KR101669474B1 - 5'-구아닐산의 생산방법 - Google Patents

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Abstract

5'-구아닐산(GMP)은, 미생물을 크산틸산(XMP)과 반응시켜 GMP를 생산하고 GMP를 회수함으로써 효율적으로 생산되며, 상기 미생물은 크산틸산을 5'-구아닐산으로 전환시키는 능력을 가지며, nagD 유전자가 정상적으로 기능하지 않고 5'-구아닐산 신테타제 활성이 증강되도록 변형된다.

Description

5'-구아닐산의 생산방법{Method for producing 5'-guanylic acid}
본 발명은 5'-구아닐산의 생산방법 및 이의 생산에 사용되는 신규한 미생물에 관한 것이다. 5'-구아닐산은 식품 시즈닝, 약제 및 이들의 원료로서 유용하다.
5'-구아닐산(구아노신-5'-모노포스페이트; 이하, "GMP"로도 언급됨)의 산업적 생산방법의 공지된 예로는 구아노신을 발효에 의해 생산하고 수득된 구아노신을 효소적으로 인산화하여 5'-구아닐산을 수득하는 방법이 포함된다(특허 문헌 1 내지 4)
또한, GMP 신테타제 활성을 증가시킨 에세리키아(Escherichia) 세균과 글루코스 대사 및 5'-크산틸산(XMP)으로부터 GMP의 합성에 필요한 아데노신 트리포스페이트(ATP)의 생합성(이하, "ATP 재생"으로도 언급됨) 능력을 증강시킨 브레비박테리움 암모니아게네스(Brevibacterium ammoniagenes)를, XMP 및 암모니아 또는 글루타민을 함유하는 배지에서 배양하고 XMP를 GMP로 고효율로 전환시켜 GMP를 배지에 생산하여 축적시키는 방법도 공지되어 있다(비특허 문헌 1).
발효에 의한 GMP의 생산방법도 또한 제안되었다. 예를 들어, 특허 문헌 5에서, 데코이이닌 또는 메티오닌 설폭사이드에 대한 내성을 나타내는 아데닌 영양요구성을 갖고 GMP 생산 능력을 갖는 바실러스(Bacillus) 속의 돌연변이 균주를 배양하고 배지에 생산되어 축적된 GMP를 회수하는 GMP의 생산방법이 개시되어 있다. 추가로, 특허 문헌 6에는 이노신산(이노신산-5'-모노포스페이트; 이하, "IMP"로도 언급됨)을 생산하는 능력을 갖는 에세리키아 세균에서 2종의 5'-뉴클레오티다제 유전자를 결실시키고 IMP 데하이드로게나제 및 GMP 신테타제 유전자를 증폭시킴으로써 생산된 균주를 배양하고, 배지에 생산되어 축적된 GMP를 회수하는 GMP의 생산방법이 개시되어 있다. 그러나, 일반적으로, GMP의 수율은 직접 발효에서 충분하지 않으므로, 이러한 방법은 상기 효소 방법과 비교하여 사실상 충분하지 않다.
상기 언급된 바와 같이, 5'-구아닐산의 생산을 위한 각종 연구가 수행되었고, 몇 가지 성공적인 예가 공지되어 있다. 그러나, 뉴클레오티다제는 완전히 이해되지 않는다. 수개의 뉴클레오티다제가 발견되었고, 이의 결실이 수율을 증가시킬 수 있음은 공지되어 있으나(특허 문헌 6 및 7), 생성물의 분해를 완전히 억제하는 것은 곤란하며, 이는 주로 문제가 된다.
[선행 기술 문헌]
특허 문헌
[특허 문헌 1] 일본 공개특허공보 제07-231793호
[특허 문헌 2] 일본 공개특허공보 제10-201481호
[특허 문헌 3] 국제 공개공보 제WO 96/37603호
[특허 문헌 4] 일본 공개특허공보 제2001-245676호
[특허 문헌 5] 일본 특허공보 제56-12438호
[특허 문헌 6] 일본 공개특허공보 제2002-355087호
[특허 문헌 7] 국제 공개공보 제WO 2006/078132호
[비특허 문헌 1] [Tatsuro Fujio, et al., Biosci. Biotech. Biochem., 1997, 61(5), pp. 840-845]
본 발명의 목적은 XMP로부터 GMP의 생산방법에 사용할 수 있고 XMP를 GMP로 고효율로 전환시킬 수 있는 신규한 미생물을 생산하는 것에 관한 것이다.
본 발명자들은 상기 목적을 해결하기 위해 집중적으로 연구한 결과, nagD 유전자가 정상적으로 기능하지 않고 GMP 신테타제 활성이 증가되고 XMP가 GMP로 고효율로 전환되도록 변형된 에세리키아 속의 미생물을 사용함으로써 본 발명이 완성됨을 발견하였다.
본 발명의 한 양태는 미생물을 크산틸산과 반응시켜 5'-구아닐산을 생산하고 5'-구아닐산을 회수함을 포함하는, 5'-구아닐산의 생산방법을 제공하는 것으로, 상기 미생물은 크산틸산을 5'-구아닐산으로 전환시키는 능력을 가지며, nagD 유전자가 정상적으로 기능하지 않고 5'-구아닐산 신테타제 활성이 증강되도록 변형된다.
본 발명의 또 다른 양태는 상기 5'-구아닐산 신테타제 활성이 상기 미생물에서 guaA 유전자의 발현을 증가시킴으로써 증강되는 상기 생산방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 양태는 상기 guaA 유전자가, (A) 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 단백질; 및 (B) 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하지만 하나 또는 수개의 아미노산의 치환, 결실, 삽입 또는 부가를 포함하고 5'-구아닐산 신테타제 활성을 갖는 단백질로 이루어진 그룹으로부터 선택된 단백질을 암호화하는 상기 생산방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 양태는 상기 미생물이, ushA 유전자 및/또는 aphA 유전자가 정상적으로 기능하지 않도록 추가로 변형된 상기 생산방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 양태는 상기 미생물이 장내세균(Enterobacteriaceae) 과에 속하는 세균, 바실러스 세균 및 코리네형(coryneform) 세균으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 상기 생산방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 양태는 상기 미생물이 에세리키아 속에 속하는 상기 생산방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 양태는 상기 미생물이 에세리키아 콜라이(Escherichia coli)인 상기 생산방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 양태는 크산틸산을 5'-구아닐산으로 전환시키는 능력을 갖는 미생물을 제공하는 것으로, 여기서, 상기 미생물은, 5'-구아닐산 신테타제 활성이 guaA 유전자의 발현을 증가시킴으로써 증강되고 nagD 유전자가 정상적으로 기능하지 않도록 변형된 미생물이고, 증가된 guaB 유전자 발현을 갖지 않는 미생물이다.
본 발명의 또 다른 양태는 ushA 유전자 및 aphA 유전자로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 유전자가 정상적으로 기능하지 않도록 추가로 변형된 상기 미생물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 양태는 장내세균 과에 속하는 세균, 바실러스 세균 및 코리네형 세균으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 상기 미생물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 양태는 에세리키아 속에 속하는 상기 미생물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 양태는 에세리키아 콜라이인 상기 미생물을 제공하는 것이다.
도 1a는 JM109/pSTV29-Ptac-guaA 균주를 XMP와 반응시킴에 따른 XMP와 GMP의 농도 변화를 도시한 그래프이다.
도 1b는 JM109ΔnagD/pSTV29-Ptac-guaA 균주를 XMP와 반응시킴에 따른 XMP와 GMP의 농도 변화를 도시한 그래프이다.
도 2a는 JM109ΔushA/pSTV29-Ptac-guaA 균주를 XMP와 반응시킴에 따른 XMP와 GMP의 농도 변화를 도시한 그래프이다.
도 2b는 JM109ΔushAΔnagD/pSTV29-Ptac-guaA 균주를 XMP와 반응시킴에 따른 XMP와 GMP의 농도 변화를 도시한 그래프이다.
도 3a는 JM109ΔushAΔaphA/pSTV29-Ptac-guaA 균주를 XMP와 반응시킴에 따른 XMP와 GMP의 농도 변화를 도시한 그래프이다.
도 3b는 JM109ΔushAΔaphAΔnagD/pSTV29-Ptac-guaA 균주를 XMP와 반응시킴에 따른 XMP와 GMP의 농도 변화를 도시한 그래프이다.
지금부터, 본 발명을 상세하게 기재한다.
<I> 본 발명의 방법에 사용된 미생물
본 발명의 방법에 사용된 미생물은 nagD 유전자가 정상적으로 기능하지 않고 GMP 신테타제 활성이 증가되도록 변형되며, XMP를 GMP로 전환시키는 능력을 갖는다.
이러한 미생물의 예로는 장내세균 과에 속하는 세균, 코리네형 세균 및 바실러스 속에 속하는 세균이 포함된다.
