KR101669474B1 - 5'-구아닐산의 생산방법 - Google Patents
5'-구아닐산의 생산방법 Download PDFInfo
- Publication number
- KR101669474B1 KR101669474B1 KR1020100076730A KR20100076730A KR101669474B1 KR 101669474 B1 KR101669474 B1 KR 101669474B1 KR 1020100076730 A KR1020100076730 A KR 1020100076730A KR 20100076730 A KR20100076730 A KR 20100076730A KR 101669474 B1 KR101669474 B1 KR 101669474B1
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- val
- gly
- ala
- leu
- glu
- Prior art date
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
- C12P19/26—Preparation of nitrogen-containing carbohydrates
- C12P19/28—N-glycosides
- C12P19/30—Nucleotides
- C12P19/32—Nucleotides having a condensed ring system containing a six-membered ring having two N-atoms in the same ring, e.g. purine nucleotides, nicotineamide-adenine dinucleotide
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
- C12R2001/07—Bacillus
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
- C12R2001/15—Corynebacterium
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
- C12R2001/185—Escherichia
- C12R2001/19—Escherichia coli
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/8215—Microorganisms
- Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
- Y10S435/832—Bacillus
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/8215—Microorganisms
- Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
- Y10S435/843—Corynebacterium
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/8215—Microorganisms
- Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
- Y10S435/848—Escherichia
- Y10S435/849—Escherichia coli
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
5'-구아닐산(GMP)은, 미생물을 크산틸산(XMP)과 반응시켜 GMP를 생산하고 GMP를 회수함으로써 효율적으로 생산되며, 상기 미생물은 크산틸산을 5'-구아닐산으로 전환시키는 능력을 가지며, nagD 유전자가 정상적으로 기능하지 않고 5'-구아닐산 신테타제 활성이 증강되도록 변형된다.
Description
본 발명은 5'-구아닐산의 생산방법 및 이의 생산에 사용되는 신규한 미생물에 관한 것이다. 5'-구아닐산은 식품 시즈닝, 약제 및 이들의 원료로서 유용하다.
5'-구아닐산(구아노신-5'-모노포스페이트; 이하, "GMP"로도 언급됨)의 산업적 생산방법의 공지된 예로는 구아노신을 발효에 의해 생산하고 수득된 구아노신을 효소적으로 인산화하여 5'-구아닐산을 수득하는 방법이 포함된다(특허 문헌 1 내지 4)
또한, GMP 신테타제 활성을 증가시킨 에세리키아(Escherichia) 세균과 글루코스 대사 및 5'-크산틸산(XMP)으로부터 GMP의 합성에 필요한 아데노신 트리포스페이트(ATP)의 생합성(이하, "ATP 재생"으로도 언급됨) 능력을 증강시킨 브레비박테리움 암모니아게네스(Brevibacterium ammoniagenes)를, XMP 및 암모니아 또는 글루타민을 함유하는 배지에서 배양하고 XMP를 GMP로 고효율로 전환시켜 GMP를 배지에 생산하여 축적시키는 방법도 공지되어 있다(비특허 문헌 1).
발효에 의한 GMP의 생산방법도 또한 제안되었다. 예를 들어, 특허 문헌 5에서, 데코이이닌 또는 메티오닌 설폭사이드에 대한 내성을 나타내는 아데닌 영양요구성을 갖고 GMP 생산 능력을 갖는 바실러스(Bacillus) 속의 돌연변이 균주를 배양하고 배지에 생산되어 축적된 GMP를 회수하는 GMP의 생산방법이 개시되어 있다. 추가로, 특허 문헌 6에는 이노신산(이노신산-5'-모노포스페이트; 이하, "IMP"로도 언급됨)을 생산하는 능력을 갖는 에세리키아 세균에서 2종의 5'-뉴클레오티다제 유전자를 결실시키고 IMP 데하이드로게나제 및 GMP 신테타제 유전자를 증폭시킴으로써 생산된 균주를 배양하고, 배지에 생산되어 축적된 GMP를 회수하는 GMP의 생산방법이 개시되어 있다. 그러나, 일반적으로, GMP의 수율은 직접 발효에서 충분하지 않으므로, 이러한 방법은 상기 효소 방법과 비교하여 사실상 충분하지 않다.
상기 언급된 바와 같이, 5'-구아닐산의 생산을 위한 각종 연구가 수행되었고, 몇 가지 성공적인 예가 공지되어 있다. 그러나, 뉴클레오티다제는 완전히 이해되지 않는다. 수개의 뉴클레오티다제가 발견되었고, 이의 결실이 수율을 증가시킬 수 있음은 공지되어 있으나(특허 문헌 6 및 7), 생성물의 분해를 완전히 억제하는 것은 곤란하며, 이는 주로 문제가 된다.
[선행 기술 문헌]
특허 문헌
[특허 문헌 1] 일본 공개특허공보 제07-231793호
[특허 문헌 2] 일본 공개특허공보 제10-201481호
[특허 문헌 3] 국제 공개공보 제WO 96/37603호
[특허 문헌 4] 일본 공개특허공보 제2001-245676호
[특허 문헌 5] 일본 특허공보 제56-12438호
[특허 문헌 6] 일본 공개특허공보 제2002-355087호
[특허 문헌 7] 국제 공개공보 제WO 2006/078132호
[비특허 문헌 1] [Tatsuro Fujio, et al., Biosci. Biotech. Biochem., 1997, 61(5), pp. 840-845]
본 발명의 목적은 XMP로부터 GMP의 생산방법에 사용할 수 있고 XMP를 GMP로 고효율로 전환시킬 수 있는 신규한 미생물을 생산하는 것에 관한 것이다.
본 발명자들은 상기 목적을 해결하기 위해 집중적으로 연구한 결과, nagD 유전자가 정상적으로 기능하지 않고 GMP 신테타제 활성이 증가되고 XMP가 GMP로 고효율로 전환되도록 변형된 에세리키아 속의 미생물을 사용함으로써 본 발명이 완성됨을 발견하였다.
본 발명의 한 양태는 미생물을 크산틸산과 반응시켜 5'-구아닐산을 생산하고 5'-구아닐산을 회수함을 포함하는, 5'-구아닐산의 생산방법을 제공하는 것으로, 상기 미생물은 크산틸산을 5'-구아닐산으로 전환시키는 능력을 가지며, nagD 유전자가 정상적으로 기능하지 않고 5'-구아닐산 신테타제 활성이 증강되도록 변형된다.
본 발명의 또 다른 양태는 상기 5'-구아닐산 신테타제 활성이 상기 미생물에서 guaA 유전자의 발현을 증가시킴으로써 증강되는 상기 생산방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 양태는 상기 guaA 유전자가, (A) 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 단백질; 및 (B) 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하지만 하나 또는 수개의 아미노산의 치환, 결실, 삽입 또는 부가를 포함하고 5'-구아닐산 신테타제 활성을 갖는 단백질로 이루어진 그룹으로부터 선택된 단백질을 암호화하는 상기 생산방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 양태는 상기 미생물이, ushA 유전자 및/또는 aphA 유전자가 정상적으로 기능하지 않도록 추가로 변형된 상기 생산방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 양태는 상기 미생물이 장내세균(Enterobacteriaceae) 과에 속하는 세균, 바실러스 세균 및 코리네형(coryneform) 세균으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 상기 생산방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 양태는 상기 미생물이 에세리키아 속에 속하는 상기 생산방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 양태는 상기 미생물이 에세리키아 콜라이(Escherichia coli)인 상기 생산방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 양태는 크산틸산을 5'-구아닐산으로 전환시키는 능력을 갖는 미생물을 제공하는 것으로, 여기서, 상기 미생물은, 5'-구아닐산 신테타제 활성이 guaA 유전자의 발현을 증가시킴으로써 증강되고 nagD 유전자가 정상적으로 기능하지 않도록 변형된 미생물이고, 증가된 guaB 유전자 발현을 갖지 않는 미생물이다.
본 발명의 또 다른 양태는 ushA 유전자 및 aphA 유전자로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 유전자가 정상적으로 기능하지 않도록 추가로 변형된 상기 미생물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 양태는 장내세균 과에 속하는 세균, 바실러스 세균 및 코리네형 세균으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 상기 미생물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 양태는 에세리키아 속에 속하는 상기 미생물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 양태는 에세리키아 콜라이인 상기 미생물을 제공하는 것이다.
도 1a는 JM109/pSTV29-Ptac-guaA 균주를 XMP와 반응시킴에 따른 XMP와 GMP의 농도 변화를 도시한 그래프이다.
도 1b는 JM109ΔnagD/pSTV29-Ptac-guaA 균주를 XMP와 반응시킴에 따른 XMP와 GMP의 농도 변화를 도시한 그래프이다.
도 2a는 JM109ΔushA/pSTV29-Ptac-guaA 균주를 XMP와 반응시킴에 따른 XMP와 GMP의 농도 변화를 도시한 그래프이다.
도 2b는 JM109ΔushAΔnagD/pSTV29-Ptac-guaA 균주를 XMP와 반응시킴에 따른 XMP와 GMP의 농도 변화를 도시한 그래프이다.
도 3a는 JM109ΔushAΔaphA/pSTV29-Ptac-guaA 균주를 XMP와 반응시킴에 따른 XMP와 GMP의 농도 변화를 도시한 그래프이다.
도 3b는 JM109ΔushAΔaphAΔnagD/pSTV29-Ptac-guaA 균주를 XMP와 반응시킴에 따른 XMP와 GMP의 농도 변화를 도시한 그래프이다.
도 1b는 JM109ΔnagD/pSTV29-Ptac-guaA 균주를 XMP와 반응시킴에 따른 XMP와 GMP의 농도 변화를 도시한 그래프이다.
도 2a는 JM109ΔushA/pSTV29-Ptac-guaA 균주를 XMP와 반응시킴에 따른 XMP와 GMP의 농도 변화를 도시한 그래프이다.
도 2b는 JM109ΔushAΔnagD/pSTV29-Ptac-guaA 균주를 XMP와 반응시킴에 따른 XMP와 GMP의 농도 변화를 도시한 그래프이다.
도 3a는 JM109ΔushAΔaphA/pSTV29-Ptac-guaA 균주를 XMP와 반응시킴에 따른 XMP와 GMP의 농도 변화를 도시한 그래프이다.
도 3b는 JM109ΔushAΔaphAΔnagD/pSTV29-Ptac-guaA 균주를 XMP와 반응시킴에 따른 XMP와 GMP의 농도 변화를 도시한 그래프이다.
지금부터, 본 발명을 상세하게 기재한다.
<I> 본 발명의 방법에 사용된 미생물
본 발명의 방법에 사용된 미생물은 nagD 유전자가 정상적으로 기능하지 않고 GMP 신테타제 활성이 증가되도록 변형되며, XMP를 GMP로 전환시키는 능력을 갖는다.
이러한 미생물의 예로는 장내세균 과에 속하는 세균, 코리네형 세균 및 바실러스 속에 속하는 세균이 포함된다.
장내세균 과에 속하는 세균의 예로는 에세리키아 속에 속하는 세균, 판토에아(Pantoea) 속에 속하는 세균, 엔테로박터(Enterobacter) 속에 속하는 세균, 클렙시엘라(Klebsiella) 속에 속하는 세균, 세라티아(Serratia) 속에 속하는 세균, 에르위니아(Erwinia) 속에 속하는 세균, 살모넬라(Salmonella) 속에 속하는 세균 및 모가넬라(Morganella) 속에 속하는 세균이 포함된다. 에세리키아 속에 속하는 세균은 에세리키아 속에 속하는 한 제한되지 않으며, 사용될 수 있는 이의 특정 예로는 나이드하르트 등(Neidhardt et al.)의 문헌[참조: Neidhardt, FR. C. et al., Escherichia coli and Salmonella typhimurium, American Society for Microbiology, Washington D. C., 1208, table 1]에 기재된 세균, 예를 들어, 에세리키아 콜라이가 포함된다. 엔테로박터 속에 속하는 세균의 예로는 엔테로박터 아글로머란스(Enterobacter agglomerans) 및 엔테로박터 에어로게네스(Enterobacter aerogenes)가 포함되며, 판토에아 속에 속하는 세균의 예로는 판토에아 아나나티스(Pantoea ananatis)가 포함된다.
코리네형 세균의 예로는 미생물학 분야의 숙련가에게 공지된 분류법에 따라 코리네형 세균으로 분류되는 세균, 브레비박테리움 속으로 분류되지만 코리네박테리움(Corynebacterium) 속으로 재분류되는 세균, 및 코리네박테리움 속과 관련된 브레비박테리움 속에 속하는 세균이 포함된다. 다음은 이러한 코리네형 세균의 예이다.
코리네박테리움 아세토에시도필룸(Corynebacterium acetoacidophilum)
코리네박테리움 아세토글루타미쿰(Corynebacterium acetoglutamicum)
코리네박테리움 알카놀리티쿰(Corynebacterium alkanolyticum)
코리네박테리움 칼루나에(Corynebacterium callunae)
코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)
코리네박테리움 릴륨(Corynebacterium lilium)
코리네박테리움 멜라세콜라(Corynebacterium melassecola)
코리네박테리움 써모아미노게네스(Corynebacterium thermoaminogenes)
코리네박테리움 헤르쿨리스(Corynebacterium herculis)
브레비박테리움 디바리카툼(Brevibacterium divaricatum)
브레비박테리움 플라붐(Brevibacterium flavum)
브레비박테리움 임마리오필룸(Brevibacterium immariophilum)
브레비박테리움 락토페르멘툼(Brevibacterium lactofermentum)
브레비박테리움 로세움(Brevibacterium roseum)
브레비박테리움 사카롤리티쿰(Brevibacterium saccharolyticum)
브레비박테리움 티오게니탈리스(Brevibacterium thiogenitalis)
코리네박테리움 암모니아게네스(Corynebacterium ammoniagenes)
브레비박테리움 알붐(Brevibacterium album)
브레비박테리움 세리눔(Brevibacterium cerinum)
마이크로박테리움 암모니아필룸(Microbacterium ammoniaphilum)
바실러스 속에 속하는 세균으로서, 미생물학 분야의 숙련가에게 공지된 분류법에 따라 바실러스 속으로 분류되는 세균이 사용될 수 있으며, 이의 특정 예로는 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 및 바실러스 아밀로리쿠에파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens)가 포함되나 이에 한정되지는 않는다.
이하, 상기 미생물에서 GMP 신테타제 활성의 증강 방법을 지금부터 기재한다.
본 발명에서, 용어 "GMP 신테타제 활성이 증강되도록 변형된"이란 GMP 신테타제 활성이 미생물, 예를 들어, 에세리키아 속에 속하는 세균의 비변형 균주, 예를 들어, 야생형 균주의 GMP 신테타제 활성보다 큼을 의미한다.
GMP 신테타제는 다음 반응을 촉매하는 효소(EC 6.3.4.1)이며, 용어 "GMP 신테타제 활성"이란 다음 반응을 촉매하여 XMP로부터 GMP를 생산하는 활성을 의미한다.
ATP + XMP + NH3 → AMP + 피로인산 + GMP
GMP 신테타제 활성은, 예를 들어, 스펙터(Spector)에 의한 방법[문헌 참조: Spector, T., Methods Enzymol., 1978, 51, p. 219]에 의해 NADH의 환원 속도를 조사함으로써 측정할 수 있다.
GMP 신테타제 활성을 증강시키기 위해, 이러한 효소를 암호화하는 guaA 유전자의 발현 수준을 증가시키는 것이 바람직하다. 이러한 발현 수준을 증가시키는 방법의 예는 미생물의 세포에서 GMP 신테타제를 암호화하는 DNA의 카피수를 증가시킴을 포함한다. 세포에서 카피수의 증가는 GMP 신테타제를 암호화하는 DNA 단편을 미생물, 예를 들어, 에세리키아 속에 속하는 세균에서 기능하는 벡터에 결합시켜 재조합 DNA를 제조한 후 이러한 DNA를 숙주에 도입하여 형질전환시킴으로써 달성될 수 있다. 형질전환체의 세포에서 GMP 신테타제를 암호화하는 유전자(guaA 유전자)의 카피수 증가의 결과로서, GMP 신테타제 활성은 증가한다.
세포에서 카피수의 증가는 또한 다수의 GMP 신테타제 유전자를 상기 숙주의 염색체 DNA에 존재하도록 함으로써 달성될 수도 있다. 에세리키아 세균과 같은 세균의 염색체 DNA 상에 높은 카피수로 GMP 신테타제 유전자를 도입하는 것은 염색체 상에 높은 카피수로 존재하는 서열을 표적으로서 사용하는 상동 재조합에 의해 수행될 수 있다. 염색체 DNA 상에 높은 카피수로 존재하는 서열의 예로는 반복 DNA 및 전위 요소의 말단에 존재하는 역반복이 포함된다. 또는, 일본 공개특허공보 제2-109985호에 개시된 바와 같이, 목적하는 유전자를 트랜스포존 상에 배치하고 당해 트랜스포존이 전위할 수 있게 하여 염색체 DNA 상에 높은 카피수의 유전자를 도입할 수도 있다. 임의의 상기 방법에 의해, 형질전환체에서 GMP 신테타제 유전자의 카피수가 증가하고, 결과로서 GMP 신테타제 활성이 증가한다.
상기 유전자의 도입을 위한 벡터의 예로는 플라스미드 벡터, 예를 들어, pSTV29, pMW218 및 pUC19; 및 파지 벡터, 예를 들어, λ1059, λBF101 및 M13mp9가 포함된다. 트랜스포존, 예를 들어, Mu, Tn10 및 Tn5도 또한 사용될 수 있다.
GMP 신테타제를 암호화하는 DNA의 뉴클레오타이드 서열이 공지되어 있기 때문에, DNA는 상기 서열에 기초한 프라이머를 합성하고, 미생물, 예를 들어, 에세리키아 속에 속하는 세균의 염색체 DNA를 주형으로 사용하여 PCR에 의해 당해 프라이머를 증폭시킴으로써 수득할 수 있다. 에세리키아 콜라이의 guaA 유전자의 예로는 서열번호 1의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것이 포함된다. 이러한 유전자의 뉴클레오타이드 서열에 기초한 프로브를 제조하고 하이브리드화함으로써, 목적하는 DNA 단편을 에세리키아 속에 속하는 세균의 염색체 DNA 라이브러리로부터 선택할 수 있다. 또는, GMP 신테타제를 암호화하는 DNA 단편은 공지된 뉴클레오타이드 서열에 기초하여 화학적으로 합성할 수 있다. 예를 들어, 에세리키아 콜라이의 guaA 유전자는 서열번호 9 및 10의 서열을 갖는 프라이머를 사용하여 클로닝할 수 있다.
