KR101005707B1 - 암모니아 특이적 5'-크산틸산 아미나아제 변이체 - Google Patents

암모니아 특이적 5'-크산틸산 아미나아제 변이체 Download PDF

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Abstract

본 발명은 암모니아 특이적인 5'-크산틸산(xanthosine 5'-monophosphate: XMP) 아미나아제 돌연변이체의 개발 및 이를 이용하여 5'-크산틸산을 5'-구아닐산으로 전환시키는 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 5'-크산틸산 아미나아제의 글루탐산 분해 위치에 특이적으로 돌연변이를 도입함으로써, 글루탐산 분해 능력이 억제되고 외부 암모니아만을 이용하여 5'-크산틸산을 5'-구아닐산으로 전환시킬 수 있는 암모니아 특이적 5'-크산틸산 아미나아제(ammonia-specific 5'-XMP aminase)의 개발 및 이를 이용하여 배양액 당 증가된 활성으로 5'-크산틸산을 5'-구아닐산으로 전환시키는 방법에 관한 것이다.
암모니아, 5'-크산틸산, 5'-구아닐산, 5'-크산틸산 아미나아제

Description

암모니아 특이적 5'-크산틸산 아미나아제 변이체{AMMONIA-SPECIFIC 5'-XMP AMINASE MUTANT}
도 1은 무작위적인 돌연변이 도입을 통해 5'-크산틸산 아미나아제 변이체 라이브러리를 제조하고 고활성 5'-크산틸산 아미나아제를 스크리닝 하는 방법를 개략적으로 나타낸 것이다.
도 2는 무작위 돌연변이에 의해 제조된 고활성 5'-크산틸산 아미나아제를, 상시 발현시키기 위하여 상시발현벡터에 도입하는 과정을 개략적으로 나타낸 도면이다.
도 3a는 고활성 5’-크산틸산 아미나아제 변이체인 G3의 유전자를 포함하는 발현벡터 pG3를 나타낸다.
도 3b는 고활성 5’-크산틸산 아미나아제 변이체인 F12의 유전자를 포함하는 발현벡터 pF12를 나타낸다.
도 3c는 고활성 5’-크산틸산 아미나아제 변이체인 F63의 유전자를 포함하는 발현벡터 pF63를 나타낸다.
도 3d는 고활성 5'-크산틸산 아미나아제 변이체인 G3-1 유전자를 포함하는 발현벡터 pCJ-G3-1 을 나타낸다.
도 3e는 고활성 5'-크산틸산 아미나아제 변이체인 F12-1 유전자를 포함하는 발현벡터 pCJ-F12-1 을 나타낸다.
도 3f는 고활성 5'-크산틸산 아미나아제 변이체인 F63-1 유전자를 포함하는 발현벡터 pCJ-F63-1 을 나타낸다.
도 4a는 야생형 5'-크산틸산 아미나아제의 유전자인 G1 유전자를 포함하는 발현벡터 pCJ1-G1 을 나타낸다.
도 4b는 고활성 5'-크산틸산 아미나아제 변이체인 G3-1 유전자를 포함하는 발현벡터 pCJ1-G3-1 을 나타낸다.
도 4c는 고활성 5'-크산틸산 아미나아제 변이체인 F12-1 유전자를 포함하는 발현벡터 pCJ1-F12-1 을 나타낸다.
도 4d는 고활성 5'-크산틸산 아미나아제 변이체인 F63-1 유전자를 포함하는 발현벡터 pCJ1-F63-1 을 나타낸다.
도 4e는 암모니아 특이적 5'-크산틸산 아미나아제 변이체인 G1C 유전자를 포함하는 발현벡터 pCJ1-G1C 를 나타낸다.
도 4f는 암모니아 특이적 5'-크산틸산 아미나아제 변이체인 G3C 유전자를 포함하는 발현벡터 pCJ1-G3C 를 나타낸다.
도 4g는 암모니아 특이적 5'-크산틸산 아미나아제 변이체인 F12C 유전자를 포함하는 발현벡터 pCJ1-F12C 를 나타낸다.
도 4h는 암모니아 특이적 5'-크산틸산 아미나아제 변이체인 F63C 유전자를 포함하는 발현벡터 pCJ1-F63C 를 나타낸다.