장내세균 과에 속하는 세균의 예로는 에세리키아 속에 속하는 세균, 판토에아(Pantoea) 속에 속하는 세균, 엔테로박터(Enterobacter) 속에 속하는 세균, 클렙시엘라(Klebsiella) 속에 속하는 세균, 세라티아(Serratia) 속에 속하는 세균, 에르위니아(Erwinia) 속에 속하는 세균, 살모넬라(Salmonella) 속에 속하는 세균 및 모가넬라(Morganella) 속에 속하는 세균이 포함된다. 에세리키아 속에 속하는 세균은 에세리키아 속에 속하는 한 제한되지 않으며, 사용될 수 있는 이의 특정 예로는 나이드하르트 등(Neidhardt et al.)의 문헌[참조: Neidhardt, FR. C. et al., Escherichia coli and Salmonella typhimurium, American Society for Microbiology, Washington D. C., 1208, table 1]에 기재된 세균, 예를 들어, 에세리키아 콜라이가 포함된다. 엔테로박터 속에 속하는 세균의 예로는 엔테로박터 아글로머란스(Enterobacter agglomerans) 및 엔테로박터 에어로게네스(Enterobacter aerogenes)가 포함되며, 판토에아 속에 속하는 세균의 예로는 판토에아 아나나티스(Pantoea ananatis)가 포함된다.
코리네형 세균의 예로는 미생물학 분야의 숙련가에게 공지된 분류법에 따라 코리네형 세균으로 분류되는 세균, 브레비박테리움 속으로 분류되지만 코리네박테리움(Corynebacterium) 속으로 재분류되는 세균, 및 코리네박테리움 속과 관련된 브레비박테리움 속에 속하는 세균이 포함된다. 다음은 이러한 코리네형 세균의 예이다.
코리네박테리움 아세토에시도필룸(Corynebacterium acetoacidophilum)
코리네박테리움 아세토글루타미쿰(Corynebacterium acetoglutamicum)
코리네박테리움 알카놀리티쿰(Corynebacterium alkanolyticum)
코리네박테리움 칼루나에(Corynebacterium callunae)
코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)
코리네박테리움 릴륨(Corynebacterium lilium)
코리네박테리움 멜라세콜라(Corynebacterium melassecola)
코리네박테리움 써모아미노게네스(Corynebacterium thermoaminogenes)
코리네박테리움 헤르쿨리스(Corynebacterium herculis)
브레비박테리움 디바리카툼(Brevibacterium divaricatum)
브레비박테리움 플라붐(Brevibacterium flavum)
브레비박테리움 임마리오필룸(Brevibacterium immariophilum)
브레비박테리움 락토페르멘툼(Brevibacterium lactofermentum)
브레비박테리움 로세움(Brevibacterium roseum)
브레비박테리움 사카롤리티쿰(Brevibacterium saccharolyticum)
브레비박테리움 티오게니탈리스(Brevibacterium thiogenitalis)
코리네박테리움 암모니아게네스(Corynebacterium ammoniagenes)
브레비박테리움 알붐(Brevibacterium album)
브레비박테리움 세리눔(Brevibacterium cerinum)
마이크로박테리움 암모니아필룸(Microbacterium ammoniaphilum)
바실러스 속에 속하는 세균으로서, 미생물학 분야의 숙련가에게 공지된 분류법에 따라 바실러스 속으로 분류되는 세균이 사용될 수 있으며, 이의 특정 예로는 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 및 바실러스 아밀로리쿠에파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens)가 포함되나 이에 한정되지는 않는다.
이하, 상기 미생물에서 GMP 신테타제 활성의 증강 방법을 지금부터 기재한다.
본 발명에서, 용어 "GMP 신테타제 활성이 증강되도록 변형된"이란 GMP 신테타제 활성이 미생물, 예를 들어, 에세리키아 속에 속하는 세균의 비변형 균주, 예를 들어, 야생형 균주의 GMP 신테타제 활성보다 큼을 의미한다.
GMP 신테타제는 다음 반응을 촉매하는 효소(EC 6.3.4.1)이며, 용어 "GMP 신테타제 활성"이란 다음 반응을 촉매하여 XMP로부터 GMP를 생산하는 활성을 의미한다.
ATP + XMP + NH3 → AMP + 피로인산 + GMP
GMP 신테타제 활성은, 예를 들어, 스펙터(Spector)에 의한 방법[문헌 참조: Spector, T., Methods Enzymol., 1978, 51, p. 219]에 의해 NADH의 환원 속도를 조사함으로써 측정할 수 있다.
GMP 신테타제 활성을 증강시키기 위해, 이러한 효소를 암호화하는 guaA 유전자의 발현 수준을 증가시키는 것이 바람직하다. 이러한 발현 수준을 증가시키는 방법의 예는 미생물의 세포에서 GMP 신테타제를 암호화하는 DNA의 카피수를 증가시킴을 포함한다. 세포에서 카피수의 증가는 GMP 신테타제를 암호화하는 DNA 단편을 미생물, 예를 들어, 에세리키아 속에 속하는 세균에서 기능하는 벡터에 결합시켜 재조합 DNA를 제조한 후 이러한 DNA를 숙주에 도입하여 형질전환시킴으로써 달성될 수 있다. 형질전환체의 세포에서 GMP 신테타제를 암호화하는 유전자(guaA 유전자)의 카피수 증가의 결과로서, GMP 신테타제 활성은 증가한다.
세포에서 카피수의 증가는 또한 다수의 GMP 신테타제 유전자를 상기 숙주의 염색체 DNA에 존재하도록 함으로써 달성될 수도 있다. 에세리키아 세균과 같은 세균의 염색체 DNA 상에 높은 카피수로 GMP 신테타제 유전자를 도입하는 것은 염색체 상에 높은 카피수로 존재하는 서열을 표적으로서 사용하는 상동 재조합에 의해 수행될 수 있다. 염색체 DNA 상에 높은 카피수로 존재하는 서열의 예로는 반복 DNA 및 전위 요소의 말단에 존재하는 역반복이 포함된다. 또는, 일본 공개특허공보 제2-109985호에 개시된 바와 같이, 목적하는 유전자를 트랜스포존 상에 배치하고 당해 트랜스포존이 전위할 수 있게 하여 염색체 DNA 상에 높은 카피수의 유전자를 도입할 수도 있다. 임의의 상기 방법에 의해, 형질전환체에서 GMP 신테타제 유전자의 카피수가 증가하고, 결과로서 GMP 신테타제 활성이 증가한다.
상기 유전자의 도입을 위한 벡터의 예로는 플라스미드 벡터, 예를 들어, pSTV29, pMW218 및 pUC19; 및 파지 벡터, 예를 들어, λ1059, λBF101 및 M13mp9가 포함된다. 트랜스포존, 예를 들어, Mu, Tn10 및 Tn5도 또한 사용될 수 있다.
GMP 신테타제를 암호화하는 DNA의 뉴클레오타이드 서열이 공지되어 있기 때문에, DNA는 상기 서열에 기초한 프라이머를 합성하고, 미생물, 예를 들어, 에세리키아 속에 속하는 세균의 염색체 DNA를 주형으로 사용하여 PCR에 의해 당해 프라이머를 증폭시킴으로써 수득할 수 있다. 에세리키아 콜라이의 guaA 유전자의 예로는 서열번호 1의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것이 포함된다. 이러한 유전자의 뉴클레오타이드 서열에 기초한 프로브를 제조하고 하이브리드화함으로써, 목적하는 DNA 단편을 에세리키아 속에 속하는 세균의 염색체 DNA 라이브러리로부터 선택할 수 있다. 또는, GMP 신테타제를 암호화하는 DNA 단편은 공지된 뉴클레오타이드 서열에 기초하여 화학적으로 합성할 수 있다. 예를 들어, 에세리키아 콜라이의 guaA 유전자는 서열번호 9 및 10의 서열을 갖는 프라이머를 사용하여 클로닝할 수 있다.
추가로, 에세리키아 속에 속하는 세균 이외의 미생물로부터, GMP 신테타제와 동일한 기능을 갖는 단백질을 암호화하는 유전자는 상기 뉴클레오타이드 서열에 기초하여 수득할 수 있다.
바실러스 서브틸리스의 GMP 신테타제 유전자(guaA)의 예로는 서열번호 3의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것이 포함된다. 이러한 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된 아미노산 서열은 서열번호 4에 나타나 있다. 코리네박테리움 글루타미쿰의 GMP 신테타제 유전자(guaA)의 예로는 서열번호 5의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것이 포함된다. 이러한 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된 아미노산 서열은 서열번호 6에 나타나 있다.
코리네박테리움 암모니아게네스의 GMP 신테타제 유전자(guaA)의 예로는 서열번호 7의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것이 포함된다. 이러한 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된 아미노산 서열은 서열번호 8에 나타나 있다.
상기 기재된 바와 같이, guaA 유전자의 뉴클레오타이드 서열은 미생물이 속하는 속, 종 및/또는 균주에 따라 상이할 수 있기 때문에, guaA 유전자는 상기 유전자의 변이체일 수 있다.
guaA 유전자에 의해 암호화된 단백질은 GMP 신테타제 활성을 갖는 한 서열번호 2, 4, 6 또는 8의 전체 아미노산 서열과 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 더욱 바람직하게는 95% 이상, 특히 바람직하게는 98% 이상의 서열 동일성을 갖는 것일 수 있다. 아미노산 서열 사이 및 뉴클레오타이드 서열 사이의 동일성은, 예를 들어, BLAST, 칼린(Karlin) 및 알철(Altschul)에 의한 알고리즘[문헌 참조: Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 5873(1993)] 또는 피어슨(Pearson)에 의한 FASTA[문헌 참조: MethodsEnzymol., 183, 63 (1990)]를 사용하여 측정할 수 있다. 알고리즘 BLAST에 기초하여, BLASTN 및 BLASTX라 불리는 프로그램이 개발되었다(참조: http://www.ncbi.nlm.nih.gov).