추가로, 에세리키아 속에 속하는 세균 이외의 미생물로부터, GMP 신테타제와 동일한 기능을 갖는 단백질을 암호화하는 유전자는 상기 뉴클레오타이드 서열에 기초하여 수득할 수 있다.
바실러스 서브틸리스의 GMP 신테타제 유전자(guaA)의 예로는 서열번호 3의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것이 포함된다. 이러한 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된 아미노산 서열은 서열번호 4에 나타나 있다. 코리네박테리움 글루타미쿰의 GMP 신테타제 유전자(guaA)의 예로는 서열번호 5의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것이 포함된다. 이러한 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된 아미노산 서열은 서열번호 6에 나타나 있다.
코리네박테리움 암모니아게네스의 GMP 신테타제 유전자(guaA)의 예로는 서열번호 7의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것이 포함된다. 이러한 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된 아미노산 서열은 서열번호 8에 나타나 있다.
상기 기재된 바와 같이, guaA 유전자의 뉴클레오타이드 서열은 미생물이 속하는 속, 종 및/또는 균주에 따라 상이할 수 있기 때문에, guaA 유전자는 상기 유전자의 변이체일 수 있다.
guaA 유전자에 의해 암호화된 단백질은 GMP 신테타제 활성을 갖는 한 서열번호 2, 4, 6 또는 8의 전체 아미노산 서열과 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 더욱 바람직하게는 95% 이상, 특히 바람직하게는 98% 이상의 서열 동일성을 갖는 것일 수 있다. 아미노산 서열 사이 및 뉴클레오타이드 서열 사이의 동일성은, 예를 들어, BLAST, 칼린(Karlin) 및 알철(Altschul)에 의한 알고리즘[문헌 참조: Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 5873(1993)] 또는 피어슨(Pearson)에 의한 FASTA[문헌 참조: MethodsEnzymol., 183, 63 (1990)]를 사용하여 측정할 수 있다. 알고리즘 BLAST에 기초하여, BLASTN 및 BLASTX라 불리는 프로그램이 개발되었다(참조: http://www.ncbi.nlm.nih.gov).
본 발명에 사용된 guaA 유전자는 야생형 유전자에 한정되지 않으며, 암호화된 단백질의 기능, 즉 GMP 신테타제 활성이 손상되지 않는 한 서열번호 2, 4, 6 또는 8의 아미노산 서열을 갖지만 하나 또는 수개의 아미노산의 치환, 결실, 삽입, 부가 또는 역전을 포함하는 단백질을 암호화하는 돌연변이 또는 인공 변형 유전자일 수도 있다. 본원에서 용어 "하나 또는 수개"의 의미는 단백질의 공간 구조에서 아미노산 잔기의 위치 및/또는 유형에 따라 달라지나, 특히 이러한 용어는 1 내지 20, 바람직하게는 1 내지 10, 더욱 바람직하게는 1 내지 5를 의미한다. 치환은 바람직하게는 보존적 치환이며, 용어 "보존적 치환"은 치환 부위가 방향족 아미노산을 갖는 경우에 Phe, Trp 및 Tyr 사이의 상호 치환, 치환 부위가 소수성 아미노산을 갖는 경우에 Leu, Ile 및 Val 사이의 상호 치환, 치환 부위가 극성 아미노산을 갖는 경우에 Gln과 Asn 사이의 상호 치환, 치환 부위가 염기성 아미노산을 갖는 경우에 Lys, Arg 및 His 사이의 상호 치환, 치환 부위가 산성 아미노산을 갖는 경우에 Asp와 Glu 사이의 상호 치환, 및 치환 부위가 하이드록실 그룹을 갖는 아미노산을 갖는 경우에 Ser과 Thr 사이의 상호 치환을 의미한다. 반보존적 치환의 예로는 Ser 또는 Thr에 의한 Ala의 치환, Gln, His 또는 Lys에 의한 Arg의 치환, Glu, Gln, Lys, His 또는 Asp에 의한 Asn의 치환, Asn, Glu 또는 Gln에 의한 Asp의 치환, Ser 또는 Ala에 의한 Cys의 치환, Asn, Glu, Lys, His, Asp 또는 Arg에 의한 Gln의 치환, Gly, Asn, Gln, Lys 또는 Asp에 의한 Glu의 치환, Pro에 의한 Gly의 치환, Asn, Lys, Gln, Arg 또는 Tyr에 의한 His의 치환, Leu, Met, Val 또는 Phe에 의한 Ile의 치환, Ile, Met, Val 또는 Phe에 의한 Leu의 치환, Asn, Glu, Gln, His 또는 Arg에 의한 Lys의 치환, Ile, Leu, Val 또는 Phe에 의한 Met의 치환, Trp, Tyr, Met, Ile 또는 Leu에 의한 Phe의 치환, Thr 또는 Ala에 의한 Ser의 치환, Ser 또는 Ala에 의한 Thr의 치환, Phe 또는 Tyr에 의한 Trp의 치환, His, Phe 또는 Trp에 의한 Tyr의 치환, 및 Met, Ile 또는 Leu에 의한 Val의 치환이 포함된다. 상기 아미노산의 치환, 결실, 삽입, 부가, 역전 등의 예로는 또한 자연 발생 돌연변이(돌연변이체 및 변이체)에 기인하여 발생하는 것, 예를 들어, guaA 유전자를 갖는 미생물 중에서 개체 차이 및 종 차이에 기초한 것도 포함된다.
추가로, guaA 유전자는 서열번호 1, 3, 5 또는 7의 뉴클레오타이드 서열의 상보성 서열, 또는 DNA가 GMP 신테타제 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 서열로부터 제조될 수 있는 프로브와 엄격한 조건하에 하이브리드화할 수 있는 DNA일 수 있다. 본원에서 용어 "엄격한 조건"은 소위 특이적 하이브리드가 형성되나 비특이적 하이브리드가 형성되지 않는 조건을 의미한다. 이러한 조건을 수치로 명확히 표현하기는 곤란하지만, 예를 들어, 이들은 서로 높은 동일성, 예를 들어, 서로 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 더욱 바람직하게는 95% 이상, 특히 바람직하게는 98% 이상의 동일성을 갖는 DNA가 서로 하이브리드화되지만, 서로 상기 백분율 이하의 동일성을 갖는 DNA가 서로 하이브리드화되지 않는 조건이거나, 세척이 서던(Southern) 하이브리드화를 위한 통상의 세척 조건인 60℃에서의 1×SSC 및 0.1% SDS, 바람직하게는 60℃에서의 0.1×SSC 및 0.1% SDS, 더욱 바람직하게는 68℃에서의 0.1×SSC 및 0.1% SDS와 동일한 염 농도로 1회, 더욱 바람직하게는 2 또는 3회 수행되는 조건이다.
유전자의 변이체에 대한 상기 설명은 또한 후술되는 nagD 유전자, ushA 유전자, aphA 유전자 및 기타 유전자에 유사하게 적용가능하다.
미생물에 DNA의 도입은 씨. 티. 청 등(C. T. chung et al.)의 방법[문헌 참조: C. T. chung et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 2172-2175 (1989)], 디. 엠. 모리슨(D. M. Morrison)의 방법[문헌 참조: Methods in Enzymology, 68, 326 (1979)], 수용자 세균 세포의 염화칼슘 처리에 의해 DNA에 대한 투과성을 증가시키는 방법[문헌 참조: Mandel, M. and Higa, A., J. Mol. Biol., 53, 159 (1970)] 등으로 수행할 수 있다.
상기 기재된 유전자의 증폭 이외에, GMP 신테타제 유전자의 발현 수준은 또한 염색체 DNA 상에서 또는 강력한 발현 조절 서열을 갖는 플라스미드 상에서 발현 조절 서열, 예를 들어, GMP 신테타제 유전자의 프로모터를 대체함으로써 증강될 수 있다. 예를 들어, lac 프로모터, trp 프로모터, trc 프로모터 및 tac 프로모터는 강력한 프로모터인 것으로 공지되어 있다. 추가로, 국제 공개공보 제WO 00/18935호에 개시되어 있는 바와 같이, 유전자의 프로모터 영역에 수개의 뉴클레오타이드 치환을 도입하여 프로모터를 강력한 프로모터로 변경시킬 수도 있다. 이러한 프로모터 대체 또는 변경에 의해, GMP 신테타제 유전자의 발현은 증강되고, 따라서 GMP 신테타제 활성은 증가한다.
guaA 유전자의 발현 수준 증가는 노던 블롯(Northern blotting), RT-PCR 방법 등에 의해 검지될 수 있다.
nagD 유전자가 정상적으로 기능하지 않도록 상기 기재된 미생물을 변형시키는 방법을 지금부터 기재한다.
본 발명에서, "nagD 유전자가 정상적으로 기능하지 않도록 변형된"이란 nagD 유전자에 의해 암호화된 단백질의 활성을 감소 또는 제거시키거나, 당해 유전자의 전사를 감소 또는 제거시키거나, 당해 유전자의 해독 효율을 감소시킴을 의미한다.
에세리키아 콜라이의 nagD 유전자는 N-아세틸글루코사민의 동화와 관련된 nagBACD 오페론에 존재하며, 이러한 nagBACD 오페론 유전자의 발현은 배지에 N-아세틸글루코사민(세균 세포벽의 주성분을 구성하는 당의 일종임)을 첨가하여 유도되는 것으로 공지되어 있다[문헌 참조: Plumbridge JA., Mol. Micobiol. (1989) 3. 505-515]. 에세리키아 콜라이에서 NagD에 의해 암호화된 nagD 단백질은 보존적 구조 특징에 기초한 할로애시드 데할로게나제(Haloacid Dehalogenase; HAD) 계열에 속하는 것으로 공지되어 있으며, 생체내 실험에 기초하여, GMP 및 5'-우리딜산(우리딘-5'-모노포스페이트; 이하, "UMP"로도 언급됨)에 대한 뉴클레오티다제 활성을 갖는 것으로 보고되어 있다[문헌 참조: Tremblay LW., Biochemistry, (2006) 45. 1183-1193]. 그러나, 23종의 HAD 계열 단백질이 에세리키아 콜라이의 게놈 상에 존재하고 매우 광범위한 기질 특이성을 나타내기 때문에[문헌 참조: Kuznetsova et al., J. Biol. Chem., (2006) 281., 36149-36161], 세포에서 NagD 단백질의 생리학적 역할은 공지되어 있지 않다.
정상적으로 기능하지 않도록 하는 nagD 유전자의 변형은 다음 방법에 의해 달성될 수 있다. 예를 들어, 이는 유전자 재조합을 사용하는 상동 재조합 방법[문헌 참조: Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory press (1972); Matsuyama, S. and Mizushima, S., J. Bacteriol., 162, 1196 (1985)]에 의해 염색체 상의 nagD 유전자를 정상적으로 기능하지 않는 nagD 유전자(이하, "파괴형 nagD 유전자"로도 언급됨)로 대체함으로써 수행할 수 있다.
상동 재조합에서, 염색체 상의 서열과 상동인 서열을 갖는 플라스미드 등을 세균 세포에 도입함으로써, 상동성을 갖는 서열의 위치에서의 재조합을 특정 빈도로 유발시켜, 전체 도입된 플라스미드를 염색체에 통합한다. 이것이 염색체 상에서 상동성을 갖는 서열의 위치에서 추가의 재조합 이후에 이루어지는 경우, 플라스미드를 다시 제거하지만, 이때에 재조합이 일어나는 위치에 따라, 파괴된 유전자를 염색체 상에 고정시킬 수 있고 원래 정상 유전자를 염색체로부터 플라스미드와 함께 제거할 수 있다. 이러한 균주를 선택함으로써, 염색체 상의 정상 nagD 유전자를 파괴형 nagD 유전자로 대체시킨 균주를 수득할 수 있다.
상동 재조합을 사용하는 이러한 유전자 치환 방법의 예로는 선형 DNA를 사용하는 방법, 예를 들어, "레드 구동 통합(Red-driven integration)"[문헌 참조: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, vol.97, No.12, pp. 6640-6645]이라 불리는 방법이 λ 파지로부터 유래된 절제 시스템[문헌 참조: J. Bacteriol. 2002 Sep; 184(18):5200-3]과 배합되는 방법(국제 공개공보 제WO 2005/010175호 참조) 및 온도 민감성 복제 원점을 갖는 플라스미드를 사용하는 방법[문헌 참조: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, vol.97, No.12, pp. 6640-6645; 미국 특허 제6303383호; 및 일본 공개특허공보 제05-007491호]이 포함된다.
상기 상동 재조합을 사용하는 유전자 치환에 의한 부위 지시된 돌연변이도 또한 숙주에서 복제 능력을 갖지 않는 플라스미드를 사용함으로써 수행할 수 있다. 추가로, nagD의 파괴도 또한 약물 내성 유전자와 같은 마커 유전자가 삽입되어 대상 미생물에서 복제할 수 없는 nagD 유전자를 갖는 플라스미드를 사용함으로써 수행할 수 있다. 즉, 플라스미드로 형질전환시켜 수득되고 약물 내성 표현형을 나타내는 형질전환체는 염색체 DNA에 혼입된 마커 유전자를 갖는다. 이러한 마커 유전자가 양 말단에서의 nagD 유전자 서열과 염색체 상에서의 nagD 유전자 사이의 상동 재조합에 의해 혼입될 개연성이 크기 때문에, 유전자 파괴된 균주를 효율적으로 선택할 수 있다.
특히, 유전자 파괴에 사용된 파괴형 nagD 유전자는 제한 효소 분해 및 그 다음 연결에 의한 특정 영역(들) 유전자의 결실, 기타 DNA 단편(마커 유전자 등)의 유전자로의 삽입, 부위 지시된 돌연변이[문헌 참조: Kramer, W. and Frits, H. J., Methods in Enzymology, 154, 350 (1987)] 및/또는 화학 약품, 예를 들어, 차아염소산 나트륨, 하이드록실아민 및/또는 기타에 의한 처리[문헌 참조: Shortle, D. and Nathans, D., Proc., Natl., Acad., Sci., U.S.A., 75, 270 (1978)]에 의해 암호화 영역, 프로모터 영역 및/또는 기타의 뉴클레오타이드 서열(들)에서 하나 이상의 뉴클레오타이드 치환, 결실, 삽입, 부가 및/또는 역전을 유발하여 암호화된 nagD 단백질의 활성을 감소 또는 제거하고/하거나 nagD 유전자의 전사를 감소 또는 제거함으로써 수득할 수 있다.
nagD 유전자의 서열은 공지되어 있으며, 이러한 유전자는 당해 서열에 기초하여 PCR, 하이브리드화 등에 의해 용이하게 수득할 수 있다. 에세리키아 콜라이의 nagD 유전자의 예로는 서열번호 12의 아미노산 서열을 암호화하는 것이 포함된다. nagD 유전자는, 예를 들어, 서열번호 13 및 14의 프라이머를 사용하여 PCR에 의해 에세리키아 콜라이의 염색체 DNA로부터 수득할 수 있다.
기타 미생물의 nagD 유전자도 또한 공지된 서열 또는 상기 에세리키아 콜라이의 nagD 유전자와의 서열 상동성에 기초하여 수득할 수 있으며, 미생물 변형에 사용할 수 있다.
nagD 유전자는 변형 대상 미생물의 염색체 상의 nagD 유전자와 상동 재조합을 유발하기에 충분한 서열 동일성을 가지며, 예를 들어, 이는 서열번호 12의 전체 아미노산 서열과 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 특히 바람직하게는 95% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 암호화할 수 있다.
대상 유전자의 파괴는 서던 블롯 또는 PCR에 의해 염색체 상의 상기 유전자를 분석함으로써 확인할 수 있다.
활성 NagD 단백질이 생산되지 않는 돌연변이 균주는 또한 미생물에 자외선을 조사하거나 돌연변이 처리에 일반적으로 사용되는 돌연변이제, 예를 들어, N-메틸-N'-니트로소구아니딘(NTG) 또는 아질산으로 미생물을 처리함으로써도 수득할 수 있다.
본 발명의 방법에 사용된 세균은 바람직하게는 ushA 유전자 및/또는 aphA 유전자가 정상적으로 기능하지 않도록 추가로 변형된다. 이들 유전자에 돌연변이(들)를 갖는 이러한 돌연변이 균주 또는 재조합 균주는 상기 유전자에 의해 암호화된 5'-뉴클레오티다제의 활성이 감소 또는 제거되거나 상기 유전자의 전사가 감소 또는 제거되도록 이들 유전자를 변형시킴으로써 수득할 수 있다. 이러한 돌연변이 균주 또는 재조합 균주는 nagD 유전자가 정상적으로 기능하지 않는 상기 돌연변이 균주 또는 재조합 균주에서와 동일한 방법으로 수득할 수 있다.
ushA 유전자의 서열은 공지되어 있으며, 이는 당해 서열에 기초하여 PCR, 하이브리드화 등에 의해 용이하게 수득할 수 있다. 에세리키라 콜라이의 ushA 유전자의 예로는 서열번호 16의 아미노산 서열을 암호화하는 것이 포함된다.
기타 미생물의 ushA 유전자도 또한 공지된 서열 또는 상기 에세리키아 콜라이의 ushA 유전자와의 서열 상동성에 기초하여 수득할 수 있으며, 미생물 변형에 사용할 수 있다.
ushA 유전자는 변형 대상 미생물의 염색체 상의 ushA 유전자와 상동 재조합을 유발하기에 충분한 서열 동일성을 가지며, 예를 들어, 이는 서열번호 16의 전체 아미노산 서열과 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 특히 바람직하게는 95% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 암호화할 수 있다.
aphA 유전자의 서열은 공지되어 있으며, 이는 당해 서열에 기초하여 PCR, 하이브리드화 등에 의해 용이하게 수득할 수 있다. 에세리키라 콜라이의 aphA 유전자의 예로는 서열번호 18의 아미노산 서열을 암호화하는 것이 포함된다.
기타 미생물의 aphA 유전자도 또한 공지된 서열 또는 상기 에세리키아 콜라이의 aphA 유전자와의 서열 상동성에 기초하여 수득할 수 있으며, 미생물 변형에 사용할 수 있다.
aphA 유전자는 변형 대상 미생물의 염색체 상의 aphA 유전자와 상동 재조합을 유발하기에 충분한 서열 동일성을 가지며, 예를 들어, 이는 서열번호 18의 전체 아미노산 서열과 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 특히 바람직하게는 95% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 암호화할 수 있다.
