保ちつつ、攪拌６００ｒｐ
ｍ、通気１Ｌ／ｍｉｎの条件で１０時間培養を継続し
た。
遺伝子を誘導発現させるために、酢酸アンモニウムを最
終濃度が２％になるように添加し、５．５ｍｏｌ／Ｌア
ンモニア水でｐＨ７．２に保ちつつ、攪拌６００ｒｐ
ｍ、通気１Ｌ／ｍｉｎの条件で１０時間培養を継続し
た。
【０１２８】得られた培養液に、グルコース ２．５
％、フィチン酸 １０ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ 4・７Ｈ2Ｏ ４．
４ｇ／Ｌ、Ｎａ2ＨＰＯ4 ９．３６ｇ／Ｌ、アデニン ９
６．９ｍｇ／Ｌ、ナイミーンＳ−２１５ １０ｇ／Ｌを
添加した後、５．５ｍｏｌ／Ｌアンモニア水でｐＨを
７．４に保ちつつ、４０℃、攪拌６００ｒｐｍ、通気１
Ｌ／ｍｉｎの条件で２４時間反応を行った。
％、フィチン酸 １０ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ 4・７Ｈ2Ｏ ４．
４ｇ／Ｌ、Ｎａ2ＨＰＯ4 ９．３６ｇ／Ｌ、アデニン ９
６．９ｍｇ／Ｌ、ナイミーンＳ−２１５ １０ｇ／Ｌを
添加した後、５．５ｍｏｌ／Ｌアンモニア水でｐＨを
７．４に保ちつつ、４０℃、攪拌６００ｒｐｍ、通気１
Ｌ／ｍｉｎの条件で２４時間反応を行った。
【０１２９】反応後、反応上清中のＩＭＰの蓄積量を実
施例３（３）に記載の方法に準じて定量した。３７．７
ｇ／ＬのＩＭＰが反応液中に生成蓄積されていた。
施例３（３）に記載の方法に準じて定量した。３７．７
ｇ／ＬのＩＭＰが反応液中に生成蓄積されていた。
【０１３０】
【発明の効果】本発明により、調味料として大きな需要
のあるプリンヌクレオチドを同一発酵槽内で効率よく製
造するための製造法および該製造法に用いることのでき
る微生物を提供することができる。
のあるプリンヌクレオチドを同一発酵槽内で効率よく製
造するための製造法および該製造法に用いることのでき
る微生物を提供することができる。
【０１３１】
配列番号１：合成ＤＮＡ 配列番号２：合成ＤＮＡ 配列番号３：合成ＤＮＡ 配列番号４：合成ＤＮＡ
【０１３２】
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> KYOWA HAKKO KOGYO CO., LTD. <120> A METHOD OF PRODUCING PRINNUCLEOTIDE <130> H12-0062A4 <140> <141> <150> JP99/029738 <151> 1999-02-08 <160> 4 <170> PatentIn Ver. 2.0
【０１３３】 <210> 1 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 1 ccgcggctta aggaagttac ctgtgtgact caacctgcaa caactcc 47
【０１３４】 <210> 2 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 2 aaaggatcct agaagtttta ctcccactcg atggttcccg 40
【０１３５】 <210> 3 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 3 ccgcggctta aggaagtgac tttgatgaaa tttcccggta aacgtaa 47
【０１３６】 <210> 4 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 4 aaaggatcca cgataactta acgatcccag taagactctt 40
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、プラスミドｐＬＡＣ８５７の構造を
示す図である。
示す図である。
【図２】 図２は、プラスミドｐＧＵＡ２の構造を示す
図である。
図である。
【図３】 図３は、プラスミドｐＩＧＫ２の構造を示す
図である。
図である。
ＰL：ＰLプロモーター guaA：エシェリヒア・コリ由来のＸＭＰアミナーゼ遺伝
子 C.glt ORI：コリネバクテリウム・グルタミカム複製起
点 Spcr：スペクチノマイシン耐性遺伝子 cl857：温度感受性リプレッサー遺伝子 ＰICL：コリネバクテリウム・グルタミカム由来のイソ
シトレートリアーゼ遺伝子発現制御領域 ＴICL：コリネバクテリウム・グルタミカム由来のイソ
シトレートリアーゼ遺伝子ターミネーター igk：エシェリヒア・コリ由来のイノシングアノシンキ
ナーゼ遺伝子 Kmr：カナマイシン耐性遺伝子 Apr：アンピシリン耐性遺伝子 E.coli ORI：エシェリヒア・コリ複製起点
子 C.glt ORI：コリネバクテリウム・グルタミカム複製起
点 Spcr：スペクチノマイシン耐性遺伝子 cl857：温度感受性リプレッサー遺伝子 ＰICL：コリネバクテリウム・グルタミカム由来のイソ
シトレートリアーゼ遺伝子発現制御領域 ＴICL：コリネバクテリウム・グルタミカム由来のイソ