본 발명에 사용된 guaA 유전자는 야생형 유전자에 한정되지 않으며, 암호화된 단백질의 기능, 즉 GMP 신테타제 활성이 손상되지 않는 한 서열번호 2, 4, 6 또는 8의 아미노산 서열을 갖지만 하나 또는 수개의 아미노산의 치환, 결실, 삽입, 부가 또는 역전을 포함하는 단백질을 암호화하는 돌연변이 또는 인공 변형 유전자일 수도 있다. 본원에서 용어 "하나 또는 수개"의 의미는 단백질의 공간 구조에서 아미노산 잔기의 위치 및/또는 유형에 따라 달라지나, 특히 이러한 용어는 1 내지 20, 바람직하게는 1 내지 10, 더욱 바람직하게는 1 내지 5를 의미한다. 치환은 바람직하게는 보존적 치환이며, 용어 "보존적 치환"은 치환 부위가 방향족 아미노산을 갖는 경우에 Phe, Trp 및 Tyr 사이의 상호 치환, 치환 부위가 소수성 아미노산을 갖는 경우에 Leu, Ile 및 Val 사이의 상호 치환, 치환 부위가 극성 아미노산을 갖는 경우에 Gln과 Asn 사이의 상호 치환, 치환 부위가 염기성 아미노산을 갖는 경우에 Lys, Arg 및 His 사이의 상호 치환, 치환 부위가 산성 아미노산을 갖는 경우에 Asp와 Glu 사이의 상호 치환, 및 치환 부위가 하이드록실 그룹을 갖는 아미노산을 갖는 경우에 Ser과 Thr 사이의 상호 치환을 의미한다. 반보존적 치환의 예로는 Ser 또는 Thr에 의한 Ala의 치환, Gln, His 또는 Lys에 의한 Arg의 치환, Glu, Gln, Lys, His 또는 Asp에 의한 Asn의 치환, Asn, Glu 또는 Gln에 의한 Asp의 치환, Ser 또는 Ala에 의한 Cys의 치환, Asn, Glu, Lys, His, Asp 또는 Arg에 의한 Gln의 치환, Gly, Asn, Gln, Lys 또는 Asp에 의한 Glu의 치환, Pro에 의한 Gly의 치환, Asn, Lys, Gln, Arg 또는 Tyr에 의한 His의 치환, Leu, Met, Val 또는 Phe에 의한 Ile의 치환, Ile, Met, Val 또는 Phe에 의한 Leu의 치환, Asn, Glu, Gln, His 또는 Arg에 의한 Lys의 치환, Ile, Leu, Val 또는 Phe에 의한 Met의 치환, Trp, Tyr, Met, Ile 또는 Leu에 의한 Phe의 치환, Thr 또는 Ala에 의한 Ser의 치환, Ser 또는 Ala에 의한 Thr의 치환, Phe 또는 Tyr에 의한 Trp의 치환, His, Phe 또는 Trp에 의한 Tyr의 치환, 및 Met, Ile 또는 Leu에 의한 Val의 치환이 포함된다. 상기 아미노산의 치환, 결실, 삽입, 부가, 역전 등의 예로는 또한 자연 발생 돌연변이(돌연변이체 및 변이체)에 기인하여 발생하는 것, 예를 들어, guaA 유전자를 갖는 미생물 중에서 개체 차이 및 종 차이에 기초한 것도 포함된다.
추가로, guaA 유전자는 서열번호 1, 3, 5 또는 7의 뉴클레오타이드 서열의 상보성 서열, 또는 DNA가 GMP 신테타제 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 서열로부터 제조될 수 있는 프로브와 엄격한 조건하에 하이브리드화할 수 있는 DNA일 수 있다. 본원에서 용어 "엄격한 조건"은 소위 특이적 하이브리드가 형성되나 비특이적 하이브리드가 형성되지 않는 조건을 의미한다. 이러한 조건을 수치로 명확히 표현하기는 곤란하지만, 예를 들어, 이들은 서로 높은 동일성, 예를 들어, 서로 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 더욱 바람직하게는 95% 이상, 특히 바람직하게는 98% 이상의 동일성을 갖는 DNA가 서로 하이브리드화되지만, 서로 상기 백분율 이하의 동일성을 갖는 DNA가 서로 하이브리드화되지 않는 조건이거나, 세척이 서던(Southern) 하이브리드화를 위한 통상의 세척 조건인 60℃에서의 1×SSC 및 0.1% SDS, 바람직하게는 60℃에서의 0.1×SSC 및 0.1% SDS, 더욱 바람직하게는 68℃에서의 0.1×SSC 및 0.1% SDS와 동일한 염 농도로 1회, 더욱 바람직하게는 2 또는 3회 수행되는 조건이다.
유전자의 변이체에 대한 상기 설명은 또한 후술되는 nagD 유전자, ushA 유전자, aphA 유전자 및 기타 유전자에 유사하게 적용가능하다.
미생물에 DNA의 도입은 씨. 티. 청 등(C. T. chung et al.)의 방법[문헌 참조: C. T. chung et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 2172-2175 (1989)], 디. 엠. 모리슨(D. M. Morrison)의 방법[문헌 참조: Methods in Enzymology, 68, 326 (1979)], 수용자 세균 세포의 염화칼슘 처리에 의해 DNA에 대한 투과성을 증가시키는 방법[문헌 참조: Mandel, M. and Higa, A., J. Mol. Biol., 53, 159 (1970)] 등으로 수행할 수 있다.
상기 기재된 유전자의 증폭 이외에, GMP 신테타제 유전자의 발현 수준은 또한 염색체 DNA 상에서 또는 강력한 발현 조절 서열을 갖는 플라스미드 상에서 발현 조절 서열, 예를 들어, GMP 신테타제 유전자의 프로모터를 대체함으로써 증강될 수 있다. 예를 들어, lac 프로모터, trp 프로모터, trc 프로모터 및 tac 프로모터는 강력한 프로모터인 것으로 공지되어 있다. 추가로, 국제 공개공보 제WO 00/18935호에 개시되어 있는 바와 같이, 유전자의 프로모터 영역에 수개의 뉴클레오타이드 치환을 도입하여 프로모터를 강력한 프로모터로 변경시킬 수도 있다. 이러한 프로모터 대체 또는 변경에 의해, GMP 신테타제 유전자의 발현은 증강되고, 따라서 GMP 신테타제 활성은 증가한다.
guaA 유전자의 발현 수준 증가는 노던 블롯(Northern blotting), RT-PCR 방법 등에 의해 검지될 수 있다.
nagD 유전자가 정상적으로 기능하지 않도록 상기 기재된 미생물을 변형시키는 방법을 지금부터 기재한다.
본 발명에서, "nagD 유전자가 정상적으로 기능하지 않도록 변형된"이란 nagD 유전자에 의해 암호화된 단백질의 활성을 감소 또는 제거시키거나, 당해 유전자의 전사를 감소 또는 제거시키거나, 당해 유전자의 해독 효율을 감소시킴을 의미한다.
에세리키아 콜라이의 nagD 유전자는 N-아세틸글루코사민의 동화와 관련된 nagBACD 오페론에 존재하며, 이러한 nagBACD 오페론 유전자의 발현은 배지에 N-아세틸글루코사민(세균 세포벽의 주성분을 구성하는 당의 일종임)을 첨가하여 유도되는 것으로 공지되어 있다[문헌 참조: Plumbridge JA., Mol. Micobiol. (1989) 3. 505-515]. 에세리키아 콜라이에서 NagD에 의해 암호화된 nagD 단백질은 보존적 구조 특징에 기초한 할로애시드 데할로게나제(Haloacid Dehalogenase; HAD) 계열에 속하는 것으로 공지되어 있으며, 생체내 실험에 기초하여, GMP 및 5'-우리딜산(우리딘-5'-모노포스페이트; 이하, "UMP"로도 언급됨)에 대한 뉴클레오티다제 활성을 갖는 것으로 보고되어 있다[문헌 참조: Tremblay LW., Biochemistry, (2006) 45. 1183-1193]. 그러나, 23종의 HAD 계열 단백질이 에세리키아 콜라이의 게놈 상에 존재하고 매우 광범위한 기질 특이성을 나타내기 때문에[문헌 참조: Kuznetsova et al., J. Biol. Chem., (2006) 281., 36149-36161], 세포에서 NagD 단백질의 생리학적 역할은 공지되어 있지 않다.
정상적으로 기능하지 않도록 하는 nagD 유전자의 변형은 다음 방법에 의해 달성될 수 있다. 예를 들어, 이는 유전자 재조합을 사용하는 상동 재조합 방법[문헌 참조: Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory press (1972); Matsuyama, S. and Mizushima, S., J. Bacteriol., 162, 1196 (1985)]에 의해 염색체 상의 nagD 유전자를 정상적으로 기능하지 않는 nagD 유전자(이하, "파괴형 nagD 유전자"로도 언급됨)로 대체함으로써 수행할 수 있다.