도 5는 에세리키아 콜리의 야생형 5'-크산틸산 아미나아제(G1) 및 본 발명의 실시예에 따라 제조된 에세리키아 콜리 유래의 5'-크산틸산 아미나아제의 무작위 돌연변이체(G3-1, F12-1, F63-1) 및 암모니아 특이적 돌연변이체(G1C, G3C, F12C, F63C)의 암모니아 및 L-글루타민을 기질로 한 경우의 배양액 당 단위 활성을 나타내는 도면이다. 도면에서 Ammo는 암모니아를 기질로 하였을 때 단위 활성이며, Gln은 글루타민을 기질로 하였을 때의 단위 활성이다.
도6은 야생형 5'-크산틸산 아미나아제의 유전자(C1)를 포함하는 발현벡터와 상기 G1 유전자의 86번째 아미노산 잔기인 시스테인을 알라닌으로 치환한 암모니아 특이적인 G1C 유전자를 포함하는 발현벡터의 안정성을 비교하여 나타낸 도면이다.
본 발명은 향상된 활성의 5'-크산틸산 아미나아제 변이체를 제조하는 방법 및 그러한 방법에 따라 제조된 5'-크산틸산 아미나아제 변이체, 그리고 그러한 변이체를 이용하여 향상된 수율로 5'-구아닐산을 제조하는 방법에 관한 것으로서, 특히 암모니아에 특이적으로 반응하는 5'-크산틸산 아미나아제 변이체의 제조 방법 및 그러한 방법에 따라 제조되는 암모니아 특이적인 5'-크산틸산 아미나아제 변이체를 제공함으로써, 향상된 수율로 5'-구아닐산을 제조할 수 있는 방법에 관한 것이다.
5'-구아닐산(GMP)은 5'-이노신산(IMP)과 더불어 식품 조미 첨가제로 널리 이용되고 있는 물질이다. 5'-구아닐산은 자체로 버섯 맛을 내는 것으로 알려져 있으나, 주로 모노소디움 글루탐산(MSG)의 풍미를 강화하는 것으로 알려져 있다. 이러한 성질은 특히 5'-이노신산과 같이 쓰일 때 강하게 나타난다.
지금까지 알려진 5'-구아닐산의 제조방법은 (1) 효모세포로부터 추출한 리보핵산(RNA)를 효소학적으로 분해하는 방법, (2) 미생물 발효법으로 5'-구아닐산을 직접 발효하는 방법, (3) 미생물 발효법으로 생산한 구아노신을 화학적으로 인산화 시키는 방법, (4) 미생물 발효법으로 생산한 구아노신을 효소적 방법으로 인산화 시키는 방법, (5) 미생물 발효법으로 생산한 5'-크산틸산을 코리네형 미생물을 이용하여 5'-구아닐산으로 전환하는 방법, (6) 미생물 발효법으로 생산한 5'-크산틸산을 에세리키아 콜리를 이용하여 5'-구아닐산으로 전환시키는 방법을 들 수 있다. 이 중 (1)의 방법은 원료 수급 및 경제성에 문제가 있으며, (2)의 방법은 GMP의 세포막 투과성의 문제로 인하여 수율이 낮다는 단점이 있어 그 외의 방법이 공업적으로 주로 이용되고 있다.
전기 (5)와 (6)의 방법에서와 같이 5'-크산틸산을 5'-구아닐산으로 전환시킬 때 5'-크산틸산 아미나아제라는 효소가 관여하며, 이 효소의 기작은 다음과 같다 (Pantel et al. (1975), J. Biol. Sci., 250(7), 2609-2613).
1) 5'-크산틸산 + ATP + NH3
Figure 112005073241488-pat00001
GMP + AMP + PPi
5'-크산틸산 아미나아제
2) 5'-크산틸산 + ATP + L-글루타민
Figure 112005073241488-pat00002
GMP + AMP + PPi + L-글루탐산
5'-크산틸산 아미나아제
5'-크산틸산 아미나아제는 글루타민 아미도트랜스퍼라제 (glutamine amidotransferase)의 일종이다. 글루타민 아미도트랜스퍼라제는 글루타민의 감마-아미드 (g-amid) 부위를 가수분해하여 암모니아를 발생시키고 이를 아미노산, 핵산, 당, 조효소 등에 중합 반응을 거쳐 도입하게 된다. 글루타민 아미도트랜스퍼라제의 대상 물질은 매우 다양하지만, 글루타민을 가수분해하여 암모니아를 얻는 방식은 진화적으로 잘 보존되어 왔다. 글루타민 아미도트랜스퍼라제는 다시 class I과 class II로 나누어 지는데, class I의 경우는 안스라닐산 신타제(anthranilate synthase), 카바모일 포스페이트 신서타제(carbamoyl phosphate synthetase), CTP 신서타제 (CTP synthetase), 포밀그리신아미딘 신서타제(formylglycinamidine synthetase), 5'-크산틸산 아미나아제, 이미다졸 글리세롤 포스페이트 신타제(Imidazole glycerol phosphate synthase), 아미노디옥시코리스메이트 신타제(aminodeoxychorismate synthasea), 파라-아미노벤조산 신타제 (ｐ-aminobenzoate synthase) 등이 속한다. 이들은 공히 글루타민 외에 외부의 암모니아를 아민 공여체(amine donor)로 이용할 수 있다(Cell Mol. Life Sci. 54, 205-222, 1998). 이때 암모니아는 글루타민에서 유리된 암모니아가 기질에 전달되는 방식과 다르게 트랜스퍼라제에 직접 전달되는 것으로 생각된다.