본 발명은 신규한 미생물로서 GMP 신테타제 활성이 guaA 유전자의 발현을 증가시킴으로써 증강되고 nagD 유전자가 정상적으로 기능하지 않도록 변형된, 크산틸산을 5'-구아닐산으로 전환시키는 능력을 갖는 미생물을 제공하며, 여기서, 상기 미생물은, 증가된 guaB 유전자 발현을 갖지 않는 미생물이다. 이러한 미생물은 바람직하게는 ushA 유전자 및/또는 aphA 유전자가 정상적으로 기능하지 않도록 추가로 변형된다.
<II> GMP의 생산방법
GMP는 nagD 유전자가 정상적으로 기능하지 않고 GMP 신테타제 활성이 증가되도록 변형된 상기 미생물을 XMP와 반응시켜 XMP를 GMP로 전환시킴으로써 수득할 수 있다.
미생물 배양의 경우, 모든 탄소원은 상기 미생물이 이를 동화할 수 있는 한 사용할 수 있으며, 이의 예로는 탄수화물, 예를 들어, 글루코오스, 프룩토오스, 수크로오스, 당밀, 블랙스트랩 당밀 및 전분 가수분해물; 알콜, 예를 들어, 에탄올, 글리세린 및 소르비톨; 유기산, 예를 들어, 피루브산, 락트산 및 아세트산; 아미노산, 예를 들어, 글리신, 알라닌, 글루탐산 및 아스파르트산이 포함된다. 사용될 수 있는 질소원의 예로는 암모니아; 각종 무기 및 유기 암모니아 염, 예를 들어, 염화암모늄, 황산 암모늄, 질산 암모늄, 탄산 암모늄, 아세트산 암모늄 및 인산 암모늄; 우레아; 각종 아미노산; 펩톤; NZ 아민; 고기 추출물; 효모 추출물; 옥수수 침지액; 카제인 가수분해물; 및 어분 및 이의 분해물이 포함된다. 사용될 수 있는 무기 물질의 예로는 제1 인산 칼륨, 제2 인산 칼륨, 황산 마그네슘, 인산 마그네슘, 염화나트륨, 황산 제1철, 황산 망간, 황산 아연 및 탄산 칼슘이 포함된다. 사용된 미생물이 생장을 위해 특정 영양소, 예를 들어, 아미노산, 핵산 및/또는 비타민을 필요로 하는 경우, 적합한 양의 이러한 물질을 배지에 첨가한다.
배양은 pH 5.0 내지 8.5 및 15 내지 45℃의 온도에서 약 5 내지 72시간 동안의 호기성 조건 하에 적절한 조건으로 수행할 수 있다. pH를 조절하기 위해, 무기 또는 유기, 산성 또는 알칼리성 물질, 암모니아 가스 등을 사용할 수 있다.
XMP의 GMP로의 전환은 XMP를 함유하는 반응 용액에 미생물의 배양 생성물을 직접 접종하거나 원심분리 후 미생물 세포만을 접종하거나 적절한 용액 중의 미생물 세포의 현탁액을 접종함으로써 수행할 수 있다. 기질인 XMP의 농도는 충분한 양의 GMP가 수득될 수 있는 농도인 한 제한되지 않으며, 바람직하게는 1 내지 200mM의 범위이다.
GMP를 생산하기 위한 본 발명의 방법에서, 상기 미생물의 가공 세포는 가공된 후 사용할 수 있다. 가공 미생물 세포의 예로는 세포를 아크릴아미드, 카라기닌 등으로 고정시킴으로써 생산된 고정 미생물 세포가 포함된다.
미생물을 전환 반응 용액에 유지시키기 위해 첨가되는 탄소원, 질소원 및 무기 물질로서, 미생물 배양에 사용되는 상기 기재된 바와 동일한 종류의 탄소원, 질소원 및 무기 물질을 사용할 수 있다. 사용된 미생물이 생장을 위해 특정 영양소, 예를 들어, 아미노산, 핵산 및/또는 비타민을 필요로 하는 경우, 적합한 양의 이러한 물질을 반응 용액에 첨가한다.
반응 용액은 바람직하게는 뉴클레오타이드의 세포 투과성을 활성화하기 위해 유기 용매로 보충한다.
뉴클레오타이드를 위한 막 투과성 활성화제로서 사용될 수 있는 유기 용매의 예로는, 크실렌, 톨루엔, 벤젠, 지방산 알콜 및 에틸 아세테이트가 포함되며, 이들은 바람직하게는 일반적으로 0.1 내지 30ml/L의 농도로 사용한다. 반응은 pH 5.0 내지 8.5 및 15 내지 45℃의 온도에서 약 1시간 내지 7일 동안의 호기성 조건 하에 적절한 조건으로 수행할 수 있다. pH를 조절하기 위해, 무기 또는 유기, 산성 또는 알칼리성 물질, 암모니아 가스 등을 사용할 수 있다. 원료로서 사용된 XMP의 관점에서, 화학적으로 합성된 XMP, 시판용 XMP, 발효에 의해 생산된 XMP 등을 사용할 수 있다.
반응 용액으로부터 GMP의 회수는 일반적으로 공지된 방법, 예를 들어, 이온교환 수지 방법 및 침전 방법의 조합에 의해 수행할 수 있다.
실시예
지금부터, 실시예를 참조하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다.
실시예 1
<1-1> JM109 균주로부터 유래된 nagD 유전자 파괴된 균주의 제작
먼저, DNA 클로닝을 위한 숙주로서 종종 사용되는 에세리키아 콜라이 JM109 균주를 친주로서 사용하여, NagD 단백질을 생산할 수 없는 균주를 제작하였다. NagD 단백질은 nagD 유전자(GenBank Accession No. X14135; 서열번호 11)에 의해 암호화된다.
nagD 유전자의 결실은 다첸코(Datsenko) 및 와너(Wanner)에 의해 최초로 개발된 "레드 구동 통합"이라 불리는 방법[문헌 참조: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, vol. 97, No. 12, pp. 6640-6645] 및 λ 파지로부터 유래된 절제 시스템[문헌 참조: J. Bacteriol. 2002 Sep; 184(18): 5200-3, Interactions between integrase and excisionase in the phage lambda excisive nucleoprotein complex, Cho EH, Gumport RI, Gardner JF]에 의해 수행하였다. "레드 구동 상호작용" 방법에 의해, 유전자 파괴된 균주는 5' 영역에서 대상 유전자의 부분 및 3' 영역에서 항생제 내성 유전자의 부분을 갖도록 설계된 합성 올리고뉴클레오타이드를 프라이머로서 사용함으로써 수득된 PCR 생성물을 사용하여 1단계로 제작할 수 있다. 상기 방법으로 λ 파지로부터 유래한 절제 시스템을 추가로 배합함으로써, 유전자 파괴된 균주에 혼입된 항생제 내성 유전자를 제거할 수 있다.
PCR용 주형으로서, 플라스미드 pMW118-attL-Cm-attR을 사용하였다. pMW118-attL-Cm-attR(국제 공개공보 제WO 2006/078039호 참조)은 attL-cat-attR의 순서로 pMW118(TAKARA BIO INC.에 의해 제조됨)에 attL 및 attR 유전자(λ 파지의 부착 부위임) 및 cat 유전자(항생제 내성 유전자임)의 삽입에 의해 제조된 플라스미드이다.
PCR은 프라이머의 3' 말단에서 attL 및 attR의 양 말단에 상응하는 서열과 프라이머의 5' 말단에서 대상 유전자인 nagD 유전자의 부분에 상응하는 서열을 갖는 서열번호 19 및 20의 합성 올리고뉴클레오타이드를 프라이머로서 사용하여 수행하였다.
증폭된 PCR 생성물을 아가로오스 겔로 정제하였고, 온도 민감성 복제 능력을 갖는 플라스미드 pKD46을 함유하는 에세리키아 콜라이 JM109 균주에 정제된 PCR 생성물을 전기천공에 의해 도입하였다. 플라스미드 pKD46[문헌 참조: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, vol. 97, No. 12, p6640-6645]은 아라비노오스 유도성 ParaB 프로모터에 의해 제어된 λ레드 상동 재조합을 위한 레드 재조합효소(γ, β 및 엑소 유전자)를 암호화하는 유전자를 갖는 λ 파지의 총 2154개의 뉴클레오타이드의 DNA 단편(GenBank/EMBL Accession No. J02459; 31088번 내지 33241번)을 함유한다. 플라스미드 pKD46은 JM109 균주의 염색체에 PCR 생성물을 혼입하는데 필요하다.
전기천공을 위한 적격 세포를 다음과 같이 제조하였다. 즉, 30℃에서 밤새 100mg/L의 암피실린으로 보충된 LB 배지에서 배양된 에세리키아 콜라이 JM109 균주를 암피실린(20mg/L) 및 L-아라비노오스(1mM)로 보충된 SOB 배지[문헌 참조: Molecular cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Sambrook, J. et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)] 5mL로 100배 희석하였다. 수득된 희석 세포를, OD600이 0.6에 도달할 때까지, 호기 조건하에 30℃에서 생장시키고 100배 농축시킨 후 10% 글리세롤로 3회 세척하여 이를 전기천공에 사용하였다. 전기천공은 수득된 적격 세포 70μl 및 약 PCR 생성물 100ng을 사용하여 수행하였다. 전기천공 후, SOC 배지[문헌 참조: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Sambrook, J. et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)] 1mL을 세포에 첨가하고, 세포를 37℃에서 2.5시간 동안 배양한 후, 37℃에서 Cm(클로람페니콜)(25mg/L)으로 보충된 L-한천 배지 상에서 평판 배양하고 Cm 내성 재조합 세포를 선택하였다. 이후, pKD46 플라스미드를 제거하기 위해, 2회의 계대를 42℃에서 Cm으로 보충된 L-한천 배지 상에서 수행하고, 수득된 콜로니의 암피실린 내성을 분석하여 pKD46 결핍 암피실린 민감성 균주를 수득하였다.
수득된 돌연변이 균주에서 nagD 유전자의 결실을 PCR로 확인하였다. 수득된 nagD 결핍 균주를 JM109ΔnagD::att-cat 균주라고 명명하였다.
그 다음, nagD 유전자에 도입된 att-cat 유전자를 제거하기 위해, 상기 pMW-intxis-ts를 보조 플라스미드로서 사용하였다. pMW-intxis-ts는 λ 파지의 통합효소 암호화 유전자(Int) 및 절제효소 암호화 유전자(Xis)를 가지며 온도 민감성 복제 능력을 갖는 플라스미드이다. pMW-intxis-ts가 도입되는 경우, 이는 염색체 상의 attL 및 attR을 인식하고 attL과 attR 사이의 유전자를 절제하기 위해 재조합을 유발하고, 이로써 attL 또는 attR 서열만이 염색체 상에 잔존하는 구조를 달성한다.
상기한 바와 같이 수득된 JM109ΔnagD::att-cat 균주의 적격 세포를 통상의 방법에 따라 제조하고 보조 플라스미드 pMW-intxis-ts로 형질전환시킨 후, 50mg/L의 암피실린으로 보충된 L-한천 배지 상에서 30℃에서 평판 배양하고 암피실린 내성 균주을 선택하였다.
이후, pMW-intxis-ts 플라스미드를 제거하기 위해, 2회의 계대를 42℃에서 L-한천 배지에서 수행하고, 수득된 콜로니의 클로람페니콜 내성을 분석하여 att-cat 결핍 nagD 파괴된 균주 및 pMW-intxis-ts인 클로람페니콜 및 암피실린 민감성 균주를 수득하였다. 당해 균주를 JM109ΔnagD라고 명명하였다.
<1-2> GMP 신테타제 발현 플라스미드 pSTV29-Ptac-guaA의 제작 및 당해 플라스미드의 JM109 균주 및 JM109ΔnagD 균주로의 도입
GMP 신테타제 발현 플라스미드 pSTV29-Ptac-guaA를 다음과 같이 제작하였다. 서열번호 9 및 서열번호 10의 프라이머를 사용하여 PCR에 의해 에세리키아 콜라이의 guaA 유전자를 증폭시켰다. 증폭된 단편을 정제하고 양 말단에서 형성된 제한 부위를 EcoRI 및 PstI로 분해시켰다. EcoRI 및 PstI로 유사하게 분해된 pKK223-3(GenBank Accession No. M77749)에 분해된 단편을 연결하고, guaA 유전자가 tac 프라이머의 매우 근접한 하류에 혼입되는 플라스미드 pKK223-guaA를 선택하였다. 수득된 플라스미드를 BamHI 및 HindIII으로 분해시켜 tac 프로모터를 함유하도록 하였다. BamHI 및 HindIII으로 유사하게 분해된 pSTV29에 분해된 단편을 연결하고, guaA 유전자가 tac 프라이머의 매우 근접한 하류에 혼입되는 플라스미드 pSTV29-Ptac-guaA를 선택하였다. 이를 JM109 균주 및 상기 JM109ΔnagD 균주에 도입하여 JM109/pSTV29-Ptac-guaA 균주 및 JM109ΔnagD/pSTV29-Ptac-guaA 균주를 각각 수득하였다.
<1-3> JM109/pSTV29-Ptac-guaA 균주 및 JM109ΔnagD/pSTV29-Ptac-guaA 균주를 사용한 XMP의 GMP로의 전환
XMP로부터 GMP로의 전환 반응을 상기 균주에 대하여 평가하였다. 다음은 세균 세포의 제조방법, 반응 방법, 반응 용액의 조성물 및 XMP로부터 GMP로의 전환 반응의 평가 분석 방법이다.
[세균 세포의 제조방법]
JM109/pSTV29-Ptac-guaA 균주 및 JM109ΔnagD/pSTV29-Ptac-guaA 균주를 LB 배지 플레이트 상에 균일하게 도포한 후, 이를 37℃에서 밤새 배양하였다. 다음날, 세균 세포를, 플레이트 상의 세포의 총량의 1/32에 상응하는 양으로 LB 배지 120ml를 각각 함유하는 500ml 사카구치(Sakaguchi) 플라스크에 접종하고 37℃에서 밤새 배양하였다. LB 배지 600ml에 상응하는 배양액을 원심분리한 후, 수득된 세균 세포를 반응 용액 60ml에 사용하였다.
[반응 방법]
상기 LB 배지 600ml에 상응하는 배양된 세균 세포를 약시(medicine spoon)로 회수하고 후술되는 반응 용액 60ml에 접종하여 반응을 개시하였다. pH 7.2가 유지되도록 수성 암모니아를 첨가하면서 반응을 42℃에서 수행하였다.
[반응 용액의 조성]
25mM XMP
50g/L 글루코오스
9.2g/L 나트륨 헥사메타포스페이트
5g/L MgSO4·7H2O
10g/L KH2PO4
3ml/L 크실렌
[분석 방법]
시간에 따라, 반응 용액 500μl를 샘플링하고 KOH로 희석시켜 반응을 정지시켰다. 반응이 정지된 반응 용액을 여과하고 용액 10μl를 HPLC 분석하였다. 분석 조건은 다음과 같다.
칼럼: Asahipak GS-220HQ(직경 7.6mm, 30cm)
용리액: 0.2M NaH2PO4(pH 3.98)
온도: 55℃
유속: 0.6ml/분
검출: 자외선(254nm) 흡광도
결과를 도 1에 나타냈다. JM109/pSTV29-Ptac-guaA 균주는 GMP를 생산한 것으로 나타났으나, GMP는 높은 분해 활성으로 인해 전혀 축적되지 않았다(GMP <0.06g/L). 한편, JM109ΔnagD/pSTV29-Ptac-guaA 균주는 반응 용액에서 반응 2시간째에 GMP를 최대 약 1.7g/L 축적시킨 것으로 나타났다.
실시예 2
<2-1> JM109 균주 및 JM109ΔnagD 균주로부터 유래된 ushA 유전자 파괴된 균주의 제작
실시예 1의 <1-1>에서 수득된 JM109 균주 및 JM109ΔnagD 균주를 친주로서 사용하여, UshA를 생산할 수 없는 균주를 제작하였다. UshA는 ushA 유전자(GenBank Accession No. X03895; 서열번호 14)에 의해 암호화된다. nagD 유전자의 파괴를 위한 상기 방법과 동일한 방법으로, 서열번호 21 및 22의 프라이머를 ushA 유전자의 파괴를 위한 프라이머로서 사용하여 ushA 유전자를 파괴하였다. 이렇게 함으로써, JM109ΔushA 균주 및 JM109ΔushAΔnagD 균주를 수득하였다.
<2-2> GMP 신테타제 발현 플라스미드 pSTV29-Ptac-guaA의 JM109ΔushA 균주 및 JM109ΔushAΔnagD 균주로의 도입
실시예 1에서 기재된 GMP 신테타제 발현 플라스미드 pSTV29-Ptac-guaA를 JM109ΔushA 균주 및 JM109ΔushAΔnagD 균주에 도입하여 JM109ΔushA/pSTV29-Ptac-guaA 균주 및 JM109ΔushAΔnagD/pSTV29-Ptac-guaA 균주를 각각 수득하였다.
<2-3> JM109ΔushA/pSTV29-Ptac-guaA 균주 및 JM109ΔushAΔnagD/pSTV29-Ptac-guaA 균주를 사용하여 XMP의 GMP로의 전환
XMP로부터 GMP로의 전환 반응을 상기 균주에 대하여 평가하였다. 실시예 1의 <1-3>과 동일한 방법으로 평가를 수행하였다.
결과를 도 2에 나타냈다. 반응 용액에서, JM109ΔushA/pSTV29-Ptac-guaA 균주는 반응 2시간째에 GMP를 최대 약 9.7g/L 축적시켰고 JM109ΔushAΔnagD/pSTV29-Ptac-guaA 균주는 반응 2시간째에 GMP를 최대 약 10.3g/L 축적시킨 것으로 나타났다.