상동 재조합에서, 염색체 상의 서열과 상동인 서열을 갖는 플라스미드 등을 세균 세포에 도입함으로써, 상동성을 갖는 서열의 위치에서의 재조합을 특정 빈도로 유발시켜, 전체 도입된 플라스미드를 염색체에 통합한다. 이것이 염색체 상에서 상동성을 갖는 서열의 위치에서 추가의 재조합 이후에 이루어지는 경우, 플라스미드를 다시 제거하지만, 이때에 재조합이 일어나는 위치에 따라, 파괴된 유전자를 염색체 상에 고정시킬 수 있고 원래 정상 유전자를 염색체로부터 플라스미드와 함께 제거할 수 있다. 이러한 균주를 선택함으로써, 염색체 상의 정상 nagD 유전자를 파괴형 nagD 유전자로 대체시킨 균주를 수득할 수 있다.
상동 재조합을 사용하는 이러한 유전자 치환 방법의 예로는 선형 DNA를 사용하는 방법, 예를 들어, "레드 구동 통합(Red-driven integration)"[문헌 참조: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, vol.97, No.12, pp. 6640-6645]이라 불리는 방법이 λ 파지로부터 유래된 절제 시스템[문헌 참조: J. Bacteriol. 2002 Sep; 184(18):5200-3]과 배합되는 방법(국제 공개공보 제WO 2005/010175호 참조) 및 온도 민감성 복제 원점을 갖는 플라스미드를 사용하는 방법[문헌 참조: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, vol.97, No.12, pp. 6640-6645; 미국 특허 제6303383호; 및 일본 공개특허공보 제05-007491호]이 포함된다.
상기 상동 재조합을 사용하는 유전자 치환에 의한 부위 지시된 돌연변이도 또한 숙주에서 복제 능력을 갖지 않는 플라스미드를 사용함으로써 수행할 수 있다. 추가로, nagD의 파괴도 또한 약물 내성 유전자와 같은 마커 유전자가 삽입되어 대상 미생물에서 복제할 수 없는 nagD 유전자를 갖는 플라스미드를 사용함으로써 수행할 수 있다. 즉, 플라스미드로 형질전환시켜 수득되고 약물 내성 표현형을 나타내는 형질전환체는 염색체 DNA에 혼입된 마커 유전자를 갖는다. 이러한 마커 유전자가 양 말단에서의 nagD 유전자 서열과 염색체 상에서의 nagD 유전자 사이의 상동 재조합에 의해 혼입될 개연성이 크기 때문에, 유전자 파괴된 균주를 효율적으로 선택할 수 있다.
특히, 유전자 파괴에 사용된 파괴형 nagD 유전자는 제한 효소 분해 및 그 다음 연결에 의한 특정 영역(들) 유전자의 결실, 기타 DNA 단편(마커 유전자 등)의 유전자로의 삽입, 부위 지시된 돌연변이[문헌 참조: Kramer, W. and Frits, H. J., Methods in Enzymology, 154, 350 (1987)] 및/또는 화학 약품, 예를 들어, 차아염소산 나트륨, 하이드록실아민 및/또는 기타에 의한 처리[문헌 참조: Shortle, D. and Nathans, D., Proc., Natl., Acad., Sci., U.S.A., 75, 270 (1978)]에 의해 암호화 영역, 프로모터 영역 및/또는 기타의 뉴클레오타이드 서열(들)에서 하나 이상의 뉴클레오타이드 치환, 결실, 삽입, 부가 및/또는 역전을 유발하여 암호화된 nagD 단백질의 활성을 감소 또는 제거하고/하거나 nagD 유전자의 전사를 감소 또는 제거함으로써 수득할 수 있다.
nagD 유전자의 서열은 공지되어 있으며, 이러한 유전자는 당해 서열에 기초하여 PCR, 하이브리드화 등에 의해 용이하게 수득할 수 있다. 에세리키아 콜라이의 nagD 유전자의 예로는 서열번호 12의 아미노산 서열을 암호화하는 것이 포함된다. nagD 유전자는, 예를 들어, 서열번호 13 및 14의 프라이머를 사용하여 PCR에 의해 에세리키아 콜라이의 염색체 DNA로부터 수득할 수 있다.
기타 미생물의 nagD 유전자도 또한 공지된 서열 또는 상기 에세리키아 콜라이의 nagD 유전자와의 서열 상동성에 기초하여 수득할 수 있으며, 미생물 변형에 사용할 수 있다.
nagD 유전자는 변형 대상 미생물의 염색체 상의 nagD 유전자와 상동 재조합을 유발하기에 충분한 서열 동일성을 가지며, 예를 들어, 이는 서열번호 12의 전체 아미노산 서열과 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 특히 바람직하게는 95% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 암호화할 수 있다.
대상 유전자의 파괴는 서던 블롯 또는 PCR에 의해 염색체 상의 상기 유전자를 분석함으로써 확인할 수 있다.
활성 NagD 단백질이 생산되지 않는 돌연변이 균주는 또한 미생물에 자외선을 조사하거나 돌연변이 처리에 일반적으로 사용되는 돌연변이제, 예를 들어, N-메틸-N'-니트로소구아니딘(NTG) 또는 아질산으로 미생물을 처리함으로써도 수득할 수 있다.
본 발명의 방법에 사용된 세균은 바람직하게는 ushA 유전자 및/또는 aphA 유전자가 정상적으로 기능하지 않도록 추가로 변형된다. 이들 유전자에 돌연변이(들)를 갖는 이러한 돌연변이 균주 또는 재조합 균주는 상기 유전자에 의해 암호화된 5'-뉴클레오티다제의 활성이 감소 또는 제거되거나 상기 유전자의 전사가 감소 또는 제거되도록 이들 유전자를 변형시킴으로써 수득할 수 있다. 이러한 돌연변이 균주 또는 재조합 균주는 nagD 유전자가 정상적으로 기능하지 않는 상기 돌연변이 균주 또는 재조합 균주에서와 동일한 방법으로 수득할 수 있다.
ushA 유전자의 서열은 공지되어 있으며, 이는 당해 서열에 기초하여 PCR, 하이브리드화 등에 의해 용이하게 수득할 수 있다. 에세리키라 콜라이의 ushA 유전자의 예로는 서열번호 16의 아미노산 서열을 암호화하는 것이 포함된다.
기타 미생물의 ushA 유전자도 또한 공지된 서열 또는 상기 에세리키아 콜라이의 ushA 유전자와의 서열 상동성에 기초하여 수득할 수 있으며, 미생물 변형에 사용할 수 있다.
ushA 유전자는 변형 대상 미생물의 염색체 상의 ushA 유전자와 상동 재조합을 유발하기에 충분한 서열 동일성을 가지며, 예를 들어, 이는 서열번호 16의 전체 아미노산 서열과 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 특히 바람직하게는 95% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 암호화할 수 있다.
aphA 유전자의 서열은 공지되어 있으며, 이는 당해 서열에 기초하여 PCR, 하이브리드화 등에 의해 용이하게 수득할 수 있다. 에세리키라 콜라이의 aphA 유전자의 예로는 서열번호 18의 아미노산 서열을 암호화하는 것이 포함된다.
기타 미생물의 aphA 유전자도 또한 공지된 서열 또는 상기 에세리키아 콜라이의 aphA 유전자와의 서열 상동성에 기초하여 수득할 수 있으며, 미생물 변형에 사용할 수 있다.
aphA 유전자는 변형 대상 미생물의 염색체 상의 aphA 유전자와 상동 재조합을 유발하기에 충분한 서열 동일성을 가지며, 예를 들어, 이는 서열번호 18의 전체 아미노산 서열과 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 특히 바람직하게는 95% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 암호화할 수 있다.
본 발명은 신규한 미생물로서 GMP 신테타제 활성이 guaA 유전자의 발현을 증가시킴으로써 증강되고 nagD 유전자가 정상적으로 기능하지 않도록 변형된, 크산틸산을 5'-구아닐산으로 전환시키는 능력을 갖는 미생물을 제공하며, 여기서, 상기 미생물은, 증가된 guaB 유전자 발현을 갖지 않는 미생물이다. 이러한 미생물은 바람직하게는 ushA 유전자 및/또는 aphA 유전자가 정상적으로 기능하지 않도록 추가로 변형된다.
<II> GMP의 생산방법
GMP는 nagD 유전자가 정상적으로 기능하지 않고 GMP 신테타제 활성이 증가되도록 변형된 상기 미생물을 XMP와 반응시켜 XMP를 GMP로 전환시킴으로써 수득할 수 있다.
미생물 배양의 경우, 모든 탄소원은 상기 미생물이 이를 동화할 수 있는 한 사용할 수 있으며, 이의 예로는 탄수화물, 예를 들어, 글루코오스, 프룩토오스, 수크로오스, 당밀, 블랙스트랩 당밀 및 전분 가수분해물; 알콜, 예를 들어, 에탄올, 글리세린 및 소르비톨; 유기산, 예를 들어, 피루브산, 락트산 및 아세트산; 아미노산, 예를 들어, 글리신, 알라닌, 글루탐산 및 아스파르트산이 포함된다. 사용될 수 있는 질소원의 예로는 암모니아; 각종 무기 및 유기 암모니아 염, 예를 들어, 염화암모늄, 황산 암모늄, 질산 암모늄, 탄산 암모늄, 아세트산 암모늄 및 인산 암모늄; 우레아; 각종 아미노산; 펩톤; NZ 아민; 고기 추출물; 효모 추출물; 옥수수 침지액; 카제인 가수분해물; 및 어분 및 이의 분해물이 포함된다. 사용될 수 있는 무기 물질의 예로는 제1 인산 칼륨, 제2 인산 칼륨, 황산 마그네슘, 인산 마그네슘, 염화나트륨, 황산 제1철, 황산 망간, 황산 아연 및 탄산 칼슘이 포함된다. 사용된 미생물이 생장을 위해 특정 영양소, 예를 들어, 아미노산, 핵산 및/또는 비타민을 필요로 하는 경우, 적합한 양의 이러한 물질을 배지에 첨가한다.