단백질의 구조를 볼 때, 5'-크산틸산 아미나아제는 글루타민을 분해하는 글루타미나제 (glutaminase) 활성을 지니는 도메인(domain)과 트랜스퍼라제 활성을 지니는 도메인으로 잘 구별되어 있다 (Nat. Str. Biol. 3(1), 74- 86, 1996). 글루타미나제의 활성을 지니고 있는 N-터미날 도메인의 경우는 잘 연구된 카바밀포스페이트 신서타아제(carbamyl phosphate synthetase)와 구조적으로 유사하다. 또한, 글루타미나제(glutaminase)의 활성은 시스테인, 히스티딘, 글루탐산의 활성 트라이어드(catalytic triad)에 의해 주요하게 이뤄지며, 이는 시스테인 프로티아제(cysteine protease)의 기작과 유사하다(Cell Mol. Life Sci. 54, 205-222, 1998). 특히, 대장균에서는 아미노산 서열 86번째 시스테인, 181 번째 히스티딘, 183번째 글루탐산이 활성 트라이어드를 이루게 된다. 글루타미나제로서의 기작을 자세히 보면, 활성부위의 시스테인과 글루타민이 감마 글루타밀 티오에스터(g-glutamyl thioester)를 형성하고 히스티딘 염기로 작용하여 가수분해 함으로써, 글루타민을 글루탐산과 암모니아로 분리하게 된다(Fukuyama et al. Biochemistry 3, 1448-1492, 1964; von der Saal et al. Biochemistry 24, 5343-5350, 1985). 얻어진 암모니아는 효소에 형성된 채널을 통해 5'-크산틸산을 5'-구아닐산으로 전환시키는 반응에 참여하게 된다(Raushel et al. Biochemistry, 38(25), 7891-7899, 1999).
암모니아를 이용한 5'-크산틸산 아미나아제의 5'-크산틸산의 5'-구아닐산으로의 전환 반응은 L-글루타민을 이용한 반응과 기작적으로는 동일하나 현상적으로 는 많은 차이를 보이게 된다. 양쪽 기질에 대한 5'-크산틸산 아미나아제의 적정 pH는 8.3으로 동일하나 L-글루타민을 사용하는 경우 두 배 이상의 활성을 보인다(Pantel et al. (1975), J. Biol. Sci., 250(7), 2609-2613). 이러한 차이는 반응 pH를 중성으로 가져갈수록 더욱 크게 벌어지는데, 이는 실제 세포 내에서의 반응은 용액 상의 암모니아(NH3)를 이용하지 않고 L-글루타민을 이용하여 5'-크산틸산을 5'-구아닐산으로 전환시킨다는 사실을 보여준다.
한편, 시스테인에 반응하는 설퍼하이드릴 시약(sulfhydryl reagent)인 아이오도아세트아미드(Iodoacetamide)나 글루타민 유도체인 클로로케톤(chloroketone) 또는 액시비신(acivicine) 등을 5'-크산틸산 아미나아제에 처리하면, L-글루타민에 의한 활성은 감소하는 반면 암모니아에 의한 활성은 유지됨을 알 수 있다. 이는 글루타미나제 활성 부위의 시스테인이 글루타민을 이용하는 5'-크산틸산 아미나아제의 활성에는 필수적이지만 암모니아를 이용하는 5'-크산틸산 아미나아제의 활성에는 필수적이지 않을 것임을 시사한다(Zalkin and Truitt, J. Biol. Sci. 252(15), 5431-5436, 1977; Massiere and Badet-Denisot, Cell Mol. Life Sci. 54, 205-222, 1998).