シトレートリアーゼ遺伝子ターミネーター igk：エシェリヒア・コリ由来のイノシングアノシンキ
ナーゼ遺伝子 Kmr：カナマイシン耐性遺伝子 Apr：アンピシリン耐性遺伝子 E.coli ORI：エシェリヒア・コリ複製起点
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） (Ｃ１２Ｐ 19/32 Ｃ１２Ｒ 1:15）
Claims (19)
- 【請求項１】 プリンヌクレオチドの前駆物質を生産す
る能力を有し、かつ該前駆物質よりプリンヌクレオチド
を合成可能な酵素を誘導発現することのできるＤＮＡを
導入した微生物を培地に培養し、該培養物中にプリンヌ
クレオチドの前駆物質を生成蓄積させた後、該前駆物質
よりプリンヌクレオチドを合成することのできる酵素を
誘導発現させ、該培養物中に該前駆物質よりプリンヌク
レオチドを生成蓄積させ、該培養物中より該プリンヌク
レオチドを採取することを特徴とする、プリンヌクレオ
チドの製造法。 - 【請求項２】 プリンヌクレオチドの前駆物質が５'−
キサンチル酸、該前駆物質よりプリンヌクレオチドを合
成することのできる酵素が５'−キサンチル酸アミナー
ゼ、プリンヌクレオチドが５'−グアニル酸である、請
求項１記載の製造法。 - 【請求項３】 プリンヌクレオチドの前駆物質がグアノ
シン、該前駆物質よりプリンヌクレオチドを合成するこ
とのできる酵素がイノシングアノシンキナーゼまたはホ
スファターゼ、プリンヌクレオチドが５'−グアニル酸
である、請求項１記載の製造法。 - 【請求項４】 プリンヌクレオチドの前駆物質がイノシ
ン、該前駆物質よりプリンヌクレオチドを合成すること
のできる酵素がイノシングアノシンキナーゼまたはホス
ファターゼ、プリンヌクレオチドが５'−イノシン酸で
ある、請求項１記載の製造法。 - 【請求項５】 微生物が、コリネバクテリウム属、エシ
ェリヒア属、バチルス属からなる属より選ばれる微生物
である、請求項１記載の製造法。 - 【請求項６】 微生物が、コリネバクテリウム・アンモ
ニアゲネスである、請求項１記載の製造法。 - 【請求項７】 プリンヌクレオチドを合成可能な酵素
が、高温、高ｐＨおよび高浸透圧から選ばれる条件に、
または糖質系の炭素源から非糖質系の炭素源に切り替え
ることにより誘導発現されることを特徴とする、請求項
１記載の製造法。 - 【請求項８】 非糖質系の炭素源が、酢酸または酢酸塩
である、請求項７記載の製造法。 - 【請求項９】 プリンヌクレオチド前駆物質よりプリン
ヌクレオチドを合成可能な酵素を誘導発現することので
きるＤＮＡ。 - 【請求項１０】 高温、高ｐＨおよび高浸透圧から選ば
れる条件に、または糖質系の炭素源から非糖質系の炭素
源に切り替えることにより、プリンヌクレオチドを合成
可能な酵素を誘導発現することのできる、請求項９記載
のＤＮＡ。 - 【請求項１１】 非糖質系の炭素源が、酢酸または酢酸
塩である、請求項１０記載のＤＮＡ。 - 【請求項１２】 ＤＮＡが、ｐＬＡＣ８５７またはｐＩ
ＧＫ２である、請求項９または１０記載のＤＮＡ。 - 【請求項１３】 プリンヌクレオチドの前駆物質を生産
する能力を有し、かつ該前駆物質よりプリンヌクレオチ
ドを合成可能な酵素を誘導発現することのできるＤＮＡ
を導入した微生物。 - 【請求項１４】 プリンヌクレオチドの前駆物質が５'
−キサンチル酸、該前駆物質よりプリンヌクレオチドを
合成することのできる酵素が５'−キサンチル酸アミナ
ーゼ、プリンヌクレオチドが５'−グアニル酸である、
請求項１３記載の微生物。 - 【請求項１５】 プリンヌクレオチドの前駆物質がグア
ノシン、該前駆物質よりプリンヌクレオチドを合成する
ことのできる酵素がイノシングアノシンキナーゼまたは
ホスファターゼ、プリンヌクレオチドが５'−グアニル
酸である、請求項１３記載の微生物。 - 【請求項１６】 プリンヌクレオチドの前駆物質がイノ
シン、該前駆物質よりプリンヌクレオチドを合成するこ
とのできる酵素がイノシングアノシンキナーゼまたはホ
スファターゼ、プリンヌクレオチドが５'−イノシン酸
である、請求項１３記載の微生物。 - 【請求項１７】 微生物が、コリネバクテリウム属、エ
シェリヒア属、バチルス属からなる属より選ばれる微生
物である、請求項１３記載の微生物。 - 【請求項１８】 微生物が、コリネバクテリウム・アン
モニアゲネスである、請求項１３記載の微生物。 - 【請求項１９】微生物が、コリネバクテリウム・アンモ
ニアゲネスＡＴＣＣ６８７２／ｐＬＡＣ８５７（ＦＥＲ
Ｍ ＢＰ−６６３９）またはコリネバクテリウム・アン
モニアゲネスＡＴＣＣ６８７２／ｐＩＧＫ２（ＦＥＲＭ
ＢＰ６６３８）である、請求項１８記載の微生物。
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|---|---|---|---|
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| JP2000295996A true JP2000295996A (ja) | 2000-10-24 |
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