배양은 pH 5.0 내지 8.5 및 15 내지 45℃의 온도에서 약 5 내지 72시간 동안의 호기성 조건 하에 적절한 조건으로 수행할 수 있다. pH를 조절하기 위해, 무기 또는 유기, 산성 또는 알칼리성 물질, 암모니아 가스 등을 사용할 수 있다.
XMP의 GMP로의 전환은 XMP를 함유하는 반응 용액에 미생물의 배양 생성물을 직접 접종하거나 원심분리 후 미생물 세포만을 접종하거나 적절한 용액 중의 미생물 세포의 현탁액을 접종함으로써 수행할 수 있다. 기질인 XMP의 농도는 충분한 양의 GMP가 수득될 수 있는 농도인 한 제한되지 않으며, 바람직하게는 1 내지 200mM의 범위이다.
GMP를 생산하기 위한 본 발명의 방법에서, 상기 미생물의 가공 세포는 가공된 후 사용할 수 있다. 가공 미생물 세포의 예로는 세포를 아크릴아미드, 카라기닌 등으로 고정시킴으로써 생산된 고정 미생물 세포가 포함된다.
미생물을 전환 반응 용액에 유지시키기 위해 첨가되는 탄소원, 질소원 및 무기 물질로서, 미생물 배양에 사용되는 상기 기재된 바와 동일한 종류의 탄소원, 질소원 및 무기 물질을 사용할 수 있다. 사용된 미생물이 생장을 위해 특정 영양소, 예를 들어, 아미노산, 핵산 및/또는 비타민을 필요로 하는 경우, 적합한 양의 이러한 물질을 반응 용액에 첨가한다.
반응 용액은 바람직하게는 뉴클레오타이드의 세포 투과성을 활성화하기 위해 유기 용매로 보충한다.
뉴클레오타이드를 위한 막 투과성 활성화제로서 사용될 수 있는 유기 용매의 예로는, 크실렌, 톨루엔, 벤젠, 지방산 알콜 및 에틸 아세테이트가 포함되며, 이들은 바람직하게는 일반적으로 0.1 내지 30ml/L의 농도로 사용한다. 반응은 pH 5.0 내지 8.5 및 15 내지 45℃의 온도에서 약 1시간 내지 7일 동안의 호기성 조건 하에 적절한 조건으로 수행할 수 있다. pH를 조절하기 위해, 무기 또는 유기, 산성 또는 알칼리성 물질, 암모니아 가스 등을 사용할 수 있다. 원료로서 사용된 XMP의 관점에서, 화학적으로 합성된 XMP, 시판용 XMP, 발효에 의해 생산된 XMP 등을 사용할 수 있다.
반응 용액으로부터 GMP의 회수는 일반적으로 공지된 방법, 예를 들어, 이온교환 수지 방법 및 침전 방법의 조합에 의해 수행할 수 있다.
실시예
지금부터, 실시예를 참조하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다.
실시예 1
<1-1> JM109 균주로부터 유래된 nagD 유전자 파괴된 균주의 제작
먼저, DNA 클로닝을 위한 숙주로서 종종 사용되는 에세리키아 콜라이 JM109 균주를 친주로서 사용하여, NagD 단백질을 생산할 수 없는 균주를 제작하였다. NagD 단백질은 nagD 유전자(GenBank Accession No. X14135; 서열번호 11)에 의해 암호화된다.
nagD 유전자의 결실은 다첸코(Datsenko) 및 와너(Wanner)에 의해 최초로 개발된 "레드 구동 통합"이라 불리는 방법[문헌 참조: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, vol. 97, No. 12, pp. 6640-6645] 및 λ 파지로부터 유래된 절제 시스템[문헌 참조: J. Bacteriol. 2002 Sep; 184(18): 5200-3, Interactions between integrase and excisionase in the phage lambda excisive nucleoprotein complex, Cho EH, Gumport RI, Gardner JF]에 의해 수행하였다. "레드 구동 상호작용" 방법에 의해, 유전자 파괴된 균주는 5' 영역에서 대상 유전자의 부분 및 3' 영역에서 항생제 내성 유전자의 부분을 갖도록 설계된 합성 올리고뉴클레오타이드를 프라이머로서 사용함으로써 수득된 PCR 생성물을 사용하여 1단계로 제작할 수 있다. 상기 방법으로 λ 파지로부터 유래한 절제 시스템을 추가로 배합함으로써, 유전자 파괴된 균주에 혼입된 항생제 내성 유전자를 제거할 수 있다.
PCR용 주형으로서, 플라스미드 pMW118-attL-Cm-attR을 사용하였다. pMW118-attL-Cm-attR(국제 공개공보 제WO 2006/078039호 참조)은 attL-cat-attR의 순서로 pMW118(TAKARA BIO INC.에 의해 제조됨)에 attL 및 attR 유전자(λ 파지의 부착 부위임) 및 cat 유전자(항생제 내성 유전자임)의 삽입에 의해 제조된 플라스미드이다.
PCR은 프라이머의 3' 말단에서 attL 및 attR의 양 말단에 상응하는 서열과 프라이머의 5' 말단에서 대상 유전자인 nagD 유전자의 부분에 상응하는 서열을 갖는 서열번호 19 및 20의 합성 올리고뉴클레오타이드를 프라이머로서 사용하여 수행하였다.
증폭된 PCR 생성물을 아가로오스 겔로 정제하였고, 온도 민감성 복제 능력을 갖는 플라스미드 pKD46을 함유하는 에세리키아 콜라이 JM109 균주에 정제된 PCR 생성물을 전기천공에 의해 도입하였다. 플라스미드 pKD46[문헌 참조: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, vol. 97, No. 12, p6640-6645]은 아라비노오스 유도성 ParaB 프로모터에 의해 제어된 λ레드 상동 재조합을 위한 레드 재조합효소(γ, β 및 엑소 유전자)를 암호화하는 유전자를 갖는 λ 파지의 총 2154개의 뉴클레오타이드의 DNA 단편(GenBank/EMBL Accession No. J02459; 31088번 내지 33241번)을 함유한다. 플라스미드 pKD46은 JM109 균주의 염색체에 PCR 생성물을 혼입하는데 필요하다.
전기천공을 위한 적격 세포를 다음과 같이 제조하였다. 즉, 30℃에서 밤새 100mg/L의 암피실린으로 보충된 LB 배지에서 배양된 에세리키아 콜라이 JM109 균주를 암피실린(20mg/L) 및 L-아라비노오스(1mM)로 보충된 SOB 배지[문헌 참조: Molecular cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Sambrook, J. et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)] 5mL로 100배 희석하였다. 수득된 희석 세포를, OD600이 0.6에 도달할 때까지, 호기 조건하에 30℃에서 생장시키고 100배 농축시킨 후 10% 글리세롤로 3회 세척하여 이를 전기천공에 사용하였다. 전기천공은 수득된 적격 세포 70μl 및 약 PCR 생성물 100ng을 사용하여 수행하였다. 전기천공 후, SOC 배지[문헌 참조: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Sambrook, J. et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)] 1mL을 세포에 첨가하고, 세포를 37℃에서 2.5시간 동안 배양한 후, 37℃에서 Cm(클로람페니콜)(25mg/L)으로 보충된 L-한천 배지 상에서 평판 배양하고 Cm 내성 재조합 세포를 선택하였다. 이후, pKD46 플라스미드를 제거하기 위해, 2회의 계대를 42℃에서 Cm으로 보충된 L-한천 배지 상에서 수행하고, 수득된 콜로니의 암피실린 내성을 분석하여 pKD46 결핍 암피실린 민감성 균주를 수득하였다.
수득된 돌연변이 균주에서 nagD 유전자의 결실을 PCR로 확인하였다. 수득된 nagD 결핍 균주를 JM109ΔnagD::att-cat 균주라고 명명하였다.
그 다음, nagD 유전자에 도입된 att-cat 유전자를 제거하기 위해, 상기 pMW-intxis-ts를 보조 플라스미드로서 사용하였다. pMW-intxis-ts는 λ 파지의 통합효소 암호화 유전자(Int) 및 절제효소 암호화 유전자(Xis)를 가지며 온도 민감성 복제 능력을 갖는 플라스미드이다. pMW-intxis-ts가 도입되는 경우, 이는 염색체 상의 attL 및 attR을 인식하고 attL과 attR 사이의 유전자를 절제하기 위해 재조합을 유발하고, 이로써 attL 또는 attR 서열만이 염색체 상에 잔존하는 구조를 달성한다.