5'-크산틸산 아미나아제와 동일한 클래스인 안스라닐산 신타아제의 경우, 보존된 시스테인을 글리신으로 치환한 경우 글루타민을 이용한 활성을 보이지 않는 반면 암모니아에 의한 활성은 영향을 받지 않는 것이 보고되었다 (Paluh et al., J. Biol. Chem. 260, 1889-8601, 1985). 또한, 파라-아미노벤조산 신타제의 경우에 있어서도 보존된 시스테인을 세린으로 치환한 경우, 감마 글루타밀 티오에스터(g-glutamyl thioester) 생성이 약화되어 파라-아미노벤조산 합성 중간체인 아미노디옥시코리슴산의 생성이 감소하는 것이 보고 되었다(Roux et al., Biochemistry, 32, 3763-3768, 1993). 카바모일 포스페이트 신서타제의 경우 역시, 보존된 시스테인을 세린이나 글리신으로 치환하는 경우 글루타민을 이용한 활성을 나타내지 못했다 (Rubino et al., J. Biol. Chem., 261, 11320-11327, 1986).
통상 야생형의 효소는 세포에 적합한 정도로 진화되어 왔기 때문에, 실제 산업적으로 이용되는 경우 활성이 낮아 적합하지 않은 결과를 보이는 경우가 많다. 이를 극복하기 위해 일반적으로 사용하는 방법은 효소의 유전자를 클로닝하고 이를 이용하여 과발현시키는 방법이다. 5'-크산틸산 아미나아제의 경우 최근 논문(Biosci. Biotech. Biochem. 61(5), 840-845, 1997)에 의하면 야생의 에세리키아 콜리로부터 얻어진 5'-크산틸산 아미나아제 유전자(guaA)를 유도발현 플라스미드에 클로닝하여 과발현시킨 후 이를 이용 5'-크산틸산으로부터 5'-구아닐산을 생산하는 것을 발표하였다.
야생형 균주의 발현을 강화시키는 다른 방법으로서 약제 내성을 이용하여 해당 유전자의 발현을 증대시키는 에세리키아 콜리 야생주로부터 데코이닌 내성을 지닌 돌연변이 균주를 통해 5'-크산틸산 아미나아제의 활성을 증대시키는 방법 역시 보고된 바 있다(대한민국 특허 공개번호 특2000-0040840).
일반적으로 이용되는 유도발현벡터의 경우 IPTG와 같은 고가의 발현 유도체 (inducer)를 요구하기 때문에, 산업적으로 대량의 단백질이 요구되는 경우에 있어 적합하지 못한 경우가 많다. 이를 극복하기 위해서 상시 발현벡터 시스템 (constitutive expression system)이 요구된다. 상시 발현 벡터 시스템은 다수가 보고되고 있으며, 특히 핵산을 발효하는 균주로 알려진 코리네박테리움 암모니아게네스(Corynebacterium ammoniagenes)에서도 신규의 상시 발현 프로모터가 개발되었다(대한민국 특허 출원 2004-107215). 상시 발현시스템의 경우는 발현 유도체의 도입 없이 숙주의 배양기간 동안 도입된 단백질을 지속적으로 발현시키기 때문에 유용하다. 그러나, 도입된 단백질의 과발현이 숙주 세포의 생장에 영향을 미치는 경우는 세포의 생장이 중지되거나 세포에 도입된 벡터가 제거되어 결과적으로 낮은 발현율을 보이게 된다. 5'-크산틸산 아미나아제의 경우에도 이러한 현상이 보고되고 있다(Biosci. Biotech. Biochem. 61(5), 840-845, 1997).