실시예 3
<3-1> JM109ΔushA 균주 및 JM109ΔushAΔnagD 균주로부터 유래된 aphA 유전자 파괴된 균주의 제작
실시예 2의 <2-1>에서 수득된 JM109ΔushA 균주 및 JM109ΔushAΔnagD 균주를 친주로서 사용하여, AphA를 생산할 수 없는 균주를 제작하였다. AphA는 aphA 유전자(GenBank Accession No. X86971; 서열번호 17)에 의해 암호화된다. nagD 유전자의 파괴를 위한 상기 방법과 동일한 방법으로, 서열번호 23 및 24의 프라이머를 aphA 유전자의 파괴를 위한 프라이머로서 사용하여 aphA 유전자를 파괴하였다. 이렇게 함으로써, JM109ΔushAΔaphA 균주 및 JM109ΔushAΔaphAΔnagD 균주를 수득하였다.
<3-2> GMP 신테타제 발현 플라스미드 pSTV29-Ptac-guaA의 JM109ΔushAΔaphA 균주 및 JM109ΔushAΔaphAΔnagD 균주로의 도입
실시예 1에서 기재된 GMP 신테타제 발현 플라스미드 pSTV29-Ptac-guaA를 JM109ΔushAΔaphA 균주 및 JM109ΔushAΔaphAΔnagD 균주에 도입하여 JM109ΔushAΔaphA/pSTV29-Ptac-guaA 균주 및 JM109ΔushAΔaphAΔnagD/pSTV29-Ptac-guaA 균주를 각각 수득하였다.
<3-3> JM109ΔushAΔaphA/pSTV29-Ptac-guaA 균주 및 JM109ΔushAΔaphAΔnagD/pSTV29-Ptac-guaA 균주를 사용한 XMP의 GMP로의 전환
XMP로부터 GMP로의 전환 반응을 상기 균주에 대하여 평가하였다. 반응 용액 중의 XMP 농도가 50mM인 것을 제외하고는 실시예 1의 <1-3>과 동일한 방법으로 평가를 수행하였다.
결과를 도 3에 나타냈다. 반응 용액에서, JM109ΔushAΔaphA/pSTV29-Ptac-guaA 균주는 반응 5시간째에 GMP를 최대 약 23.3g/L 축적시켰고 JM109ΔushAΔaphAΔnagD/pSTV29-Ptac-guaA 균주는 반응 4시간째에 GMP를 최대 약 26.9g/L 축적시킨 것으로 나타났다.
실시예 4
<4-1> JM109 균주 및 JM109ΔnagD 균주로부터 유래된 aphA 유전자 파괴된 균주의 제작
실시예 1의 <1-1>에서 수득된 JM109 균주 및 JM109ΔnagD 균주를 친주로서 사용하여, AphA를 생산할 수 없는 균주를 제작하였다. 실시예 3에서 나타낸 바와 같이, 서열번호 23 및 24의 프라이머를 aphA 유전자의 파괴를 위한 프라이머로서 사용하여 aphA 유전자를 파괴하였다. 이렇게 함으로써, JM109ΔaphA 균주 및 JM109ΔaphAΔnagD 균주를 수득하였다.
<4-2> GMP 신테타제 발현 플라스미드 pSTV29-Ptac-guaA의 JM109ΔaphA 균주 및 JM109ΔaphAΔnagD 균주로의 도입
실시예 1에서 기재된 GMP 신테타제 발현 플라스미드 pSTV29-Ptac-guaA를 JM109ΔaphA 균주 및 JM109ΔaphAΔnagD 균주에 도입하여 JM109ΔaphA/pSTV29-Ptac-guaA 균주 및 JM109ΔaphAΔnagD/pSTV29-Ptac-guaA 균주를 각각 수득하였다.
실시예 1 내지 3에서와 같이, XMP의 GMP로의 전환을 이들 균주에 대하여 평가할 수 있으며, GMP의 축적량 증가를 확인할 수 있다.
본 발명에 따라, 식품 시즈닝 및 약제 및 이들의 원료로서 유용한 GMP를 효율적으로 생산할 수 있다.
[서열 목록의 설명]
서열번호 1 에세리키아 콜라이 GMP 신테타제(GMPS) 유전자(guaA)의 뉴클레오타이드 서열
서열번호 2 에세리키아 콜라이 GMPS의 아미노산 서열
서열번호 3 바실러스 서브틸리스 GMPS 유전자(guaA)의 뉴클레오타이드 서열
서열번호 4 바실러스 서브틸리스 GMPS의 아미노산 서열
서열번호 5 코리네박테리움 글루타미쿰 GMPS 유전자(guaA)의 뉴클레오타이드 서열
서열번호 6 코리네박테리움 글루타미쿰 GMPS의 아미노산 서열
서열번호 7 코리네박테리움 암모니아게네스 GMPS 유전자(guaA)의 뉴클레오타이드 서열
서열번호 8 코리네박테리움 암모니아게네스 GMPS의 아미노산 서열
서열번호 9 에세리키아 콜라이 guaA 유전자를 클로닝하기 위한 프라이머의 뉴클레오타이드 서열
서열번호 10 에세리키아 콜라이 guaA 유전자를 클로닝하기 위한 프라이머의 뉴클레오타이드 서열
서열번호 11 에세리키아 콜라이 nagD 유전자의 뉴클레오타이드 서열
서열번호 12 에세리키아 콜라이 NagD의 아미노산 서열
서열번호 13 에세리키아 콜라이 nagD 유전자를 클로닝하기 위한 프라이머의 뉴클레오타이드 서열
서열번호 14 에세리키아 콜라이 nagD 유전자를 클로닝하기 위한 프라이머의 뉴클레오타이드 서열
서열번호 15 에세리키아 콜라이 ushA 유전자의 뉴클레오타이드 서열
서열번호 16 에세리키아 콜라이 UshA의 아미노산 서열
서열번호 17 에세리키아 콜라이 aphA 유전자의 뉴클레오타이드 서열
서열번호 18 에세리키아 콜라이 AphA의 아미노산 서열
서열번호 19 에세리키아 콜라이 nagD 유전자의 파괴를 위한 프라이머의 뉴클레오타이드 서열
서열번호 20 에세리키아 콜라이 nagD 유전자의 파괴를 위한 프라이머의 뉴클레오타이드 서열
서열번호 21 에세리키아 콜라이 ushA 유전자의 파괴를 위한 프라이머의 뉴클레오타이드 서열
서열번호 22 에세리키아 콜라이 ushA 유전자의 파괴를 위한 프라이머의 뉴클레오타이드 서열
서열번호 23 에세리키아 콜라이 aphA 유전자의 파괴를 위한 프라이머의 뉴클레오타이드 서열
서열번호 24 에세리키아 콜라이 aphA 유전자의 파괴를 위한 프라이머의 뉴클레오타이드 서열
<110> Ajinomoto Co., Inc.
<120> Method for producing 5'-guanylic acid
<130> OP-C9325
<150> JP 2009-185920
<151> 2009-08-10
<160> 24
<170> KopatentIn 1.71
<210> 1
<211> 1578
<212> DNA
<213> Escherichia coli
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(1575)
<400> 1
atg acg gaa aac att cat aag cat cgc atc ctc att ctg gac ttc ggt 48
Met Thr Glu Asn Ile His Lys His Arg Ile Leu Ile Leu Asp Phe Gly
1 5 10 15
tct cag tac act caa ctg gtt gcg cgc cgc gtg cgt gag ctg ggt gtt 96
Ser Gln Tyr Thr Gln Leu Val Ala Arg Arg Val Arg Glu Leu Gly Val
20 25 30
tac tgc gaa ctg tgg gcg tgg gat gtg aca gaa gca caa att cgt gac 144
Tyr Cys Glu Leu Trp Ala Trp Asp Val Thr Glu Ala Gln Ile Arg Asp
35 40 45
ttc aat cca agc ggc att att ctt tcc ggc ggc ccg gaa agt act act 192
Phe Asn Pro Ser Gly Ile Ile Leu Ser Gly Gly Pro Glu Ser Thr Thr
50 55 60
gaa gaa aac agt ccg cgt gcg ccg cag tat gtc ttt gaa gca ggc gta 240
Glu Glu Asn Ser Pro Arg Ala Pro Gln Tyr Val Phe Glu Ala Gly Val
65 70 75 80
ccg gta ttc ggc gtt tgc tat ggc atg cag acc atg gca atg cag ttg 288
Pro Val Phe Gly Val Cys Tyr Gly Met Gln Thr Met Ala Met Gln Leu
85 90 95
ggc ggt cac gtt gaa gcc tct aac gaa cgt gaa ttt ggc tac gcg cag 336
Gly Gly His Val Glu Ala Ser Asn Glu Arg Glu Phe Gly Tyr Ala Gln
100 105 110
gtt gaa gtc gta aac gac agc gca ctg gtt cgc ggt atc gaa gat gcg 384
Val Glu Val Val Asn Asp Ser Ala Leu Val Arg Gly Ile Glu Asp Ala
115 120 125
ctg acc gca gac ggt aaa ccg ctg ctc gat gtc tgg atg agc cac ggc 432
Leu Thr Ala Asp Gly Lys Pro Leu Leu Asp Val Trp Met Ser His Gly
130 135 140
gat aaa gtt acc gct att ccg tcc gac ttc atc acc gta gcc agc acc 480
Asp Lys Val Thr Ala Ile Pro Ser Asp Phe Ile Thr Val Ala Ser Thr
145 150 155 160
gaa agc tgc ccg ttt gcc att atg gct aac gaa gaa aaa cgc ttc tat 528
Glu Ser Cys Pro Phe Ala Ile Met Ala Asn Glu Glu Lys Arg Phe Tyr
165 170 175
ggc gta cag ttc cac ccg gaa gtg act cat acc cgc cag ggt atg cgc 576
Gly Val Gln Phe His Pro Glu Val Thr His Thr Arg Gln Gly Met Arg
180 185 190
atg ctg gag cgt ttt gtg cgt gat atc tgc cag tgt gaa gcc ctg tgg 624
Met Leu Glu Arg Phe Val Arg Asp Ile Cys Gln Cys Glu Ala Leu Trp
195 200 205
acg cca gcg aaa att atc gac gat gct gta gct cgc atc cgc gag cag 672
Thr Pro Ala Lys Ile Ile Asp Asp Ala Val Ala Arg Ile Arg Glu Gln
210 215 220
gta ggc gac gat aaa gtc atc ctc ggc ctc tct ggt ggt gtg gat tcc 720
Val Gly Asp Asp Lys Val Ile Leu Gly Leu Ser Gly Gly Val Asp Ser
225 230 235 240
tcc gta acc gca atg ctg ctg cac cgc gct atc ggt aaa aac ctg act 768
Ser Val Thr Ala Met Leu Leu His Arg Ala Ile Gly Lys Asn Leu Thr
245 250 255
tgc gta ttc gtc gac aac ggc ctg ctg cgc ctc aac gaa gca gag cag 816
Cys Val Phe Val Asp Asn Gly Leu Leu Arg Leu Asn Glu Ala Glu Gln
260 265 270
gtt ctg gat atg ttt ggc gat cac ttt ggt ctt aac att gtt cac gta 864
Val Leu Asp Met Phe Gly Asp His Phe Gly Leu Asn Ile Val His Val
275 280 285
ccg gca gaa gat cgc ttc ctg tca gcg ctg gct ggc gaa aac gat ccg 912
Pro Ala Glu Asp Arg Phe Leu Ser Ala Leu Ala Gly Glu Asn Asp Pro
290 295 300
gaa gca aaa cgt aaa atc atc ggt cgc gtt ttc gtt gaa gta ttc gat 960
Glu Ala Lys Arg Lys Ile Ile Gly Arg Val Phe Val Glu Val Phe Asp
305 310 315 320
gaa gaa gcg ctg aaa ctg gaa gac gtg aag tgg ctg gcg cag ggc acc 1008
Glu Glu Ala Leu Lys Leu Glu Asp Val Lys Trp Leu Ala Gln Gly Thr
325 330 335
atc tac cct gac gtt atc gaa tct gcg gcg tct gca acc ggt aaa gca 1056
Ile Tyr Pro Asp Val Ile Glu Ser Ala Ala Ser Ala Thr Gly Lys Ala
340 345 350
cac gtc atc aaa tct cac cac aac gtg ggc ggc ctg ccg aaa gag atg 1104
His Val Ile Lys Ser His His Asn Val Gly Gly Leu Pro Lys Glu Met
355 360 365
aag atg ggc ctg gtt gaa ccg ctg aaa gag ctg ttc aaa gac gaa gtg 1152
Lys Met Gly Leu Val Glu Pro Leu Lys Glu Leu Phe Lys Asp Glu Val
370 375 380
cgt aag att ggt ctg gag ctg ggc ctg ccg tac gac atg ctg tac cgt 1200
Arg Lys Ile Gly Leu Glu Leu Gly Leu Pro Tyr Asp Met Leu Tyr Arg
385 390 395 400
cac ccg ttc ccg gga cca ggc ctt ggc gtt cgt gtt ctg ggt gaa gtg 1248
His Pro Phe Pro Gly Pro Gly Leu Gly Val Arg Val Leu Gly Glu Val
405 410 415
aag aaa gag tac tgt gac ctg ctg cgc cgt gct gac gcc atc ttc att 1296
Lys Lys Glu Tyr Cys Asp Leu Leu Arg Arg Ala Asp Ala Ile Phe Ile
420 425 430
gaa gaa ctg cgt aaa gcg gac ctg tac gac aaa gtc agc cag gcg ttc 1344
Glu Glu Leu Arg Lys Ala Asp Leu Tyr Asp Lys Val Ser Gln Ala Phe
435 440 445
act gtg ttc ctg ccg gta cgt tcc gtt ggc gta atg ggc gat ggt cgt 1392
Thr Val Phe Leu Pro Val Arg Ser Val Gly Val Met Gly Asp Gly Arg
450 455 460
aag tat gac tgg gtt gtc tct ctg cgt gct gtc gaa acc atc gac ttt 1440
Lys Tyr Asp Trp Val Val Ser Leu Arg Ala Val Glu Thr Ile Asp Phe
465 470 475 480
atg acc gca cac tgg gcg cat ctg ccg tac gat ttc ctc ggt cgc gtt 1488
Met Thr Ala His Trp Ala His Leu Pro Tyr Asp Phe Leu Gly Arg Val
485 490 495
tcc aac cgc att atc aat gaa gtg aac ggt att tcc cgc gtg gtg tat 1536
Ser Asn Arg Ile Ile Asn Glu Val Asn Gly Ile Ser Arg Val Val Tyr
500 505 510
gac atc agc ggc aag ccg cca gct acc att gag tgg gaa tga 1578
Asp Ile Ser Gly Lys Pro Pro Ala Thr Ile Glu Trp Glu
515 520 525
<210> 2
<211> 525
<212> PRT
<213> Escherichia coli
<400> 2
Met Thr Glu Asn Ile His Lys His Arg Ile Leu Ile Leu Asp Phe Gly
1 5 10 15
Ser Gln Tyr Thr Gln Leu Val Ala Arg Arg Val Arg Glu Leu Gly Val
20 25 30
Tyr Cys Glu Leu Trp Ala Trp Asp Val Thr Glu Ala Gln Ile Arg Asp
35 40 45
Phe Asn Pro Ser Gly Ile Ile Leu Ser Gly Gly Pro Glu Ser Thr Thr
50 55 60
Glu Glu Asn Ser Pro Arg Ala Pro Gln Tyr Val Phe Glu Ala Gly Val
65 70 75 80
Pro Val Phe Gly Val Cys Tyr Gly Met Gln Thr Met Ala Met Gln Leu
85 90 95
Gly Gly His Val Glu Ala Ser Asn Glu Arg Glu Phe Gly Tyr Ala Gln
100 105 110
Val Glu Val Val Asn Asp Ser Ala Leu Val Arg Gly Ile Glu Asp Ala
115 120 125
Leu Thr Ala Asp Gly Lys Pro Leu Leu Asp Val Trp Met Ser His Gly
130 135 140
Asp Lys Val Thr Ala Ile Pro Ser Asp Phe Ile Thr Val Ala Ser Thr
145 150 155 160
Glu Ser Cys Pro Phe Ala Ile Met Ala Asn Glu Glu Lys Arg Phe Tyr
165 170 175
Gly Val Gln Phe His Pro Glu Val Thr His Thr Arg Gln Gly Met Arg
180 185 190
Met Leu Glu Arg Phe Val Arg Asp Ile Cys Gln Cys Glu Ala Leu Trp
195 200 205
Thr Pro Ala Lys Ile Ile Asp Asp Ala Val Ala Arg Ile Arg Glu Gln
210 215 220
Val Gly Asp Asp Lys Val Ile Leu Gly Leu Ser Gly Gly Val Asp Ser
225 230 235 240
Ser Val Thr Ala Met Leu Leu His Arg Ala Ile Gly Lys Asn Leu Thr
245 250 255
Cys Val Phe Val Asp Asn Gly Leu Leu Arg Leu Asn Glu Ala Glu Gln
260 265 270
Val Leu Asp Met Phe Gly Asp His Phe Gly Leu Asn Ile Val His Val
275 280 285
Pro Ala Glu Asp Arg Phe Leu Ser Ala Leu Ala Gly Glu Asn Asp Pro
290 295 300
Glu Ala Lys Arg Lys Ile Ile Gly Arg Val Phe Val Glu Val Phe Asp
305 310 315 320
Glu Glu Ala Leu Lys Leu Glu Asp Val Lys Trp Leu Ala Gln Gly Thr
325 330 335
Ile Tyr Pro Asp Val Ile Glu Ser Ala Ala Ser Ala Thr Gly Lys Ala
340 345 350
His Val Ile Lys Ser His His Asn Val Gly Gly Leu Pro Lys Glu Met
355 360 365
Lys Met Gly Leu Val Glu Pro Leu Lys Glu Leu Phe Lys Asp Glu Val
370 375 380
Arg Lys Ile Gly Leu Glu Leu Gly Leu Pro Tyr Asp Met Leu Tyr Arg
385 390 395 400
His Pro Phe Pro Gly Pro Gly Leu Gly Val Arg Val Leu Gly Glu Val
405 410 415
Lys Lys Glu Tyr Cys Asp Leu Leu Arg Arg Ala Asp Ala Ile Phe Ile
420 425 430
Glu Glu Leu Arg Lys Ala Asp Leu Tyr Asp Lys Val Ser Gln Ala Phe
435 440 445
Thr Val Phe Leu Pro Val Arg Ser Val Gly Val Met Gly Asp Gly Arg
450 455 460
Lys Tyr Asp Trp Val Val Ser Leu Arg Ala Val Glu Thr Ile Asp Phe
465 470 475 480
Met Thr Ala His Trp Ala His Leu Pro Tyr Asp Phe Leu Gly Arg Val
485 490 495
Ser Asn Arg Ile Ile Asn Glu Val Asn Gly Ile Ser Arg Val Val Tyr
500 505 510
Asp Ile Ser Gly Lys Pro Pro Ala Thr Ile Glu Trp Glu
515 520 525
<210> 3
<211> 1542
<212> DNA
<213> Bacillus subtilis
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(1539)
<400> 3
atg aca aag tta gtg aat gaa atg att ctt gtc ctt gat ttc ggc agt 48
Met Thr Lys Leu Val Asn Glu Met Ile Leu Val Leu Asp Phe Gly Ser
1 5 10 15
cag tat aac cag ctg att aca cgc cgt atc cgt gaa ttc ggt gtt tac 96
Gln Tyr Asn Gln Leu Ile Thr Arg Arg Ile Arg Glu Phe Gly Val Tyr
20 25 30
agc gag ctg cat cca cat aca ttg acg gct gaa gaa att aaa aaa atg 144
Ser Glu Leu His Pro His Thr Leu Thr Ala Glu Glu Ile Lys Lys Met
35 40 45
aat cca aaa gga att att tta tcc ggc ggt cca aac agt gtg tat gat 192
Asn Pro Lys Gly Ile Ile Leu Ser Gly Gly Pro Asn Ser Val Tyr Asp
50 55 60
gaa aac tct ttc cgc tgt gac gag aaa atc ttc gag ctt gat att cct 240
Glu Asn Ser Phe Arg Cys Asp Glu Lys Ile Phe Glu Leu Asp Ile Pro
65 70 75 80
gtt ttg gga att tgc tac ggc atg cag ctg atg act cat tac ctt ggc 288
Val Leu Gly Ile Cys Tyr Gly Met Gln Leu Met Thr His Tyr Leu Gly
85 90 95