상기한 바와 같이 수득된 JM109ΔnagD::att-cat 균주의 적격 세포를 통상의 방법에 따라 제조하고 보조 플라스미드 pMW-intxis-ts로 형질전환시킨 후, 50mg/L의 암피실린으로 보충된 L-한천 배지 상에서 30℃에서 평판 배양하고 암피실린 내성 균주을 선택하였다.
이후, pMW-intxis-ts 플라스미드를 제거하기 위해, 2회의 계대를 42℃에서 L-한천 배지에서 수행하고, 수득된 콜로니의 클로람페니콜 내성을 분석하여 att-cat 결핍 nagD 파괴된 균주 및 pMW-intxis-ts인 클로람페니콜 및 암피실린 민감성 균주를 수득하였다. 당해 균주를 JM109ΔnagD라고 명명하였다.
<1-2> GMP 신테타제 발현 플라스미드 pSTV29-Ptac-guaA의 제작 및 당해 플라스미드의 JM109 균주 및 JM109ΔnagD 균주로의 도입
GMP 신테타제 발현 플라스미드 pSTV29-Ptac-guaA를 다음과 같이 제작하였다. 서열번호 9 및 서열번호 10의 프라이머를 사용하여 PCR에 의해 에세리키아 콜라이의 guaA 유전자를 증폭시켰다. 증폭된 단편을 정제하고 양 말단에서 형성된 제한 부위를 EcoRI 및 PstI로 분해시켰다. EcoRI 및 PstI로 유사하게 분해된 pKK223-3(GenBank Accession No. M77749)에 분해된 단편을 연결하고, guaA 유전자가 tac 프라이머의 매우 근접한 하류에 혼입되는 플라스미드 pKK223-guaA를 선택하였다. 수득된 플라스미드를 BamHI 및 HindIII으로 분해시켜 tac 프로모터를 함유하도록 하였다. BamHI 및 HindIII으로 유사하게 분해된 pSTV29에 분해된 단편을 연결하고, guaA 유전자가 tac 프라이머의 매우 근접한 하류에 혼입되는 플라스미드 pSTV29-Ptac-guaA를 선택하였다. 이를 JM109 균주 및 상기 JM109ΔnagD 균주에 도입하여 JM109/pSTV29-Ptac-guaA 균주 및 JM109ΔnagD/pSTV29-Ptac-guaA 균주를 각각 수득하였다.
<1-3> JM109/pSTV29-Ptac-guaA 균주 및 JM109ΔnagD/pSTV29-Ptac-guaA 균주를 사용한 XMP의 GMP로의 전환
XMP로부터 GMP로의 전환 반응을 상기 균주에 대하여 평가하였다. 다음은 세균 세포의 제조방법, 반응 방법, 반응 용액의 조성물 및 XMP로부터 GMP로의 전환 반응의 평가 분석 방법이다.
[세균 세포의 제조방법]
JM109/pSTV29-Ptac-guaA 균주 및 JM109ΔnagD/pSTV29-Ptac-guaA 균주를 LB 배지 플레이트 상에 균일하게 도포한 후, 이를 37℃에서 밤새 배양하였다. 다음날, 세균 세포를, 플레이트 상의 세포의 총량의 1/32에 상응하는 양으로 LB 배지 120ml를 각각 함유하는 500ml 사카구치(Sakaguchi) 플라스크에 접종하고 37℃에서 밤새 배양하였다. LB 배지 600ml에 상응하는 배양액을 원심분리한 후, 수득된 세균 세포를 반응 용액 60ml에 사용하였다.
[반응 방법]
상기 LB 배지 600ml에 상응하는 배양된 세균 세포를 약시(medicine spoon)로 회수하고 후술되는 반응 용액 60ml에 접종하여 반응을 개시하였다. pH 7.2가 유지되도록 수성 암모니아를 첨가하면서 반응을 42℃에서 수행하였다.
[반응 용액의 조성]
25mM XMP
50g/L 글루코오스
9.2g/L 나트륨 헥사메타포스페이트
5g/L MgSO4·7H2O
10g/L KH2PO4
3ml/L 크실렌
[분석 방법]
시간에 따라, 반응 용액 500μl를 샘플링하고 KOH로 희석시켜 반응을 정지시켰다. 반응이 정지된 반응 용액을 여과하고 용액 10μl를 HPLC 분석하였다. 분석 조건은 다음과 같다.
칼럼: Asahipak GS-220HQ(직경 7.6mm, 30cm)
용리액: 0.2M NaH2PO4(pH 3.98)
온도: 55℃
유속: 0.6ml/분
검출: 자외선(254nm) 흡광도
결과를 도 1에 나타냈다. JM109/pSTV29-Ptac-guaA 균주는 GMP를 생산한 것으로 나타났으나, GMP는 높은 분해 활성으로 인해 전혀 축적되지 않았다(GMP <0.06g/L). 한편, JM109ΔnagD/pSTV29-Ptac-guaA 균주는 반응 용액에서 반응 2시간째에 GMP를 최대 약 1.7g/L 축적시킨 것으로 나타났다.
실시예 2
<2-1> JM109 균주 및 JM109ΔnagD 균주로부터 유래된 ushA 유전자 파괴된 균주의 제작
실시예 1의 <1-1>에서 수득된 JM109 균주 및 JM109ΔnagD 균주를 친주로서 사용하여, UshA를 생산할 수 없는 균주를 제작하였다. UshA는 ushA 유전자(GenBank Accession No. X03895; 서열번호 14)에 의해 암호화된다. nagD 유전자의 파괴를 위한 상기 방법과 동일한 방법으로, 서열번호 21 및 22의 프라이머를 ushA 유전자의 파괴를 위한 프라이머로서 사용하여 ushA 유전자를 파괴하였다. 이렇게 함으로써, JM109ΔushA 균주 및 JM109ΔushAΔnagD 균주를 수득하였다.
<2-2> GMP 신테타제 발현 플라스미드 pSTV29-Ptac-guaA의 JM109ΔushA 균주 및 JM109ΔushAΔnagD 균주로의 도입
실시예 1에서 기재된 GMP 신테타제 발현 플라스미드 pSTV29-Ptac-guaA를 JM109ΔushA 균주 및 JM109ΔushAΔnagD 균주에 도입하여 JM109ΔushA/pSTV29-Ptac-guaA 균주 및 JM109ΔushAΔnagD/pSTV29-Ptac-guaA 균주를 각각 수득하였다.
<2-3> JM109ΔushA/pSTV29-Ptac-guaA 균주 및 JM109ΔushAΔnagD/pSTV29-Ptac-guaA 균주를 사용하여 XMP의 GMP로의 전환
XMP로부터 GMP로의 전환 반응을 상기 균주에 대하여 평가하였다. 실시예 1의 <1-3>과 동일한 방법으로 평가를 수행하였다.
결과를 도 2에 나타냈다. 반응 용액에서, JM109ΔushA/pSTV29-Ptac-guaA 균주는 반응 2시간째에 GMP를 최대 약 9.7g/L 축적시켰고 JM109ΔushAΔnagD/pSTV29-Ptac-guaA 균주는 반응 2시간째에 GMP를 최대 약 10.3g/L 축적시킨 것으로 나타났다.
실시예 3
<3-1> JM109ΔushA 균주 및 JM109ΔushAΔnagD 균주로부터 유래된 aphA 유전자 파괴된 균주의 제작
실시예 2의 <2-1>에서 수득된 JM109ΔushA 균주 및 JM109ΔushAΔnagD 균주를 친주로서 사용하여, AphA를 생산할 수 없는 균주를 제작하였다. AphA는 aphA 유전자(GenBank Accession No. X86971; 서열번호 17)에 의해 암호화된다. nagD 유전자의 파괴를 위한 상기 방법과 동일한 방법으로, 서열번호 23 및 24의 프라이머를 aphA 유전자의 파괴를 위한 프라이머로서 사용하여 aphA 유전자를 파괴하였다. 이렇게 함으로써, JM109ΔushAΔaphA 균주 및 JM109ΔushAΔaphAΔnagD 균주를 수득하였다.
<3-2> GMP 신테타제 발현 플라스미드 pSTV29-Ptac-guaA의 JM109ΔushAΔaphA 균주 및 JM109ΔushAΔaphAΔnagD 균주로의 도입
실시예 1에서 기재된 GMP 신테타제 발현 플라스미드 pSTV29-Ptac-guaA를 JM109ΔushAΔaphA 균주 및 JM109ΔushAΔaphAΔnagD 균주에 도입하여 JM109ΔushAΔaphA/pSTV29-Ptac-guaA 균주 및 JM109ΔushAΔaphAΔnagD/pSTV29-Ptac-guaA 균주를 각각 수득하였다.
<3-3> JM109ΔushAΔaphA/pSTV29-Ptac-guaA 균주 및 JM109ΔushAΔaphAΔnagD/pSTV29-Ptac-guaA 균주를 사용한 XMP의 GMP로의 전환
XMP로부터 GMP로의 전환 반응을 상기 균주에 대하여 평가하였다. 반응 용액 중의 XMP 농도가 50mM인 것을 제외하고는 실시예 1의 <1-3>과 동일한 방법으로 평가를 수행하였다.
결과를 도 3에 나타냈다. 반응 용액에서, JM109ΔushAΔaphA/pSTV29-Ptac-guaA 균주는 반응 5시간째에 GMP를 최대 약 23.3g/L 축적시켰고 JM109ΔushAΔaphAΔnagD/pSTV29-Ptac-guaA 균주는 반응 4시간째에 GMP를 최대 약 26.9g/L 축적시킨 것으로 나타났다.