본 발명자들은 5'-크산틸산 아미나아제의 상시적 과발현에 있어서 세포의 성장이 중지되거나 벡터가 제거되는 현상이 상시적 과발현에 의한 세포의 독성에 의한 것으로 생각하고, 이를 효율적으로 감소시키는 방법으로서 5'-크산틸산 아미나아제의 글루타미나아제의 활성을 억제하는 방법을 생각하였다. 전술하였던 바와 같이, 5'-크산틸산 아미나아제는 세포 내에서 L-글루타민을 이용하여 5'-크산틸산을 5'-구아닐산으로 전환시키기 때문에, L-글루타미나제의 활성을 억제한 5'-크산틸산 아미나아제 변이체는 세포 내에서는 활성을 최소화하여 세포에 대한 독성을 감소시킬 수 있다. 이 때, L-글루타미나제의 활성이 억제 되더라도 암모니아에 대한 활성은 변성되지 않기 때문에 산업적으로 5'-크산틸산을 5'-구아닐산으로 효율적으로 전환시킬 수 있다. 본 발명자들은 5'-크산틸산 아미나아제의 생화학적 기작에 대한 면밀한 검토를 통해 글루타미나제의 활성을 억제한 암모니아 특이적 5'-크산틸산 아미나아제를 개발하였고, 이를 통해 배양액 상의 5'-크산틸산 아미나아제의 활성이 증진됨을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 야생형 및/또는 활성이 증진된 5'-크산틸산 아미나아제 변이체에 암모니아 특이적인 성질을 부여함으로써 활성이 증진된 암모니아 특이적 5'-크산틸산 아미나아제 변이체를 제공함에 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 활성이 증진된 암모니아 특이적 5'-크산틸산 아미나아제 변이체의 제조 방법을 제공함에 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 암모니아 특이적 5'-크산틸산 아미나아제 변이체를 코딩하는 핵산 분자를 제공함에 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 암모니아 특이적 5'-크산틸산 아미나아제 변이체를 발현시키는 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터를 제공함에 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기의 발현 벡터로 형질전환된 형질전환체를 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 암모니아 특이적 5'-크산틸산 아미나아제 변이체를 사용하여 5'-크산틸산을 5'-구아닐산으로 전환시키는 방법을 제공하는데 있다.
하나의 양태로서, 본 발명은 활성이 증진된 암모니아 특이적 5'-크산틸산 아미나아제 변이체를 제공한다. 상기 암모니아 특이적 5'-크산틸산 아미나아제 변이체는 바람직하게 에세리키아 콜리 유래의 야생형 5'-크산틸산 아미나아제 또는 이의 활성 증진된 변이체로부터 제조될 수 있다.
구체적으로, 에세리키아 콜리 유래의 야생형 5'-크산틸산 아미나아제 및 이의 무작위 돌연변이에 의해 활성이 증진된 5'-크산틸산 아미나아제 변이체에, 각각 암모니아 특이적인 성질을 부여하기 위한 위치 특이적 돌연변이(site-directed mutagenesis)를 수행함으로써, 암모니아 특이적이며 활성이 증진된 에세리키아 콜리 유래의 암모니아 특이적 5'-크산틸산 아미나아제 변이체들을 제조할 수 있다.
이를 위하여, 구체적인 실시에 있어 본 발명자는, 먼저 에세리키아 콜리 K12로부터 유래된 5'-크산틸산 아미나아제를 코딩하는 1578 bp의 유전자(서열번호 1)를 포함하는 벡터를 제조한 후, 이를 주형으로 하여 돌연변이 유발형 중합효소 연쇄반응(error-prone PCR)을 수행하였다. 이로부터 무작위적으로 돌연변이가 도입된 5'-크산틸산 아미나아제 변이체 DNA들을 수득하였다. 그 후 5'-크산틸산 아미나아제 변이체를 발현시키기 적합한 발현 벡터에 상기 변이체 DNA들을 접합시킨 후, 이를 이용하여 5'-크산틸산 아미나아제 유전자가 결핍된 에세리키아 콜리를 형질전환시켜 돌연변이 라이브러리를 제작하였다.
5'-크산틸산 아미나아제 유전자가 결핍된 에세리키아 콜리의 경우 5'-크산틸산 아미나아제의 활성을 갖고 있는 변이체를 지닌 벡터에 의해 형질전환된 경우만 성장이 가능하기 때문에, 돌연변이 라이브러리 중 활성이 있는 5'-크산틸산 아미나아제 돌연변이만이 얻어진다.
돌연변이 라이브러리로부터 성장이 이뤄진 에세리키아 콜리 중 활성이 높은 5'-크산틸산 아미나아제 돌연변이를 갖고 있는 벡터로 형질전환된 에세리키아 콜리를 선별하기 위하여, 98 웰 마이크로 플레이트에서 5'-크산틸산을 5'-구아닐산으로 전환시키는 반응을 수행하였다. 상기 반응 후 흡광 정도를 비교하여 활성이 증가된 5'-크산틸산 아미나아제를 생산하는 에세리키아 콜리를 선별하였다.