ggt aaa gtt gaa gcg gca agc cag cgt gaa tac gga aaa gca aac atc 336
Gly Lys Val Glu Ala Ala Ser Gln Arg Glu Tyr Gly Lys Ala Asn Ile
100 105 110
cgc atc gaa ggc aca cct gat ttg ttc aga gat ctt ccg aat gaa caa 384
Arg Ile Glu Gly Thr Pro Asp Leu Phe Arg Asp Leu Pro Asn Glu Gln
115 120 125
gtg gtt tgg atg agc cac ggc gat ttg gtt gta gaa gtt cct gaa ggc 432
Val Val Trp Met Ser His Gly Asp Leu Val Val Glu Val Pro Glu Gly
130 135 140
ttc act gtt gac gcg aca agc cat cac tgc ccg aac tca gca atg agc 480
Phe Thr Val Asp Ala Thr Ser His His Cys Pro Asn Ser Ala Met Ser
145 150 155 160
aaa gcg gac aaa aaa tgg tat ggc gtt cag ttc cac ccg gaa gtg cgc 528
Lys Ala Asp Lys Lys Trp Tyr Gly Val Gln Phe His Pro Glu Val Arg
165 170 175
cac tct gaa tac ggc aat gat ctt ctg aaa aac ttt gta ttc ggt gtt 576
His Ser Glu Tyr Gly Asn Asp Leu Leu Lys Asn Phe Val Phe Gly Val
180 185 190
tgc gaa tgc gaa ggc gaa tgg tca atg gag aac ttt atc gaa atc gaa 624
Cys Glu Cys Glu Gly Glu Trp Ser Met Glu Asn Phe Ile Glu Ile Glu
195 200 205
atg caa aaa atc cgt gaa acg gtc gga gac aaa cag gtt ctt tgc gcg 672
Met Gln Lys Ile Arg Glu Thr Val Gly Asp Lys Gln Val Leu Cys Ala
210 215 220
cta agc ggc ggc gtt gat tcc tct gtt gtt gct gtt ttg att cat aaa 720
Leu Ser Gly Gly Val Asp Ser Ser Val Val Ala Val Leu Ile His Lys
225 230 235 240
gcg atc ggc gac cag ctg act tgt atc ttt gta gac cat ggt ctt ctc 768
Ala Ile Gly Asp Gln Leu Thr Cys Ile Phe Val Asp His Gly Leu Leu
245 250 255
cgt aaa ggc gaa gct gag ggt gtt atg aaa aca ttc agc gaa ggc ttt 816
Arg Lys Gly Glu Ala Glu Gly Val Met Lys Thr Phe Ser Glu Gly Phe
260 265 270
aac atg aat gtg att aaa gta gac gca aaa gat cga ttc tta aac aaa 864
Asn Met Asn Val Ile Lys Val Asp Ala Lys Asp Arg Phe Leu Asn Lys
275 280 285
cta aaa ggc gtt tct gat cct gag caa aaa cgc aaa atc atc ggt aat 912
Leu Lys Gly Val Ser Asp Pro Glu Gln Lys Arg Lys Ile Ile Gly Asn
290 295 300
gaa ttc att tac gtg ttt gat gat gaa gcg gac aag ctc aaa ggc atc 960
Glu Phe Ile Tyr Val Phe Asp Asp Glu Ala Asp Lys Leu Lys Gly Ile
305 310 315 320
gac tac ctt gca caa ggt acg ctt tac aca gat atc atc gag agc ggt 1008
Asp Tyr Leu Ala Gln Gly Thr Leu Tyr Thr Asp Ile Ile Glu Ser Gly
325 330 335
aca gca acg gcg caa acg atc aaa tct cac cac aat gtc ggc gga ctt 1056
Thr Ala Thr Ala Gln Thr Ile Lys Ser His His Asn Val Gly Gly Leu
340 345 350
cct gaa gac atg cag ttt gag ctg atc gag ccg tta aat acg ctc ttc 1104
Pro Glu Asp Met Gln Phe Glu Leu Ile Glu Pro Leu Asn Thr Leu Phe
355 360 365
aaa gac gaa gtg cgc gcg ctt ggc aca gag ctc ggc att ccg gat gaa 1152
Lys Asp Glu Val Arg Ala Leu Gly Thr Glu Leu Gly Ile Pro Asp Glu
370 375 380
atc gta tgg cgt cag ccg ttc cca gga ccg gga ctc gga atc cgc gtt 1200
Ile Val Trp Arg Gln Pro Phe Pro Gly Pro Gly Leu Gly Ile Arg Val
385 390 395 400
ctt ggc gaa gta aca gaa gaa aaa ctt gaa atc gtt cgt gaa tca gat 1248
Leu Gly Glu Val Thr Glu Glu Lys Leu Glu Ile Val Arg Glu Ser Asp
405 410 415
gca atc ttg cgt gaa gaa att gca aat cac ggc tta gag cgt gat atc 1296
Ala Ile Leu Arg Glu Glu Ile Ala Asn His Gly Leu Glu Arg Asp Ile
420 425 430
tgg caa tac ttc act gtt ctt cct gac atc cgc agc gtt ggt gtt atg 1344
Trp Gln Tyr Phe Thr Val Leu Pro Asp Ile Arg Ser Val Gly Val Met
435 440 445
ggt gac gca aga aca tat gat tac aca atc gga atc cgc gcc gtt aca 1392
Gly Asp Ala Arg Thr Tyr Asp Tyr Thr Ile Gly Ile Arg Ala Val Thr
450 455 460
tca atc gac ggc atg aca tct gac tgg gcg cgt atc ccg tgg gat gtg 1440
Ser Ile Asp Gly Met Thr Ser Asp Trp Ala Arg Ile Pro Trp Asp Val
465 470 475 480
ctt gaa gtc att tcg aca cgt atc gta aac gaa gtg aag cac att aac 1488
Leu Glu Val Ile Ser Thr Arg Ile Val Asn Glu Val Lys His Ile Asn
485 490 495
cgc gtg gtg tat gat att aca agt aag ccg cct gcg acg att gag tgg 1536
Arg Val Val Tyr Asp Ile Thr Ser Lys Pro Pro Ala Thr Ile Glu Trp
500 505 510
gaa taa 1542
Glu
<210> 4
<211> 513
<212> PRT
<213> Bacillus subtilis
<400> 4
Met Thr Lys Leu Val Asn Glu Met Ile Leu Val Leu Asp Phe Gly Ser
1 5 10 15
Gln Tyr Asn Gln Leu Ile Thr Arg Arg Ile Arg Glu Phe Gly Val Tyr
20 25 30
Ser Glu Leu His Pro His Thr Leu Thr Ala Glu Glu Ile Lys Lys Met
35 40 45
Asn Pro Lys Gly Ile Ile Leu Ser Gly Gly Pro Asn Ser Val Tyr Asp
50 55 60
Glu Asn Ser Phe Arg Cys Asp Glu Lys Ile Phe Glu Leu Asp Ile Pro
65 70 75 80
Val Leu Gly Ile Cys Tyr Gly Met Gln Leu Met Thr His Tyr Leu Gly
85 90 95
Gly Lys Val Glu Ala Ala Ser Gln Arg Glu Tyr Gly Lys Ala Asn Ile
100 105 110
Arg Ile Glu Gly Thr Pro Asp Leu Phe Arg Asp Leu Pro Asn Glu Gln
115 120 125
Val Val Trp Met Ser His Gly Asp Leu Val Val Glu Val Pro Glu Gly
130 135 140
Phe Thr Val Asp Ala Thr Ser His His Cys Pro Asn Ser Ala Met Ser
145 150 155 160
Lys Ala Asp Lys Lys Trp Tyr Gly Val Gln Phe His Pro Glu Val Arg
165 170 175
His Ser Glu Tyr Gly Asn Asp Leu Leu Lys Asn Phe Val Phe Gly Val
180 185 190
Cys Glu Cys Glu Gly Glu Trp Ser Met Glu Asn Phe Ile Glu Ile Glu
195 200 205
Met Gln Lys Ile Arg Glu Thr Val Gly Asp Lys Gln Val Leu Cys Ala
210 215 220
Leu Ser Gly Gly Val Asp Ser Ser Val Val Ala Val Leu Ile His Lys
225 230 235 240
Ala Ile Gly Asp Gln Leu Thr Cys Ile Phe Val Asp His Gly Leu Leu
245 250 255
Arg Lys Gly Glu Ala Glu Gly Val Met Lys Thr Phe Ser Glu Gly Phe
260 265 270
Asn Met Asn Val Ile Lys Val Asp Ala Lys Asp Arg Phe Leu Asn Lys
275 280 285
Leu Lys Gly Val Ser Asp Pro Glu Gln Lys Arg Lys Ile Ile Gly Asn
290 295 300
Glu Phe Ile Tyr Val Phe Asp Asp Glu Ala Asp Lys Leu Lys Gly Ile
305 310 315 320
Asp Tyr Leu Ala Gln Gly Thr Leu Tyr Thr Asp Ile Ile Glu Ser Gly
325 330 335
Thr Ala Thr Ala Gln Thr Ile Lys Ser His His Asn Val Gly Gly Leu
340 345 350
Pro Glu Asp Met Gln Phe Glu Leu Ile Glu Pro Leu Asn Thr Leu Phe
355 360 365
Lys Asp Glu Val Arg Ala Leu Gly Thr Glu Leu Gly Ile Pro Asp Glu
370 375 380
Ile Val Trp Arg Gln Pro Phe Pro Gly Pro Gly Leu Gly Ile Arg Val
385 390 395 400
Leu Gly Glu Val Thr Glu Glu Lys Leu Glu Ile Val Arg Glu Ser Asp
405 410 415
Ala Ile Leu Arg Glu Glu Ile Ala Asn His Gly Leu Glu Arg Asp Ile
420 425 430
Trp Gln Tyr Phe Thr Val Leu Pro Asp Ile Arg Ser Val Gly Val Met
435 440 445
Gly Asp Ala Arg Thr Tyr Asp Tyr Thr Ile Gly Ile Arg Ala Val Thr
450 455 460
Ser Ile Asp Gly Met Thr Ser Asp Trp Ala Arg Ile Pro Trp Asp Val
465 470 475 480
Leu Glu Val Ile Ser Thr Arg Ile Val Asn Glu Val Lys His Ile Asn
485 490 495
Arg Val Val Tyr Asp Ile Thr Ser Lys Pro Pro Ala Thr Ile Glu Trp
500 505 510
Glu
<210> 5
<211> 1572
<212> DNA
<213> Corynebacterium glutamicum
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(1569)
<400> 5
gtg agc ctt cag aca aat cat cgc cca gta ctc gtc gtt gac ttc ggc 48
Val Ser Leu Gln Thr Asn His Arg Pro Val Leu Val Val Asp Phe Gly
1 5 10 15
gca cag tac gcg cag ctg atc gca cgt cgt gtg cgt gag gcc ggc atc 96
Ala Gln Tyr Ala Gln Leu Ile Ala Arg Arg Val Arg Glu Ala Gly Ile
20 25 30
tac tcc gaa gtc atc ccg cac acc gcc acc gca gac gat gtg cgc gct 144
Tyr Ser Glu Val Ile Pro His Thr Ala Thr Ala Asp Asp Val Arg Ala
35 40 45
aaa aat gca gca gcc ctc gtc ctt tcc ggt ggc cca tcc tcc gtg tat 192
Lys Asn Ala Ala Ala Leu Val Leu Ser Gly Gly Pro Ser Ser Val Tyr
50 55 60
gcc gag gga gca cca tcc ctt gac gct gag att ctt gat ctc gga ttg 240
Ala Glu Gly Ala Pro Ser Leu Asp Ala Glu Ile Leu Asp Leu Gly Leu
65 70 75 80
cca gta ttt ggc att tgc tac ggc ttc caa gcc atg acc cac gcg ctt 288
Pro Val Phe Gly Ile Cys Tyr Gly Phe Gln Ala Met Thr His Ala Leu
85 90 95
ggt ggc acc gtt gcc aac acc ggt aag cgc gaa tac gga cgc acc gac 336
Gly Gly Thr Val Ala Asn Thr Gly Lys Arg Glu Tyr Gly Arg Thr Asp
100 105 110
atc aac gtt gcc ggt ggc gtc ctc cac gaa ggc ctc gaa gcc tgc cac 384
Ile Asn Val Ala Gly Gly Val Leu His Glu Gly Leu Glu Ala Cys His
115 120 125
aag gtg tgg atg agc cac ggc gac gcc gtc tct gaa gcc cca gaa ggt 432
Lys Val Trp Met Ser His Gly Asp Ala Val Ser Glu Ala Pro Glu Gly
130 135 140
ttc gta gtc acc gcg tcc tcc gaa ggt gcg cct gtc gca gct ttc gaa 480
Phe Val Val Thr Ala Ser Ser Glu Gly Ala Pro Val Ala Ala Phe Glu
145 150 155 160
aac aag gaa cgc aaa atg gct ggc gtg cag tac cac cca gag gta ttg 528
Asn Lys Glu Arg Lys Met Ala Gly Val Gln Tyr His Pro Glu Val Leu
165 170 175
cac tca cca cac ggc cag gca gtt ctg acc cgc ttc ctc act gag atc 576
His Ser Pro His Gly Gln Ala Val Leu Thr Arg Phe Leu Thr Glu Ile
180 185 190
gca ggt cta gag cag aac tgg acc gca gca aac atc gct gaa gaa ctc 624
Ala Gly Leu Glu Gln Asn Trp Thr Ala Ala Asn Ile Ala Glu Glu Leu
195 200 205
atc gaa aag gtc cgc gag cag atc ggc gaa gat ggc cgc gct att tgt 672
Ile Glu Lys Val Arg Glu Gln Ile Gly Glu Asp Gly Arg Ala Ile Cys
210 215 220
ggc cta tcc ggt ggt gtg gac tcc gct gtt gcc ggt gct ttg gtg cag 720
Gly Leu Ser Gly Gly Val Asp Ser Ala Val Ala Gly Ala Leu Val Gln
225 230 235 240
cgc gcc att ggt gac cgt ttg acc tgt gtc ttt gtt gac cac ggt ctg 768
Arg Ala Ile Gly Asp Arg Leu Thr Cys Val Phe Val Asp His Gly Leu
245 250 255
ctg cgt gcc ggt gag cgc gag cag gtg gaa aaa gac ttc gtc gca gca 816
Leu Arg Ala Gly Glu Arg Glu Gln Val Glu Lys Asp Phe Val Ala Ala
260 265 270
acc ggc gcc aag ctg gtt acc gtt gat gag cgc cag gca ttc cta tcc 864
Thr Gly Ala Lys Leu Val Thr Val Asp Glu Arg Gln Ala Phe Leu Ser
275 280 285
aag ctg gcc gga gtt acc gaa cca gaa gca aag cgc aag gct atc ggc 912
Lys Leu Ala Gly Val Thr Glu Pro Glu Ala Lys Arg Lys Ala Ile Gly
290 295 300
gct gag ttc atc cgc tcc ttc gag cgc gca gtt gcc ggt gtg ctg gaa 960
Ala Glu Phe Ile Arg Ser Phe Glu Arg Ala Val Ala Gly Val Leu Glu
305 310 315 320
gaa gct cca gaa ggt tcc acc gtg gac ttc ctg gtt cag ggc acc ctg 1008
Glu Ala Pro Glu Gly Ser Thr Val Asp Phe Leu Val Gln Gly Thr Leu
325 330 335
tac cca gac gtc gtg gaa tcc ggt ggt gga tct ggt acc gca aac atc 1056
Tyr Pro Asp Val Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Gly Thr Ala Asn Ile
340 345 350
aag agc cac cac aac gtc ggt gga ctg cca gac gat gtg gaa ttc aag 1104
Lys Ser His His Asn Val Gly Gly Leu Pro Asp Asp Val Glu Phe Lys
355 360 365
ctt gtt gag cca ctg cgt gac ctc ttc aaa gac gaa gtc cgt gcc gtt 1152
Leu Val Glu Pro Leu Arg Asp Leu Phe Lys Asp Glu Val Arg Ala Val
370 375 380
ggc cgt gaa ctt ggc ctg cct gag gaa atc gtt ggc cgc cag cca ttc 1200
Gly Arg Glu Leu Gly Leu Pro Glu Glu Ile Val Gly Arg Gln Pro Phe
385 390 395 400
cca gga cca gga ctt ggt atc cgc atc atc ggt gaa gtc acc gaa gat 1248
Pro Gly Pro Gly Leu Gly Ile Arg Ile Ile Gly Glu Val Thr Glu Asp
405 410 415
cgc cta gaa acc ctc cgc cac gct gac ctg atc gcc cgc acc gag ctc 1296
Arg Leu Glu Thr Leu Arg His Ala Asp Leu Ile Ala Arg Thr Glu Leu
420 425 430
acc gaa gcc gga ctt gac ggc gtg atc tgg cag tgc cca gta gtc ctc 1344
Thr Glu Ala Gly Leu Asp Gly Val Ile Trp Gln Cys Pro Val Val Leu
435 440 445
ctg gca gat gtc cgc tct gtt ggt gtt caa ggc gat ggc cgc acc tac 1392
Leu Ala Asp Val Arg Ser Val Gly Val Gln Gly Asp Gly Arg Thr Tyr
450 455 460
gga cac cca atc gtg ctg cgc cca gtg tct tcc gaa gac gca atg acc 1440
Gly His Pro Ile Val Leu Arg Pro Val Ser Ser Glu Asp Ala Met Thr
465 470 475 480
gcc gac tgg acc cgc ctg cca tac gag gtt ctg gag aag atc tcc acc 1488
Ala Asp Trp Thr Arg Leu Pro Tyr Glu Val Leu Glu Lys Ile Ser Thr
485 490 495
cgc atc acc aac gaa gtt cca gat gtg aac cgc gtg gtg ctg gac gta 1536
Arg Ile Thr Asn Glu Val Pro Asp Val Asn Arg Val Val Leu Asp Val
500 505 510
acc tcc aag cca cca gga acc atc gaa tgg gag tag 1572
Thr Ser Lys Pro Pro Gly Thr Ile Glu Trp Glu
515 520
<210> 6
<211> 523
<212> PRT
<213> Corynebacterium glutamicum
<400> 6
Val Ser Leu Gln Thr Asn His Arg Pro Val Leu Val Val Asp Phe Gly
1 5 10 15
Ala Gln Tyr Ala Gln Leu Ile Ala Arg Arg Val Arg Glu Ala Gly Ile
20 25 30
Tyr Ser Glu Val Ile Pro His Thr Ala Thr Ala Asp Asp Val Arg Ala