실시예 4
<4-1> JM109 균주 및 JM109ΔnagD 균주로부터 유래된 aphA 유전자 파괴된 균주의 제작
실시예 1의 <1-1>에서 수득된 JM109 균주 및 JM109ΔnagD 균주를 친주로서 사용하여, AphA를 생산할 수 없는 균주를 제작하였다. 실시예 3에서 나타낸 바와 같이, 서열번호 23 및 24의 프라이머를 aphA 유전자의 파괴를 위한 프라이머로서 사용하여 aphA 유전자를 파괴하였다. 이렇게 함으로써, JM109ΔaphA 균주 및 JM109ΔaphAΔnagD 균주를 수득하였다.
<4-2> GMP 신테타제 발현 플라스미드 pSTV29-Ptac-guaA의 JM109ΔaphA 균주 및 JM109ΔaphAΔnagD 균주로의 도입
실시예 1에서 기재된 GMP 신테타제 발현 플라스미드 pSTV29-Ptac-guaA를 JM109ΔaphA 균주 및 JM109ΔaphAΔnagD 균주에 도입하여 JM109ΔaphA/pSTV29-Ptac-guaA 균주 및 JM109ΔaphAΔnagD/pSTV29-Ptac-guaA 균주를 각각 수득하였다.
실시예 1 내지 3에서와 같이, XMP의 GMP로의 전환을 이들 균주에 대하여 평가할 수 있으며, GMP의 축적량 증가를 확인할 수 있다.
본 발명에 따라, 식품 시즈닝 및 약제 및 이들의 원료로서 유용한 GMP를 효율적으로 생산할 수 있다.
[서열 목록의 설명]
서열번호 1 에세리키아 콜라이 GMP 신테타제(GMPS) 유전자(guaA)의 뉴클레오타이드 서열
서열번호 2 에세리키아 콜라이 GMPS의 아미노산 서열
서열번호 3 바실러스 서브틸리스 GMPS 유전자(guaA)의 뉴클레오타이드 서열
서열번호 4 바실러스 서브틸리스 GMPS의 아미노산 서열
서열번호 5 코리네박테리움 글루타미쿰 GMPS 유전자(guaA)의 뉴클레오타이드 서열
서열번호 6 코리네박테리움 글루타미쿰 GMPS의 아미노산 서열
서열번호 7 코리네박테리움 암모니아게네스 GMPS 유전자(guaA)의 뉴클레오타이드 서열
서열번호 8 코리네박테리움 암모니아게네스 GMPS의 아미노산 서열
서열번호 9 에세리키아 콜라이 guaA 유전자를 클로닝하기 위한 프라이머의 뉴클레오타이드 서열
서열번호 10 에세리키아 콜라이 guaA 유전자를 클로닝하기 위한 프라이머의 뉴클레오타이드 서열
서열번호 11 에세리키아 콜라이 nagD 유전자의 뉴클레오타이드 서열
서열번호 12 에세리키아 콜라이 NagD의 아미노산 서열
서열번호 13 에세리키아 콜라이 nagD 유전자를 클로닝하기 위한 프라이머의 뉴클레오타이드 서열
서열번호 14 에세리키아 콜라이 nagD 유전자를 클로닝하기 위한 프라이머의 뉴클레오타이드 서열
서열번호 15 에세리키아 콜라이 ushA 유전자의 뉴클레오타이드 서열
서열번호 16 에세리키아 콜라이 UshA의 아미노산 서열
서열번호 17 에세리키아 콜라이 aphA 유전자의 뉴클레오타이드 서열
서열번호 18 에세리키아 콜라이 AphA의 아미노산 서열
서열번호 19 에세리키아 콜라이 nagD 유전자의 파괴를 위한 프라이머의 뉴클레오타이드 서열
서열번호 20 에세리키아 콜라이 nagD 유전자의 파괴를 위한 프라이머의 뉴클레오타이드 서열
서열번호 21 에세리키아 콜라이 ushA 유전자의 파괴를 위한 프라이머의 뉴클레오타이드 서열
서열번호 22 에세리키아 콜라이 ushA 유전자의 파괴를 위한 프라이머의 뉴클레오타이드 서열
서열번호 23 에세리키아 콜라이 aphA 유전자의 파괴를 위한 프라이머의 뉴클레오타이드 서열
서열번호 24 에세리키아 콜라이 aphA 유전자의 파괴를 위한 프라이머의 뉴클레오타이드 서열
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<210> 2 <211> 525 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 2 Met Thr Glu Asn Ile His Lys His Arg Ile Leu Ile Leu Asp Phe Gly 1 5 10 15 Ser Gln Tyr Thr Gln Leu Val Ala Arg Arg Val Arg Glu Leu Gly Val 20 25 30 Tyr Cys Glu Leu Trp Ala Trp Asp Val Thr Glu Ala Gln Ile Arg Asp 35 40 45 Phe Asn Pro Ser Gly Ile Ile Leu Ser Gly Gly Pro Glu Ser Thr Thr 50 55 60 Glu Glu Asn Ser Pro Arg Ala Pro Gln Tyr Val Phe Glu Ala Gly Val 65 70 75 80 Pro Val Phe Gly Val Cys Tyr Gly Met Gln Thr Met Ala Met Gln Leu 85 90 95 Gly Gly His Val Glu Ala Ser Asn Glu Arg Glu Phe Gly Tyr Ala Gln 100 105 110 Val Glu Val Val Asn Asp Ser Ala Leu Val Arg Gly Ile Glu Asp Ala 115 120 125 Leu Thr Ala Asp Gly Lys Pro Leu Leu Asp Val Trp Met Ser His Gly 130 135 140 Asp Lys Val Thr Ala Ile Pro Ser Asp Phe Ile Thr Val Ala Ser Thr 145 150 155 160 Glu Ser Cys Pro Phe Ala Ile Met Ala Asn Glu Glu Lys Arg Phe Tyr 165 170 175 Gly Val Gln Phe His Pro Glu Val Thr His Thr Arg Gln Gly Met Arg 180 185 190 Met Leu Glu Arg Phe Val Arg Asp Ile Cys 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Arg Val Leu Gly Glu Val 405 410 415 Lys Lys Glu Tyr Cys Asp Leu Leu Arg Arg Ala Asp Ala Ile Phe Ile 420 425 430 Glu Glu Leu Arg Lys Ala Asp Leu Tyr Asp Lys Val Ser Gln Ala Phe 435 440 445 Thr Val Phe Leu Pro Val Arg Ser Val Gly Val Met Gly Asp Gly Arg 450 455 460 Lys Tyr Asp Trp Val Val Ser Leu Arg Ala Val Glu Thr Ile Asp Phe 465 470 475 480 Met Thr Ala His Trp Ala His Leu Pro Tyr Asp Phe Leu Gly Arg Val 485 490 495 Ser Asn Arg Ile Ile Asn Glu Val Asn Gly Ile Ser Arg Val Val Tyr 500 505 510 Asp Ile Ser Gly Lys Pro Pro Ala Thr Ile Glu Trp Glu 515 520 525 <210> 3 <211> 1542 <212> DNA <213> Bacillus subtilis <220> <221> CDS <222> (1)..(1539) <400> 3 atg aca aag tta gtg aat gaa atg att ctt gtc ctt gat ttc ggc agt 48 Met Thr Lys Leu Val Asn Glu Met Ile Leu Val Leu Asp Phe Gly Ser 1 5 10 15 cag tat aac cag ctg att aca cgc cgt atc cgt gaa ttc ggt gtt tac 96 Gln Tyr Asn Gln Leu Ile Thr Arg Arg Ile Arg Glu Phe Gly Val Tyr 20 25 30 agc gag ctg cat cca cat aca ttg acg gct gaa gaa att aaa aaa atg 144 Ser Glu Leu His Pro His Thr Leu Thr Ala Glu Glu Ile Lys Lys Met 35 40 45 aat cca aaa gga att att tta tcc ggc ggt cca aac agt gtg tat gat 192 Asn Pro Lys Gly Ile Ile Leu Ser Gly Gly Pro Asn Ser Val Tyr Asp 50 55 60 gaa aac tct ttc cgc tgt gac gag aaa atc ttc gag ctt gat att cct 240 Glu Asn Ser Phe Arg Cys Asp Glu Lys Ile Phe Glu Leu Asp Ile Pro 65 70 75 80 gtt ttg gga att tgc tac ggc atg cag ctg atg act cat tac ctt ggc 288 Val Leu Gly Ile Cys Tyr Gly Met Gln Leu Met Thr His Tyr Leu Gly 85 90 95 ggt aaa gtt gaa gcg gca agc cag cgt gaa tac gga aaa gca aac atc 336 Gly Lys Val Glu Ala Ala Ser Gln Arg Glu Tyr Gly Lys Ala Asn Ile 100 105 110 cgc atc gaa ggc aca cct gat ttg ttc aga gat ctt ccg aat gaa caa 384 Arg Ile Glu Gly Thr Pro Asp Leu Phe Arg Asp Leu Pro Asn Glu Gln 115 120 125 gtg gtt tgg atg agc cac ggc gat ttg gtt gta gaa gtt cct gaa ggc 432 Val Val Trp Met Ser His Gly Asp Leu Val Val Glu Val Pro Glu Gly 130 135 140 ttc act gtt gac gcg aca agc cat cac tgc ccg aac tca gca atg agc 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agc gaa ggc ttt 816 Arg Lys Gly Glu Ala Glu Gly Val Met Lys Thr Phe Ser Glu Gly Phe 260 265 270 aac atg aat gtg att aaa gta gac gca aaa gat cga ttc tta aac aaa 864 Asn Met Asn Val Ile Lys Val Asp Ala Lys Asp Arg Phe Leu Asn Lys 275 280 285 cta aaa ggc gtt tct gat cct gag caa aaa cgc aaa atc atc ggt aat 912 Leu Lys Gly Val Ser Asp Pro Glu Gln Lys Arg Lys Ile Ile Gly Asn 290 295 300 gaa ttc att tac gtg ttt gat gat gaa gcg