35 40 45
Lys Asn Ala Ala Ala Leu Val Leu Ser Gly Gly Pro Ser Ser Val Tyr
50 55 60
Ala Glu Gly Ala Pro Ser Leu Asp Ala Glu Ile Leu Asp Leu Gly Leu
65 70 75 80
Pro Val Phe Gly Ile Cys Tyr Gly Phe Gln Ala Met Thr His Ala Leu
85 90 95
Gly Gly Thr Val Ala Asn Thr Gly Lys Arg Glu Tyr Gly Arg Thr Asp
100 105 110
Ile Asn Val Ala Gly Gly Val Leu His Glu Gly Leu Glu Ala Cys His
115 120 125
Lys Val Trp Met Ser His Gly Asp Ala Val Ser Glu Ala Pro Glu Gly
130 135 140
Phe Val Val Thr Ala Ser Ser Glu Gly Ala Pro Val Ala Ala Phe Glu
145 150 155 160
Asn Lys Glu Arg Lys Met Ala Gly Val Gln Tyr His Pro Glu Val Leu
165 170 175
His Ser Pro His Gly Gln Ala Val Leu Thr Arg Phe Leu Thr Glu Ile
180 185 190
Ala Gly Leu Glu Gln Asn Trp Thr Ala Ala Asn Ile Ala Glu Glu Leu
195 200 205
Ile Glu Lys Val Arg Glu Gln Ile Gly Glu Asp Gly Arg Ala Ile Cys
210 215 220
Gly Leu Ser Gly Gly Val Asp Ser Ala Val Ala Gly Ala Leu Val Gln
225 230 235 240
Arg Ala Ile Gly Asp Arg Leu Thr Cys Val Phe Val Asp His Gly Leu
245 250 255
Leu Arg Ala Gly Glu Arg Glu Gln Val Glu Lys Asp Phe Val Ala Ala
260 265 270
Thr Gly Ala Lys Leu Val Thr Val Asp Glu Arg Gln Ala Phe Leu Ser
275 280 285
Lys Leu Ala Gly Val Thr Glu Pro Glu Ala Lys Arg Lys Ala Ile Gly
290 295 300
Ala Glu Phe Ile Arg Ser Phe Glu Arg Ala Val Ala Gly Val Leu Glu
305 310 315 320
Glu Ala Pro Glu Gly Ser Thr Val Asp Phe Leu Val Gln Gly Thr Leu
325 330 335
Tyr Pro Asp Val Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Gly Thr Ala Asn Ile
340 345 350
Lys Ser His His Asn Val Gly Gly Leu Pro Asp Asp Val Glu Phe Lys
355 360 365
Leu Val Glu Pro Leu Arg Asp Leu Phe Lys Asp Glu Val Arg Ala Val
370 375 380
Gly Arg Glu Leu Gly Leu Pro Glu Glu Ile Val Gly Arg Gln Pro Phe
385 390 395 400
Pro Gly Pro Gly Leu Gly Ile Arg Ile Ile Gly Glu Val Thr Glu Asp
405 410 415
Arg Leu Glu Thr Leu Arg His Ala Asp Leu Ile Ala Arg Thr Glu Leu
420 425 430
Thr Glu Ala Gly Leu Asp Gly Val Ile Trp Gln Cys Pro Val Val Leu
435 440 445
Leu Ala Asp Val Arg Ser Val Gly Val Gln Gly Asp Gly Arg Thr Tyr
450 455 460
Gly His Pro Ile Val Leu Arg Pro Val Ser Ser Glu Asp Ala Met Thr
465 470 475 480
Ala Asp Trp Thr Arg Leu Pro Tyr Glu Val Leu Glu Lys Ile Ser Thr
485 490 495
Arg Ile Thr Asn Glu Val Pro Asp Val Asn Arg Val Val Leu Asp Val
500 505 510
Thr Ser Lys Pro Pro Gly Thr Ile Glu Trp Glu
515 520
<210> 7
<211> 1575
<212> DNA
<213> Corynebacterium ammoniagenes
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(1572)
<400> 7
gtg act caa cct gca aca act ccg cgc cca gtc ctc gtg gtg gat ttc 48
Val Thr Gln Pro Ala Thr Thr Pro Arg Pro Val Leu Val Val Asp Phe
1 5 10 15
ggt gcc caa tac gca cag ctg att gct cgt cgc gta cgt gag gca tcg 96
Gly Ala Gln Tyr Ala Gln Leu Ile Ala Arg Arg Val Arg Glu Ala Ser
20 25 30
att tac tcc gag gta gtc cca cat tcc gcc acc gtt aaa gag att aaa 144
Ile Tyr Ser Glu Val Val Pro His Ser Ala Thr Val Lys Glu Ile Lys
35 40 45
gct aaa aac cct gca gct ttg att ttg tcc ggt ggc ccg tcc tct gtt 192
Ala Lys Asn Pro Ala Ala Leu Ile Leu Ser Gly Gly Pro Ser Ser Val
50 55 60
tat gcc gat ggc gcc ccg caa tta aag cct gaa ctg ctc gag ctt ggt 240
Tyr Ala Asp Gly Ala Pro Gln Leu Lys Pro Glu Leu Leu Glu Leu Gly
65 70 75 80
gtg cca gtc ttt ggc atc tgc tac ggc ttc caa gcc atg aac cat gct 288
Val Pro Val Phe Gly Ile Cys Tyr Gly Phe Gln Ala Met Asn His Ala
85 90 95
ttg ggt ggc aac gtt gcg caa acc ggt gac cgt gaa tac ggc cgc acc 336
Leu Gly Gly Asn Val Ala Gln Thr Gly Asp Arg Glu Tyr Gly Arg Thr
100 105 110
gaa atc acc cat acc ggt ggt gtg ctg cac gac ggc tta gaa gaa aac 384
Glu Ile Thr His Thr Gly Gly Val Leu His Asp Gly Leu Glu Glu Asn
115 120 125
cac aag gtc tgg atg tcc cac ggt gat gct gtg gat aag gca cct gag 432
His Lys Val Trp Met Ser His Gly Asp Ala Val Asp Lys Ala Pro Glu
130 135 140
ggc ttt acc gtg acc gca tcg tcg gct ggt gcg ccg gtt gca gcg atg 480
Gly Phe Thr Val Thr Ala Ser Ser Ala Gly Ala Pro Val Ala Ala Met
145 150 155 160
gaa tgc gtg gcc aag caa atg gct ggt gtg caa tac cac ccc gag gtt 528
Glu Cys Val Ala Lys Gln Met Ala Gly Val Gln Tyr His Pro Glu Val
165 170 175
atg cat tcc cca cac gga cag gaa gta ctc gtt cgc ttc ctc acc gag 576
Met His Ser Pro His Gly Gln Glu Val Leu Val Arg Phe Leu Thr Glu
180 185 190
gta gca ggg cta gag cag acc tgg acc tcg gca aat att gcg cag cag 624
Val Ala Gly Leu Glu Gln Thr Trp Thr Ser Ala Asn Ile Ala Gln Gln
195 200 205
ctt atc gat gat gtc cgc gcg caa atc ggc cct gaa ggc cgc gct att 672
Leu Ile Asp Asp Val Arg Ala Gln Ile Gly Pro Glu Gly Arg Ala Ile
210 215 220
tgt ggc ctg tcg ggc ggc gtg gac tcc gca gtc gct gca gcg ctc gtg 720
Cys Gly Leu Ser Gly Gly Val Asp Ser Ala Val Ala Ala Ala Leu Val
225 230 235 240
cag cgc gcc att ggc gac cgt ttg acc tgt gtg ttc gtg gac cac ggt 768
Gln Arg Ala Ile Gly Asp Arg Leu Thr Cys Val Phe Val Asp His Gly
245 250 255
ctg ctg cgc gcc ggt gag cgt gag cag gta gaa aag gac ttc gtg gct 816
Leu Leu Arg Ala Gly Glu Arg Glu Gln Val Glu Lys Asp Phe Val Ala
260 265 270
tcg act ggt gcg aag ctg att acc gcg cat gaa gct gat gct ttc ttg 864
Ser Thr Gly Ala Lys Leu Ile Thr Ala His Glu Ala Asp Ala Phe Leu
275 280 285
tct aag ctc gcc ggt gtt acc gat cct gag gct aag cgc aag gct atc 912
Ser Lys Leu Ala Gly Val Thr Asp Pro Glu Ala Lys Arg Lys Ala Ile
290 295 300
ggc gcg gaa ttc atc cgt tcc ttt gag cgt gct gtg gca cag gct ttg 960
Gly Ala Glu Phe Ile Arg Ser Phe Glu Arg Ala Val Ala Gln Ala Leu
305 310 315 320
gaa gaa tct cct gaa gac tcc aca gtg gac ttc ctg gtc cag ggc acc 1008
Glu Glu Ser Pro Glu Asp Ser Thr Val Asp Phe Leu Val Gln Gly Thr
325 330 335
ttg tat ccg gat gtg gtt gaa tcc ggc ggc ggt gac ggc acc gca aat 1056
Leu Tyr Pro Asp Val Val Glu Ser Gly Gly Gly Asp Gly Thr Ala Asn
340 345 350
atc aag tcc cac cac aat gtt ggc ggc ctg cca gac gat gtc gaa ttc 1104
Ile Lys Ser His His Asn Val Gly Gly Leu Pro Asp Asp Val Glu Phe
355 360 365
gaa ctc gtc gag cca cta cgc ctg ctg ttt aag gac gaa gtc cgt gcc 1152
Glu Leu Val Glu Pro Leu Arg Leu Leu Phe Lys Asp Glu Val Arg Ala
370 375 380
gtc ggc cgc gag ctc ggc ctg cct gag gaa atc gtt gcc cgc cag cca 1200
Val Gly Arg Glu Leu Gly Leu Pro Glu Glu Ile Val Ala Arg Gln Pro
385 390 395 400
ttc cct ggc cct ggc cta ggc atc cgc atc atc ggt gaa gtc acc gag 1248
Phe Pro Gly Pro Gly Leu Gly Ile Arg Ile Ile Gly Glu Val Thr Glu
405 410 415
gag cgt cta gaa atc ctg cgt caa gca gac ctg att gcg cgt acc gag 1296
Glu Arg Leu Glu Ile Leu Arg Gln Ala Asp Leu Ile Ala Arg Thr Glu
420 425 430
ctg acc aac gct ggc ctc gac ggt gat atc tgg cag tgc cca gtc gta 1344
Leu Thr Asn Ala Gly Leu Asp Gly Asp Ile Trp Gln Cys Pro Val Val
435 440 445
ctg ctt gcc gat gtc cgc tcc gtc gga gtc caa ggc gac ggc cgc acc 1392
Leu Leu Ala Asp Val Arg Ser Val Gly Val Gln Gly Asp Gly Arg Thr
450 455 460
tac ggc cac cca atc gtg ctg cgc cca gtg tca tcc gag gat gcc atg 1440
Tyr Gly His Pro Ile Val Leu Arg Pro Val Ser Ser Glu Asp Ala Met
465 470 475 480
acc gcc gac tgg acc cgc gtt cct tac gac gtc cta gag aaa atc tcc 1488
Thr Ala Asp Trp Thr Arg Val Pro Tyr Asp Val Leu Glu Lys Ile Ser
485 490 495
acc cgc att acc aac gaa gtc aac gac gtc aac cgc gtg gtc gtc gac 1536
Thr Arg Ile Thr Asn Glu Val Asn Asp Val Asn Arg Val Val Val Asp
500 505 510
atc acc tcc aag cca ccg gga acc atc gag tgg gag taa 1575
Ile Thr Ser Lys Pro Pro Gly Thr Ile Glu Trp Glu
515 520
<210> 8
<211> 524
<212> PRT
<213> Corynebacterium ammoniagenes
<400> 8
Val Thr Gln Pro Ala Thr Thr Pro Arg Pro Val Leu Val Val Asp Phe
1 5 10 15
Gly Ala Gln Tyr Ala Gln Leu Ile Ala Arg Arg Val Arg Glu Ala Ser
20 25 30
Ile Tyr Ser Glu Val Val Pro His Ser Ala Thr Val Lys Glu Ile Lys
35 40 45
Ala Lys Asn Pro Ala Ala Leu Ile Leu Ser Gly Gly Pro Ser Ser Val
50 55 60
Tyr Ala Asp Gly Ala Pro Gln Leu Lys Pro Glu Leu Leu Glu Leu Gly
65 70 75 80
Val Pro Val Phe Gly Ile Cys Tyr Gly Phe Gln Ala Met Asn His Ala
85 90 95
Leu Gly Gly Asn Val Ala Gln Thr Gly Asp Arg Glu Tyr Gly Arg Thr
100 105 110
Glu Ile Thr His Thr Gly Gly Val Leu His Asp Gly Leu Glu Glu Asn
115 120 125
His Lys Val Trp Met Ser His Gly Asp Ala Val Asp Lys Ala Pro Glu
130 135 140
Gly Phe Thr Val Thr Ala Ser Ser Ala Gly Ala Pro Val Ala Ala Met
145 150 155 160
Glu Cys Val Ala Lys Gln Met Ala Gly Val Gln Tyr His Pro Glu Val
165 170 175
Met His Ser Pro His Gly Gln Glu Val Leu Val Arg Phe Leu Thr Glu
180 185 190
Val Ala Gly Leu Glu Gln Thr Trp Thr Ser Ala Asn Ile Ala Gln Gln
195 200 205
Leu Ile Asp Asp Val Arg Ala Gln Ile Gly Pro Glu Gly Arg Ala Ile
210 215 220
Cys Gly Leu Ser Gly Gly Val Asp Ser Ala Val Ala Ala Ala Leu Val
225 230 235 240
Gln Arg Ala Ile Gly Asp Arg Leu Thr Cys Val Phe Val Asp His Gly
245 250 255
Leu Leu Arg Ala Gly Glu Arg Glu Gln Val Glu Lys Asp Phe Val Ala
260 265 270
Ser Thr Gly Ala Lys Leu Ile Thr Ala His Glu Ala Asp Ala Phe Leu
275 280 285
Ser Lys Leu Ala Gly Val Thr Asp Pro Glu Ala Lys Arg Lys Ala Ile
290 295 300
Gly Ala Glu Phe Ile Arg Ser Phe Glu Arg Ala Val Ala Gln Ala Leu
305 310 315 320
Glu Glu Ser Pro Glu Asp Ser Thr Val Asp Phe Leu Val Gln Gly Thr
325 330 335
Leu Tyr Pro Asp Val Val Glu Ser Gly Gly Gly Asp Gly Thr Ala Asn
340 345 350
Ile Lys Ser His His Asn Val Gly Gly Leu Pro Asp Asp Val Glu Phe
355 360 365
Glu Leu Val Glu Pro Leu Arg Leu Leu Phe Lys Asp Glu Val Arg Ala
370 375 380
Val Gly Arg Glu Leu Gly Leu Pro Glu Glu Ile Val Ala Arg Gln Pro
385 390 395 400
Phe Pro Gly Pro Gly Leu Gly Ile Arg Ile Ile Gly Glu Val Thr Glu
405 410 415
Glu Arg Leu Glu Ile Leu Arg Gln Ala Asp Leu Ile Ala Arg Thr Glu
420 425 430
Leu Thr Asn Ala Gly Leu Asp Gly Asp Ile Trp Gln Cys Pro Val Val
435 440 445
Leu Leu Ala Asp Val Arg Ser Val Gly Val Gln Gly Asp Gly Arg Thr
450 455 460
Tyr Gly His Pro Ile Val Leu Arg Pro Val Ser Ser Glu Asp Ala Met
465 470 475 480
Thr Ala Asp Trp Thr Arg Val Pro Tyr Asp Val Leu Glu Lys Ile Ser
485 490 495
Thr Arg Ile Thr Asn Glu Val Asn Asp Val Asn Arg Val Val Val Asp
500 505 510
Ile Thr Ser Lys Pro Pro Gly Thr Ile Glu Trp Glu
515 520
<210> 9
<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> primer
<400> 9
aataagaatt catgacggaa aacattcata agcatcgcat cctcat 46
<210> 10
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> primer
<400> 10
tgttactgca gtcaatccta taattcttga a 31
<210> 11
<211> 753
<212> DNA
<213> Escherichia coli
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(750)
<400> 11
atg acc att aaa aat gta att tgc gat atc gac ggc gtg ctg atg cac 48
Met Thr Ile Lys Asn Val Ile Cys Asp Ile Asp Gly Val Leu Met His
1 5 10 15
gat aac gtc gcc gta ccg ggt gca gcg gaa ttt ttg cac ggg att atg 96
Asp Asn Val Ala Val Pro Gly Ala Ala Glu Phe Leu His Gly Ile Met
20 25 30
gat aaa ggc ctg ccg ctg gtg ttg ctg acc aac tat cct tcg cag act 144
Asp Lys Gly Leu Pro Leu Val Leu Leu Thr Asn Tyr Pro Ser Gln Thr
35 40 45
ggg caa gat ctg gcg aac cgc ttt gcc acc gca ggt gtc gat gta cct 192
Gly Gln Asp Leu Ala Asn Arg Phe Ala Thr Ala Gly Val Asp Val Pro
50 55 60
gac agc gtg ttt tat acc tct gcg atg gcg act gcc gat ttc ctg cgt 240
Asp Ser Val Phe Tyr Thr Ser Ala Met Ala Thr Ala Asp Phe Leu Arg
65 70 75 80
cgc cag gaa ggc aag aaa gcg tat gtg gtg ggc gaa ggc gca ctg att 288
Arg Gln Glu Gly Lys Lys Ala Tyr Val Val Gly Glu Gly Ala Leu Ile
85 90 95
cat gaa ctg tac aaa gcc ggt ttc act att acc gat gtg aac cct gat 336
His Glu Leu Tyr Lys Ala Gly Phe Thr Ile Thr Asp Val Asn Pro Asp
100 105 110
ttc gtg att gtt ggc gaa acg cgt tcc tac aac tgg gac atg atg cat 384
Phe Val Ile Val Gly Glu Thr Arg Ser Tyr Asn Trp Asp Met Met His
115 120 125
aaa gca gcc tat ttc gtc gct aac ggt gca cgt ttt atc gcc acc aat 432
Lys Ala Ala Tyr Phe Val Ala Asn Gly Ala Arg Phe Ile Ala Thr Asn
130 135 140
ccg gac acc cac ggg cgc ggt ttt tat ccc gct tgt ggc gcg ttg tgt 480
Pro Asp Thr His Gly Arg Gly Phe Tyr Pro Ala Cys Gly Ala Leu Cys
145 150 155 160
gca ggg att gag aaa atc tcc ggg cgc aaa ccg ttc tat gtt ggt aag 528
Ala Gly Ile Glu Lys Ile Ser Gly Arg Lys Pro Phe Tyr Val Gly Lys
165 170 175
ccc agc ccg tgg atc atc cgc gca gca tta aac aaa atg cag gcg cat 576
Pro Ser Pro Trp Ile Ile Arg Ala Ala Leu Asn Lys Met Gln Ala His
180 185 190
tcg gaa gaa acg gtg att gtc ggc gat aac ctg cgt acc gat att ctg 624
Ser Glu Glu Thr Val Ile Val Gly Asp Asn Leu Arg Thr Asp Ile Leu
195 200 205
gcc ggc ttc cag gca ggt ctg gag acg att ctg gtg ctt tct ggt gtt 672
Ala Gly Phe Gln Ala Gly Leu Glu Thr Ile Leu Val Leu Ser Gly Val
210 215 220
tcg tcg ctc gac gat atc gac agt atg cct ttc cgc ccc agc tgg att 720
Ser Ser Leu Asp Asp Ile Asp Ser Met Pro Phe Arg Pro Ser Trp Ile
225 230 235 240
tac ccg tca gtc gct gaa atc gac gtt atc tga 753
Tyr Pro Ser Val Ala Glu Ile Asp Val Ile
245 250
<210> 12
<211> 250
<212> PRT
<213> Escherichia coli
<400> 12
Met Thr Ile Lys Asn Val Ile Cys Asp Ile Asp Gly Val Leu Met His
1 5 10 15
Asp Asn Val Ala Val Pro Gly Ala Ala Glu Phe Leu His Gly Ile Met
20 25 30
Asp Lys Gly Leu Pro Leu Val Leu Leu Thr Asn Tyr Pro Ser Gln Thr
35 40 45
Gly Gln Asp Leu Ala Asn Arg Phe Ala Thr Ala Gly Val Asp Val Pro
50 55 60
Asp Ser Val Phe Tyr Thr Ser Ala Met Ala Thr Ala Asp Phe Leu Arg
65 70 75 80
Arg Gln Glu Gly Lys Lys Ala Tyr Val Val Gly Glu Gly Ala Leu Ile
85 90 95
His Glu Leu Tyr Lys Ala Gly Phe Thr Ile Thr Asp Val Asn Pro Asp
100 105 110
Phe Val Ile Val Gly Glu Thr Arg Ser Tyr Asn Trp Asp Met Met His
115 120 125
Lys Ala Ala Tyr Phe Val Ala Asn Gly Ala Arg Phe Ile Ala Thr Asn
130 135 140
Pro Asp Thr His Gly Arg Gly Phe Tyr Pro Ala Cys Gly Ala Leu Cys
145 150 155 160
Ala Gly Ile Glu Lys Ile Ser Gly Arg Lys Pro Phe Tyr Val Gly Lys
165 170 175
Pro Ser Pro Trp Ile Ile Arg Ala Ala Leu Asn Lys Met Gln Ala His
180 185 190
Ser Glu Glu Thr Val Ile Val Gly Asp Asn Leu Arg Thr Asp Ile Leu
195 200 205
Ala Gly Phe Gln Ala Gly Leu Glu Thr Ile Leu Val Leu Ser Gly Val
210 215 220
Ser Ser Leu Asp Asp Ile Asp Ser Met Pro Phe Arg Pro Ser Trp Ile
225 230 235 240
Tyr Pro Ser Val Ala Glu Ile Asp Val Ile
245 250
<210> 13
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> primer
<400> 13
tctgcaaagc cgcgaacaaa ggcga 25
<210> 14
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> primer
<400> 14
aattgctgac aaagtgcgat ttgtt 25
<210> 15
<211> 1653
<212> DNA
<213> Escherichia coli
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(1650)
<400> 15
atg aaa tta ttg cag cgg ggc gtg gcg tta gcg ctg tta acc aca ttt 48
Met Lys Leu Leu Gln Arg Gly Val Ala Leu Ala Leu Leu Thr Thr Phe
1 5 10 15
aca ctg gcg agt gaa act gct ctg gcg tat gag cag gat aaa acc tac 96
Thr Leu Ala Ser Glu Thr Ala Leu Ala Tyr Glu Gln Asp Lys Thr Tyr
20 25 30
aaa att aca gtt ctg cat acc aat gat cat cat ggg cat ttt tgg cgc 144
Lys Ile Thr Val Leu His Thr Asn Asp His His Gly His Phe Trp Arg
35 40 45
aat gaa tat ggc gaa tat ggt ctg gcg gcg caa aaa acg ctg gtg gat 192
Asn Glu Tyr Gly Glu Tyr Gly Leu Ala Ala Gln Lys Thr Leu Val Asp
50 55 60
ggt atc cgc aaa gag gtt gcg gct gaa ggc ggt agc gtg ctg cta ctt 240
Gly Ile Arg Lys Glu Val Ala Ala Glu Gly Gly Ser Val Leu Leu Leu
65 70 75 80
tcc ggt ggc gac att aac act ggc gtg ccc gag tct gac tta cag gat 288
Ser Gly Gly Asp Ile Asn Thr Gly Val Pro Glu Ser Asp Leu Gln Asp
85 90 95
gcc gaa cct gat ttt cgc ggt atg aat ctg gtg ggc tat gac gcg atg 336
Ala Glu Pro Asp Phe Arg Gly Met Asn Leu Val Gly Tyr Asp Ala Met
100 105 110
gcg atc ggt aat cat gaa ttt gat aat ccg ctc acc gta tta cgc cag 384
Ala Ile Gly Asn His Glu Phe Asp Asn Pro Leu Thr Val Leu Arg Gln
115 120 125
cag gaa aag tgg gcc aag ttc ccg ttg ctt tcc gcg aat atc tac cag 432
Gln Glu Lys Trp Ala Lys Phe Pro Leu Leu Ser Ala Asn Ile Tyr Gln
130 135 140
aaa agt act ggc gag cgc ctg ttt aaa ccg tgg gcg ctg ttt aag cgt 480
Lys Ser Thr Gly Glu Arg Leu Phe Lys Pro Trp Ala Leu Phe Lys Arg
145 150 155 160
cag gat ctg aaa att gcc gtt att ggg ctg aca acc gat gac aca gca 528
Gln Asp Leu Lys Ile Ala Val Ile Gly Leu Thr Thr Asp Asp Thr Ala
165 170 175
aaa att ggt aac ccg gaa tac ttc act gat atc gaa ttt cgt aag ccc 576
Lys Ile Gly Asn Pro Glu Tyr Phe Thr Asp Ile Glu Phe Arg Lys Pro
180 185 190
gcc gat gaa gcg aag ctg gtg att cag gag ctg caa cag aca gaa aag 624
Ala Asp Glu Ala Lys Leu Val Ile Gln Glu Leu Gln Gln Thr Glu Lys
195 200 205
cca gac att att atc gcg gcg acc cat atg ggg cat tac gat aat ggt 672
Pro Asp Ile Ile Ile Ala Ala Thr His Met Gly His Tyr Asp Asn Gly
210 215 220
gag cac ggc tct aac gca ccg ggc gat gtg gag atg gca cgc gcg ctg 720
Glu His Gly Ser Asn Ala Pro Gly Asp Val Glu Met Ala Arg Ala Leu
225 230 235 240
cct gcc gga tcg ctg gcg atg atc gtc ggt ggt cac tcg caa gat ccg 768
Pro Ala Gly Ser Leu Ala Met Ile Val Gly Gly His Ser Gln Asp Pro
245 250 255
gtc tgc atg gcg gca gaa aac aaa aaa cag gtc gat tac gtg ccg ggt 816
Val Cys Met Ala Ala Glu Asn Lys Lys Gln Val Asp Tyr Val Pro Gly
260 265 270
acg cca tgc aaa cca gat caa caa aac ggc atc tgg att gtg cag gcg 864
Thr Pro Cys Lys Pro Asp Gln Gln Asn Gly Ile Trp Ile Val Gln Ala
275 280 285
cat gag tgg ggc aaa tac gtg gga cgg gct gat ttt gag ttt cgt aat 912
His Glu Trp Gly Lys Tyr Val Gly Arg Ala Asp Phe Glu Phe Arg Asn
290 295 300
ggc gaa atg aaa atg gtt aac tac cag ctg att ccg gtg aac ctg aag 960
Gly Glu Met Lys Met Val Asn Tyr Gln Leu Ile Pro Val Asn Leu Lys
305 310 315 320
aag aaa gtg acc tgg gaa gac ggg aaa agc gag cgc gtg ctt tac act 1008
Lys Lys Val Thr Trp Glu Asp Gly Lys Ser Glu Arg Val Leu Tyr Thr
325 330 335
cct gaa atc gct gaa aac cag caa atg atc tcg ctg tta tca ccg ttc 1056
Pro Glu Ile Ala Glu Asn Gln Gln Met Ile Ser Leu Leu Ser Pro Phe
340 345 350
cag aac aaa ggc aaa gcg cag ctg gaa gtg aaa ata ggc gaa acc aat 1104
Gln Asn Lys Gly Lys Ala Gln Leu Glu Val Lys Ile Gly Glu Thr Asn
355 360 365
ggt cgt ctg gaa ggc gat cgt gac aaa gtg cgt ttt gta cag acc aat 1152
Gly Arg Leu Glu Gly Asp Arg Asp Lys Val Arg Phe Val Gln Thr Asn
370 375 380
atg ggg cgg ttg att ctg gca gcc caa atg gat cgc act ggt gcc gac 1200
Met Gly Arg Leu Ile Leu Ala Ala Gln Met Asp Arg Thr Gly Ala Asp
385 390 395 400
ttt gcg gtg atg agc gga ggc gga att cgt gat tct atc gaa gca ggc 1248
Phe Ala Val Met Ser Gly Gly Gly Ile Arg Asp Ser Ile Glu Ala Gly
405 410 415
gat atc agc tat aaa aac gtg ctg aaa gtg cag cca ttc ggc aat gtg 1296
Asp Ile Ser Tyr Lys Asn Val Leu Lys Val Gln Pro Phe Gly Asn Val
420 425 430
gtg gtg tat gcc gac atg acc ggt aaa gag gtg att gat tac ctg acc 1344
Val Val Tyr Ala Asp Met Thr Gly Lys Glu Val Ile Asp Tyr Leu Thr
435 440 445
gcc gtc gcg cag atg aag cca gat tca ggt gcc tac ccg caa ttt gcc 1392
Ala Val Ala Gln Met Lys Pro Asp Ser Gly Ala Tyr Pro Gln Phe Ala
450 455 460
aac gtt agc ttt gtg gcg aaa gac ggc aaa ctg aac gac ctt aaa atc 1440
Asn Val Ser Phe Val Ala Lys Asp Gly Lys Leu Asn Asp Leu Lys Ile
465 470 475 480
aaa ggc gaa ccg gtc gat ccg gcg aaa act tac cgt atg gcg aca tta 1488
Lys Gly Glu Pro Val Asp Pro Ala Lys Thr Tyr Arg Met Ala Thr Leu
485 490 495
aac ttc aat gcc acc ggc ggt gat gga tat ccg cgc ctt gat aac aaa 1536
Asn Phe Asn Ala Thr Gly Gly Asp Gly Tyr Pro Arg Leu Asp Asn Lys
500 505 510
ccg ggc tat gtg aat acc ggc ttt att gat gcc gaa gtg ctg aaa gcg 1584
Pro Gly Tyr Val Asn Thr Gly Phe Ile Asp Ala Glu Val Leu Lys Ala
515 520 525
tat atc cag aaa agc tcg ccg ctg gat gtg agt gtt tat gaa ccg aaa 1632
Tyr Ile Gln Lys Ser Ser Pro Leu Asp Val Ser Val Tyr Glu Pro Lys
530 535 540
ggt gag gtg agc tgg cag taa 1653
Gly Glu Val Ser Trp Gln
545 550
<210> 16
<211> 550
<212> PRT
<213> Escherichia coli
<400> 16
Met Lys Leu Leu Gln Arg Gly Val Ala Leu Ala Leu Leu Thr Thr Phe
1 5 10 15
Thr Leu Ala Ser Glu Thr Ala Leu Ala Tyr Glu Gln Asp Lys Thr Tyr
20 25 30
Lys Ile Thr Val Leu His Thr Asn Asp His His Gly His Phe Trp Arg
35 40 45
Asn Glu Tyr Gly Glu Tyr Gly Leu Ala Ala Gln Lys Thr Leu Val Asp
50 55 60
Gly Ile Arg Lys Glu Val Ala Ala Glu Gly Gly Ser Val Leu Leu Leu
65 70 75 80
Ser Gly Gly Asp Ile Asn Thr Gly Val Pro Glu Ser Asp Leu Gln Asp
85 90 95
Ala Glu Pro Asp Phe Arg Gly Met Asn Leu Val Gly Tyr Asp Ala Met
100 105 110
Ala Ile Gly Asn His Glu Phe Asp Asn Pro Leu Thr Val Leu Arg Gln
115 120 125
Gln Glu Lys Trp Ala Lys Phe Pro Leu Leu Ser Ala Asn Ile Tyr Gln
130 135 140
Lys Ser Thr Gly Glu Arg Leu Phe Lys Pro Trp Ala Leu Phe Lys Arg
145 150 155 160
Gln Asp Leu Lys Ile Ala Val Ile Gly Leu Thr Thr Asp Asp Thr Ala
165 170 175
Lys Ile Gly Asn Pro Glu Tyr Phe Thr Asp Ile Glu Phe Arg Lys Pro
180 185 190
Ala Asp Glu Ala Lys Leu Val Ile Gln Glu Leu Gln Gln Thr Glu Lys
195 200 205
Pro Asp Ile Ile Ile Ala Ala Thr His Met Gly His Tyr Asp Asn Gly
210 215 220
Glu His Gly Ser Asn Ala Pro Gly Asp Val Glu Met Ala Arg Ala Leu
225 230 235 240
Pro Ala Gly Ser Leu Ala Met Ile Val Gly Gly His Ser Gln Asp Pro
245 250 255
Val Cys Met Ala Ala Glu Asn Lys Lys Gln Val Asp Tyr Val Pro Gly
260 265 270
Thr Pro Cys Lys Pro Asp Gln Gln Asn Gly Ile Trp Ile Val Gln Ala
275 280 285
His Glu Trp Gly Lys Tyr Val Gly Arg Ala Asp Phe Glu Phe Arg Asn
290 295 300
Gly Glu Met Lys Met Val Asn Tyr Gln Leu Ile Pro Val Asn Leu Lys
305 310 315 320
Lys Lys Val Thr Trp Glu Asp Gly Lys Ser Glu Arg Val Leu Tyr Thr
325 330 335
Pro Glu Ile Ala Glu Asn Gln Gln Met Ile Ser Leu Leu Ser Pro Phe
340 345 350
Gln Asn Lys Gly Lys Ala Gln Leu Glu Val Lys Ile Gly Glu Thr Asn
355 360 365
Gly Arg Leu Glu Gly Asp Arg Asp Lys Val Arg Phe Val Gln Thr Asn
370 375 380
Met Gly Arg Leu Ile Leu Ala Ala Gln Met Asp Arg Thr Gly Ala Asp
385 390 395 400
Phe Ala Val Met Ser Gly Gly Gly Ile Arg Asp Ser Ile Glu Ala Gly
405 410 415
Asp Ile Ser Tyr Lys Asn Val Leu Lys Val Gln Pro Phe Gly Asn Val
420 425 430
Val Val Tyr Ala Asp Met Thr Gly Lys Glu Val Ile Asp Tyr Leu Thr
435 440 445
Ala Val Ala Gln Met Lys Pro Asp Ser Gly Ala Tyr Pro Gln Phe Ala
450 455 460
Asn Val Ser Phe Val Ala Lys Asp Gly Lys Leu Asn Asp Leu Lys Ile
465 470 475 480
Lys Gly Glu Pro Val Asp Pro Ala Lys Thr Tyr Arg Met Ala Thr Leu
485 490 495
Asn Phe Asn Ala Thr Gly Gly Asp Gly Tyr Pro Arg Leu Asp Asn Lys
500 505 510
Pro Gly Tyr Val Asn Thr Gly Phe Ile Asp Ala Glu Val Leu Lys Ala
515 520 525
Tyr Ile Gln Lys Ser Ser Pro Leu Asp Val Ser Val Tyr Glu Pro Lys
530 535 540
Gly Glu Val Ser Trp Gln
545 550
<210> 17
<211> 714
<212> DNA
<213> Escherichia coli
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(711)
<400> 17
atg cgc aag atc aca cag gca atc agt gcc gtt tgc tta ttg ttc gct 48
Met Arg Lys Ile Thr Gln Ala Ile Ser Ala Val Cys Leu Leu Phe Ala
1 5 10 15
cta aac agt tcc gct gtt gcc ctg gcc tca tct cct tca ccg ctt aac 96
Leu Asn Ser Ser Ala Val Ala Leu Ala Ser Ser Pro Ser Pro Leu Asn
20 25 30
cct ggg act aac gtt gcc agg ctt gct gaa cag gca ccc att cat tgg 144
Pro Gly Thr Asn Val Ala Arg Leu Ala Glu Gln Ala Pro Ile His Trp
35 40 45
gtt tcg gtc gca caa att gaa aat agc ctc gca ggg cgt ccg cca atg 192
Val Ser Val Ala Gln Ile Glu Asn Ser Leu Ala Gly Arg Pro Pro Met
50 55 60
gcg gtg ggg ttt gat atc gat gac acg gta ctt ttt tcc agt ccg ggc 240
Ala Val Gly Phe Asp Ile Asp Asp Thr Val Leu Phe Ser Ser Pro Gly
65 70 75 80
ttc tgg cgc ggc aaa aaa acc ttc tcg cca gaa agc gaa gat tat ctg 288
Phe Trp Arg Gly Lys Lys Thr Phe Ser Pro Glu Ser Glu Asp Tyr Leu
85 90 95
aaa aat cct gtg ttc tgg gaa aaa atg aac aat ggc tgg gat gaa ttc 336
Lys Asn Pro Val Phe Trp Glu Lys Met Asn Asn Gly Trp Asp Glu Phe
100 105 110
agc att cca aaa gag gtc gct cgc cag ctg att gat atg cat gta cgc 384