gac aag ctc aaa ggc atc 960 Glu Phe Ile Tyr Val Phe Asp Asp Glu Ala Asp Lys Leu Lys Gly Ile 305 310 315 320 gac tac ctt gca caa ggt acg ctt tac aca gat atc atc gag agc ggt 1008 Asp Tyr Leu Ala Gln Gly Thr Leu Tyr Thr Asp Ile Ile Glu Ser Gly 325 330 335 aca gca acg gcg caa acg atc aaa tct cac cac aat gtc ggc gga ctt 1056 Thr Ala Thr Ala Gln Thr Ile Lys Ser His His Asn Val Gly Gly Leu 340 345 350 cct gaa gac atg cag ttt gag ctg atc gag ccg tta aat acg ctc ttc 1104 Pro Glu Asp Met Gln Phe Glu Leu Ile Glu Pro Leu Asn Thr Leu Phe 355 360 365 aaa gac gaa gtg cgc gcg ctt ggc aca gag ctc ggc att ccg gat gaa 1152 Lys Asp Glu Val Arg Ala Leu Gly Thr Glu Leu Gly Ile Pro Asp Glu 370 375 380 atc gta tgg cgt cag ccg ttc cca gga ccg gga ctc gga atc cgc gtt 1200 Ile Val Trp Arg Gln Pro Phe Pro Gly Pro Gly Leu Gly Ile Arg Val 385 390 395 400 ctt ggc gaa gta aca gaa gaa aaa ctt gaa atc gtt cgt gaa tca gat 1248 Leu Gly Glu Val Thr Glu Glu Lys Leu Glu Ile Val Arg Glu Ser Asp 405 410 415 gca atc ttg cgt gaa gaa att gca aat cac ggc tta gag cgt gat atc 1296 Ala Ile Leu Arg Glu Glu Ile Ala Asn His Gly Leu Glu Arg Asp Ile 420 425 430 tgg caa tac ttc act gtt ctt cct gac atc cgc agc gtt ggt gtt atg 1344 Trp Gln Tyr Phe Thr Val Leu Pro Asp Ile Arg Ser Val Gly Val Met 435 440 445 ggt gac gca aga aca tat gat tac aca atc gga atc cgc gcc gtt aca 1392 Gly Asp Ala Arg Thr Tyr Asp Tyr Thr Ile Gly Ile Arg Ala Val Thr 450 455 460 tca atc gac ggc atg aca tct gac tgg gcg cgt atc ccg tgg gat gtg 1440 Ser Ile Asp Gly Met Thr Ser Asp Trp Ala Arg Ile Pro Trp Asp Val 465 470 475 480 ctt gaa gtc att tcg aca cgt atc gta aac gaa gtg aag cac att aac 1488 Leu Glu Val Ile Ser Thr Arg Ile Val Asn Glu Val Lys His Ile Asn 485 490 495 cgc gtg gtg tat gat att aca agt aag ccg cct gcg acg att gag tgg 1536 Arg Val Val Tyr Asp Ile Thr Ser Lys Pro Pro Ala Thr Ile Glu Trp 500 505 510 gaa taa 1542 Glu <210> 4 <211> 513 <212> PRT <213> Bacillus subtilis <400> 4 Met Thr Lys Leu Val Asn Glu Met Ile Leu Val Leu Asp Phe Gly Ser 1 5 10 15 Gln Tyr Asn Gln Leu Ile Thr Arg Arg Ile Arg Glu Phe Gly Val Tyr 20 25 30 Ser Glu Leu His Pro His Thr Leu Thr Ala Glu Glu Ile Lys Lys Met 35 40 45 Asn Pro Lys Gly Ile Ile Leu Ser Gly Gly Pro Asn Ser Val Tyr Asp 50 55 60 Glu Asn Ser Phe Arg Cys Asp Glu Lys Ile Phe Glu Leu Asp Ile Pro 65 70 75 80 Val Leu Gly Ile Cys Tyr Gly Met Gln Leu Met Thr His Tyr Leu Gly 85 90 95 Gly Lys Val Glu Ala Ala Ser Gln Arg Glu Tyr Gly Lys Ala Asn Ile 100 105 110 Arg Ile Glu Gly Thr Pro Asp Leu Phe Arg Asp Leu Pro Asn Glu Gln 115 120 125 Val Val Trp Met Ser His Gly Asp Leu Val Val Glu 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Pro Met 50 55 60 Ala Val Gly Phe Asp Ile Asp Asp Thr Val Leu Phe Ser Ser Pro Gly 65 70 75 80 Phe Trp Arg Gly Lys Lys Thr Phe Ser Pro Glu Ser Glu Asp Tyr Leu 85 90 95 Lys Asn Pro Val Phe Trp Glu Lys Met Asn Asn Gly Trp Asp Glu Phe 100 105 110 Ser Ile Pro Lys Glu Val Ala Arg Gln Leu Ile Asp Met His Val Arg 115 120 125 Arg Gly Asp Ala Ile Phe Phe Val Thr Gly Arg Ser Pro Thr Lys Thr 130 135 140 Glu Thr Val Ser Lys Thr Leu Ala Asp Asn Phe His Ile Pro Ala Thr 145 150 155 160 Asn Met Asn Pro Val Ile Phe Ala Gly Asp Lys Pro Gly Gln Asn Thr 165 170 175 Lys Ser Gln Trp Leu Gln Asp Lys Asn Ile Arg Ile Phe Tyr Gly Asp 180 185 190 Ser Asp Asn Asp Ile Thr Ala Ala Arg Asp Val Gly Ala Arg Gly Ile 195 200 205 Arg Ile Leu Arg Ala Ser Asn Ser Thr Tyr Lys Pro Leu Pro Gln Ala 210 215 220 Gly Ala Phe Gly Glu Glu Val Ile Val Asn Ser Glu Tyr 225 230 235 <210> 19 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> primer1 for disrupting nagD <400> 19 tgggtagtcc atgaccatta aaaatgtaat ttgcgacgct caagttagta 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Claims (12)

  1. 미생물을 크산틸산과 반응시켜 5'-구아닐산을 생산하고 5'-구아닐산을 회수함을 포함하는, 5'-구아닐산의 생산방법으로서,
    상기 미생물은, 크산틸산을 5'-구아닐산으로 전환시키는 능력을 갖는 미생물이고, nagD 유전자의 전사가 감소하거나 제거되고 5'-구아닐산 신테타제 활성이 증강되도록 변형된 미생물인, 5'-구아닐산의 생산방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 미생물에서 guaA 유전자의 발현을 증가시킴으로써 상기 5'-구아닐산 신테타제 활성이 증강되는 생산방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 guaA 유전자가,
    (A) 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 단백질; 및
    (B) 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하지만, 하나 또는 수개의 아미노산의 치환, 결실, 삽입 또는 부가를 포함하고, 5'-구아닐산 신테타제 활성을 갖는 단백질
    로 이루어진 그룹으로부터 선택된 단백질을 암호화하는 생산방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 미생물이, ushA 유전자 및/또는 aphA 유전자의 전사가 감소되거나 제거되도록 추가로 변형된 생산방법.
  5. 제1항 내지 제3항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 미생물이 장내세균(Enterobacteriaceae) 과에 속하는 세균, 바실러스(Bacillus) 세균 및 코리네형(coryneform) 세균으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 생산방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 미생물이 에세리키아(Escherichia) 속에 속하는 생산방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 미생물이 에세리키아 콜라이(Escherichia coli)인 생산방법.
  8. 크산틸산을 5'-구아닐산으로 전환시키는 능력을 갖는 미생물로서,
    상기 미생물은, 5'-구아닐산 신테타제 활성이 guaA 유전자의 발현을 증가시킴으로써 증강되고 nagD 유전자의 전사가 감소되거나 제거되도록 변형된 미생물이고, 증가된 guaB 유전자 발현을 갖지 않는 미생물.
  9. 제8항에 있어서, 상기 미생물이 ushA 유전자 및 aphA 유전자로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 유전자의 전사가 감소되거나 제거되도록 추가로 변형된 미생물.
  10. 제8항 또는 제9항에 있어서, 상기 미생물이 장내세균 과에 속하는 세균, 바실러스 세균 및 코리네형 세균으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 미생물.
  11. 제10항에 있어서, 상기 미생물이 에세리키아 속에 속하는 미생물.
  12. 제11항에 있어서, 상기 미생물이 에세리키아 콜라이인 미생물.
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