Ser Ile Pro Lys Glu Val Ala Arg Gln Leu Ile Asp Met His Val Arg
115 120 125
cgc ggt gac gcg atc ttc ttt gtg act ggt cgt agc ccg acg aaa aca 432
Arg Gly Asp Ala Ile Phe Phe Val Thr Gly Arg Ser Pro Thr Lys Thr
130 135 140
gaa acg gtt tca aaa acg ctg gcg gat aat ttt cat att cct gcc acc 480
Glu Thr Val Ser Lys Thr Leu Ala Asp Asn Phe His Ile Pro Ala Thr
145 150 155 160
aac atg aat ccg gtg atc ttt gcg ggc gat aaa cca ggg caa aat aca 528
Asn Met Asn Pro Val Ile Phe Ala Gly Asp Lys Pro Gly Gln Asn Thr
165 170 175
aaa tcg caa tgg ctg cag gat aaa aat atc cga att ttt tat ggc gat 576
Lys Ser Gln Trp Leu Gln Asp Lys Asn Ile Arg Ile Phe Tyr Gly Asp
180 185 190
tct gat aat gat att acc gcc gca cgc gat gtc ggc gct cgt ggt atc 624
Ser Asp Asn Asp Ile Thr Ala Ala Arg Asp Val Gly Ala Arg Gly Ile
195 200 205
cgc att ctg cgc gcc tcc aac tct acc tac aaa ccc ttg cca caa gcg 672
Arg Ile Leu Arg Ala Ser Asn Ser Thr Tyr Lys Pro Leu Pro Gln Ala
210 215 220
ggt gcg ttt ggt gaa gag gtg atc gtc aat tca gaa tac tga 714
Gly Ala Phe Gly Glu Glu Val Ile Val Asn Ser Glu Tyr
225 230 235
<210> 18
<211> 237
<212> PRT
<213> Escherichia coli
<400> 18
Met Arg Lys Ile Thr Gln Ala Ile Ser Ala Val Cys Leu Leu Phe Ala
1 5 10 15
Leu Asn Ser Ser Ala Val Ala Leu Ala Ser Ser Pro Ser Pro Leu Asn
20 25 30
Pro Gly Thr Asn Val Ala Arg Leu Ala Glu Gln Ala Pro Ile His Trp
35 40 45
Val Ser Val Ala Gln Ile Glu Asn Ser Leu Ala Gly Arg Pro Pro Met
50 55 60
Ala Val Gly Phe Asp Ile Asp Asp Thr Val Leu Phe Ser Ser Pro Gly
65 70 75 80
Phe Trp Arg Gly Lys Lys Thr Phe Ser Pro Glu Ser Glu Asp Tyr Leu
85 90 95
Lys Asn Pro Val Phe Trp Glu Lys Met Asn Asn Gly Trp Asp Glu Phe
100 105 110
Ser Ile Pro Lys Glu Val Ala Arg Gln Leu Ile Asp Met His Val Arg
115 120 125
Arg Gly Asp Ala Ile Phe Phe Val Thr Gly Arg Ser Pro Thr Lys Thr
130 135 140
Glu Thr Val Ser Lys Thr Leu Ala Asp Asn Phe His Ile Pro Ala Thr
145 150 155 160
Asn Met Asn Pro Val Ile Phe Ala Gly Asp Lys Pro Gly Gln Asn Thr
165 170 175
Lys Ser Gln Trp Leu Gln Asp Lys Asn Ile Arg Ile Phe Tyr Gly Asp
180 185 190
Ser Asp Asn Asp Ile Thr Ala Ala Arg Asp Val Gly Ala Arg Gly Ile
195 200 205
Arg Ile Leu Arg Ala Ser Asn Ser Thr Tyr Lys Pro Leu Pro Gln Ala
210 215 220
Gly Ala Phe Gly Glu Glu Val Ile Val Asn Ser Glu Tyr
225 230 235
<210> 19
<211> 54
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> primer1 for disrupting nagD
<400> 19
tgggtagtcc atgaccatta aaaatgtaat ttgcgacgct caagttagta taaa 54
<210> 20
<211> 54
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> primer2 for disrupting nagD
<400> 20
aacgtcgatt tcagcgactg acgggtaaat ccagcttgaa gcctgctttt ttat 54
<210> 21
<211> 54
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> primer1 for disrupting ushA
<400> 21
ggagagaagt atgaaattat tgcagcgggg cgtggccgct caagttagta taaa 54
<210> 22
<211> 54
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> primer2 for disrupting ushA
<400> 22
ccagctcacc tcacctttcg gttcataaac actcactgaa gcctgctttt ttat 54
<210> 23
<211> 54
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> primer1 for disrupting aphA
<400> 23
agggaaaaat atgcgcaaga tcacacaggc aatcagcgct caagttagta taaa 54
<210> 24
<211> 54
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> primer2 for disrupting aphA
<400> 24
ttctgaattg acgatcacct cttcaccaaa cgcacctgaa gcctgctttt ttat 54
Claims (12)
- 미생물을 크산틸산과 반응시켜 5'-구아닐산을 생산하고 5'-구아닐산을 회수함을 포함하는, 5'-구아닐산의 생산방법으로서,
상기 미생물은, 크산틸산을 5'-구아닐산으로 전환시키는 능력을 갖는 미생물이고, nagD 유전자의 전사가 감소하거나 제거되고 5'-구아닐산 신테타제 활성이 증강되도록 변형된 미생물인, 5'-구아닐산의 생산방법. - 제1항에 있어서, 상기 미생물에서 guaA 유전자의 발현을 증가시킴으로써 상기 5'-구아닐산 신테타제 활성이 증강되는 생산방법.
- 제2항에 있어서, 상기 guaA 유전자가,
(A) 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 단백질; 및
(B) 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하지만, 하나 또는 수개의 아미노산의 치환, 결실, 삽입 또는 부가를 포함하고, 5'-구아닐산 신테타제 활성을 갖는 단백질
로 이루어진 그룹으로부터 선택된 단백질을 암호화하는 생산방법. - 제1항 내지 제3항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 미생물이, ushA 유전자 및/또는 aphA 유전자의 전사가 감소되거나 제거되도록 추가로 변형된 생산방법.
- 제1항 내지 제3항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 미생물이 장내세균(Enterobacteriaceae) 과에 속하는 세균, 바실러스(Bacillus) 세균 및 코리네형(coryneform) 세균으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 생산방법.
- 제5항에 있어서, 상기 미생물이 에세리키아(Escherichia) 속에 속하는 생산방법.
- 제6항에 있어서, 상기 미생물이 에세리키아 콜라이(Escherichia coli)인 생산방법.
- 크산틸산을 5'-구아닐산으로 전환시키는 능력을 갖는 미생물로서,
상기 미생물은, 5'-구아닐산 신테타제 활성이 guaA 유전자의 발현을 증가시킴으로써 증강되고 nagD 유전자의 전사가 감소되거나 제거되도록 변형된 미생물이고, 증가된 guaB 유전자 발현을 갖지 않는 미생물. - 제8항에 있어서, 상기 미생물이 ushA 유전자 및 aphA 유전자로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 유전자의 전사가 감소되거나 제거되도록 추가로 변형된 미생물.
- 제8항 또는 제9항에 있어서, 상기 미생물이 장내세균 과에 속하는 세균, 바실러스 세균 및 코리네형 세균으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 미생물.
- 제10항에 있어서, 상기 미생물이 에세리키아 속에 속하는 미생물.
- 제11항에 있어서, 상기 미생물이 에세리키아 콜라이인 미생물.
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2009185920A JP5636648B2 (ja) | 2009-08-10 | 2009-08-10 | 5’−グアニル酸の製造法 |
JPJP-P-2009-185920 | 2009-08-10 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
KR20110016417A KR20110016417A (ko) | 2011-02-17 |
KR101669474B1 true KR101669474B1 (ko) | 2016-10-26 |
Family
ID=43501564
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
KR1020100076730A KR101669474B1 (ko) | 2009-08-10 | 2010-08-10 | 5'-구아닐산의 생산방법 |
Country Status (5)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US9200304B2 (ko) |
EP (1) | EP2295546B1 (ko) |
JP (1) | JP5636648B2 (ko) |
KR (1) | KR101669474B1 (ko) |
CN (2) | CN101993904A (ko) |
Families Citing this family (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN104371939B (zh) * | 2013-08-15 | 2017-07-21 | 中国中化股份有限公司 | 一种培养处理焦化废水所用复合菌的培养基及其应用 |
KR101929158B1 (ko) * | 2018-06-07 | 2018-12-13 | 씨제이제일제당 (주) | 5'-크산틸산을 생산하는 미생물 및 이를 이용한 5'-크산틸산의 제조방법 |
CN110257315B (zh) * | 2019-07-04 | 2020-12-15 | 廊坊梅花生物技术开发有限公司 | 一种枯草芽孢杆菌及其构建方法与应用 |
KR102419166B1 (ko) * | 2021-09-23 | 2022-07-08 | 씨제이제일제당 주식회사 | 신규한 글루타민 가수분해 gmp 합성효소 변이체 및 이를 이용한 퓨린 뉴클레오티드의 생산방법 |
CA3170389A1 (en) * | 2021-09-23 | 2023-03-23 | Cj Cheiljedang Corporation | Novel glutamine-hydrolyzing gmp synthase variant and method for producing purine nucleotide by using same |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2008543272A (ja) | 2005-01-21 | 2008-12-04 | シージェイ チェイルジェダン コープ. | Xmpをgmpに転換させることができながら、gmpの分解に関連される遺伝子が不活性化されているエシェリキア菌株及びそれを用いる方法 |
Family Cites Families (21)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS5420195A (en) | 1977-07-14 | 1979-02-15 | Ajinomoto Co Inc | Preparation of guanosine-5'-monophosphoric acid |
JPS5612438A (en) | 1979-07-13 | 1981-02-06 | Mitsubishi Heavy Ind Ltd | Drag suction-head for sludge dredging |
EP0263716A3 (en) * | 1986-10-09 | 1988-12-28 | Kyowa Hakko Kogyo Kabushiki Kaisha | A process for the preparation of 5'-guanylic acid and expression vectors for use therein |
FR2627508B1 (fr) | 1988-02-22 | 1990-10-05 | Eurolysine | Procede pour l'integration d'un gene choisi sur le chromosome d'une bacterie et bacterie obtenue par ledit procede |
JPH07108228B2 (ja) | 1990-10-15 | 1995-11-22 | 味の素株式会社 | 温度感受性プラスミド |
JP3651036B2 (ja) | 1993-12-27 | 2005-05-25 | 味の素株式会社 | ヌクレオシド−5’−燐酸エステルの製造法 |
JPH0937785A (ja) | 1995-05-25 | 1997-02-10 | Ajinomoto Co Inc | ヌクレオシド−5’−燐酸エステルの製造法 |
JP3941390B2 (ja) | 1995-05-25 | 2007-07-04 | 味の素株式会社 | 変異型酸性フォスファターゼ |
JP4304727B2 (ja) | 1996-11-21 | 2009-07-29 | 味の素株式会社 | ヌクレオシド−5’−燐酸エステルの製造法 |
SK7702000A3 (en) | 1998-09-25 | 2000-10-09 | Ajinomoto Kk | Process for preparing coryneform bacteria having an improved amino acid- or nucleic acid-productivity |
JP2000262288A (ja) | 1999-03-16 | 2000-09-26 | Ajinomoto Co Inc | コリネ型細菌の温度感受性プラスミド |
ES2272378T3 (es) | 2000-07-05 | 2007-05-01 | Ajinomoto Co., Inc. | Metodo para la produccion de nucleotidos por fermentacion. |
JP4696404B2 (ja) | 2000-07-05 | 2011-06-08 | 味の素株式会社 | 発酵法によるヌクレオチドの製造法 |
DE102004001674B4 (de) | 2003-01-29 | 2019-01-24 | Ajinomoto Co., Inc. | Verfahren zur Herstellung von L-Lysin unter Einsatz von Methanol verwertenden Bakterien |
KR101073370B1 (ko) | 2003-07-29 | 2011-10-17 | 아지노모토 가부시키가이샤 | 물질 생산에 영향을 미치는 대사 흐름을 결정하는 방법 |
US7547531B2 (en) | 2005-01-18 | 2009-06-16 | Ajinomoto Co., Inc. | L-amino acid producing microorganism which has been modified to inactive the fimH gene, and a method for producing I-amino acid |
US7326546B2 (en) | 2005-03-10 | 2008-02-05 | Ajinomoto Co., Inc. | Purine-derived substance-producing bacterium and a method for producing purine-derived substance |
KR101005707B1 (ko) | 2005-12-14 | 2011-01-05 | 씨제이제일제당 (주) | 암모니아 특이적 5'-크산틸산 아미나아제 변이체 |
KR101250826B1 (ko) | 2006-04-24 | 2013-04-11 | 아지노모토 가부시키가이샤 | 퓨린계 물질 생산균 및 퓨린계 물질의 제조법 |
EP2011861A1 (en) | 2006-04-24 | 2009-01-07 | Ajinomoto Co., Inc. | Bacterium capable of producing purine substance, and process for production of purine substance |
EP2264144A4 (en) * | 2008-02-25 | 2012-11-07 | Ajinomoto Kk | PROCESS FOR THE PREPARATION OF 5'-GUANYLIC ACID |
-
2009
- 2009-08-10 JP JP2009185920A patent/JP5636648B2/ja active Active
-
2010
- 2010-08-06 US US12/851,793 patent/US9200304B2/en active Active
- 2010-08-10 CN CN2010102505411A patent/CN101993904A/zh active Pending
- 2010-08-10 KR KR1020100076730A patent/KR101669474B1/ko active IP Right Grant
- 2010-08-10 EP EP10008338.5A patent/EP2295546B1/en active Active
- 2010-08-10 CN CN201410707725.4A patent/CN104480169A/zh active Pending
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2008543272A (ja) | 2005-01-21 | 2008-12-04 | シージェイ チェイルジェダン コープ. | Xmpをgmpに転換させることができながら、gmpの分解に関連される遺伝子が不活性化されているエシェリキア菌株及びそれを用いる方法 |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
E. Kuznetsova et al, Jour. of Biological chemistry 281(47):pp.36149-36161 (2006. 9.14.) |
Fujio T. et al, Japan Soc For Bioscience, Biotech and Agrochemist. 61(5):pp.840-845 (1997. 5. 1.) |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JP5636648B2 (ja) | 2014-12-10 |
KR20110016417A (ko) | 2011-02-17 |
CN104480169A (zh) | 2015-04-01 |
EP2295546A3 (en) | 2012-11-07 |
CN101993904A (zh) | 2011-03-30 |
JP2011036171A (ja) | 2011-02-24 |
US20110033898A1 (en) | 2011-02-10 |
US9200304B2 (en) | 2015-12-01 |
EP2295546B1 (en) | 2016-09-21 |
EP2295546A2 (en) | 2011-03-16 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US11697810B2 (en) | Adenylosuccinate synthetase and method for producing purine nucleotides using the same | |
KR101599977B1 (ko) | 5'-구아닐산의 제조법 | |
CN107034250B (zh) | 谷氨酸类l-氨基酸的制造方法 | |
US7432085B2 (en) | Method for producing L-amino acid | |
JP4760711B2 (ja) | バチルス属又はエシェリヒア属に属する細菌を使用した発酵によるプリンヌクレオシド及びヌクレオチドの製造方法 | |
EP1647593B1 (en) | Method for producing l-histidine using bacteria of the enterobacteriaceae family | |
US8187840B2 (en) | Microorganism producing inosine and method of producing inosine using the same | |
JP5488594B2 (ja) | プリンリボヌクレオシド及びリボヌクレオチドの製造方法 | |
KR101669474B1 (ko) | 5'-구아닐산의 생산방법 | |
EP2102347B1 (en) | Corynebacterium glutamicum variety producing l-arginine and method for fabricating the same | |
JP6891292B2 (ja) | 変異型ホスホリボシルピロリン酸アミドトランスフェラーゼ及びこれを用いたプリンヌクレオチドの製造方法 | |
EP3296400B1 (en) | Method for producing l-tryptophan using microorganisms of genus escherichia | |
CA2297613A1 (en) | Process for producing purine nucleotides |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A201 | Request for examination | ||
E902 | Notification of reason for refusal | ||
E701 | Decision to grant or registration of patent right | ||
GRNT | Written decision to grant | ||
FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20191001 Year of fee payment: 4 |