활성이 증진된 5'-크산틸산 아미나아제 변이체 유전자의 염기 서열은 공지된 방법을 통해 결정하였다. 이로부터, 유래된 5'-크산틸산 아미나아제의 염기서열을 야생형의 5'-크산틸산 아미나아제의 염기서열과 비교할 경우, 각각 2 개, 2 개, 4 개, 4 개, 3 개 및 6 개의 아미노산이 변환된 새로운 아미노산 배열을 갖는 단백질들임을 확인하고, 이들을 각각 '5'-크산틸산 아미나아제 G3', '5'-크산틸산 아미나아제 F12', '5'-크산틸산 아미나아제 F63', '5'-크산틸산 아미나아제 G3-1', '5'-크산틸산 아미나아제 F12-1' 및 '5'-크산틸산 아미나아제 F63-1'로 명명하였다.
각 변이체의 아미노산 배열의 변화를 구체적으로 설명하면, G3의 경우 52번째 및 191 번째 아미노산 서열이 각각 시스틴 및 쓰레오닌으로 치환된 변이체(서열번호 4)이고, F12의 경우 93번째 및 152번째 아미노산 서열이 각각 발린 및 프롤린으로 치환된 변이체(서열번호 6)이며, F63의 경우 93번째, 113번째, 191번째, 및 467번째 아미노산 서열이 각각 발린, 알라닌, 쓰레오닌, 및 글리신으로 치환된 변이체(서열번호 8)임을 확인할 수 있었다. G3-1의 경우 52번째, 191 번째, 253 번째, 및 454 번째 아미노산 서열이 각각 시스틴, 쓰레오닌, 아르기닌, 및 이소로이신으로 치환된 변이체(서열번호 10)이고, F12-1의 경우 93번째, 152번째, 및 454번째 아미노산 서열이 각각 발린, 프롤린, 및 이소로이신으로 치환된 변이체(서열번호 12)이며, F63-1의 경우 93번째, 100번째, 113번째, 191번째, 454번째, 및 467번째 아미노산 서열이 각각 발린, 이소로이신, 알라닌, 쓰레오닌, 이소로이신, 및 글리신으로 치환된 변이체(서열번호 14)임을 확인할 수 있었다.
연속하여, 본 발명자는 암모니아 특이적인 5'-크산틸산 아미나아제를 제조하기 위하여, 상기한 에세리키아 콜리 유래의 5'-크산틸산 아미나아제의 야생형 및 이로부터 유래된 상기 활성 증진된 돌연변이체 중 G3-1, F12-1, 및 F63-1에 각각, 글루타미나제 활성 부위에 존재하는 86번째 시스테인을 위치 특이적 돌연변이법(site-directed mutagenesis)에 의해 알라닌으로 치환하였다. 상기 위치 특이적 돌연변이에 의해 제조된 돌연변이체를 각각 G1C (서열번호 16), G3C (서열번호 18), F12C (서열번호 20), 및 F63C (서열번호 22)라고 명명하였다. 상기의 염기 변이는 통상의 염기서열 결정법을 이용하여 결정하였다. 결과 제조된 변이체들은 글루타민은 아민 공여체로서 효율적으로 이용하지 못하고 외부의 암모니아만을 아민 공여체로 이용할 수 있음을 확인하였다.
따라서, 본 발명은 바람직한 한 양태로서, 서열 번호 16, 18, 20 또는 22의 아미노산 서열을 갖는 암모니아 특이적 5'-크산틸산 변이체를 제공한다.
본 발명의 실시예에서는 서열번호 16, 18, 20 또는 22의 아미노산 서열을 갖 는 암모니아 특이적 5'-크산틸산 아미나아제 변이체들의 제조방법 및 그 활성만을 개시하였으나, 이들 실시예에 기재한 것과 동일한 방법으로 상기한 서열번호 4, 6 또는 8의 아미노산 서열을 가지는 활성 증진된 5'-크산틸산 아미나아제에도 암모니아 특이적 성질을 부여함으로써, 활성이 증진된 암모니아 특이적 5'-크산틸산 아미나아제의 변이체를 제조할 수 있음을 당업자라면 충분히 이해할 수 있을 것이다.
한편, 본원 실시예에서는 5'-크산틸산 아미나아제의 86번 위치의 시스테인을 알라닌으로 치환한 예만을 개시하였으나, 널리 알려진 분자 생물학적 방법을 통한 위치 특이적 돌연변이를 통해 세린이나 글리신 등 다른 아미노산을 도입하는 경우에도 암모니아 특이적 5'-크산틸산 아미나아제를 얻을 수 있음은 당업계의 종사자라면 충분히 알 수 있을 것이다.
나아가, 본 발명에 따른 암모니아 특이적 5'-크산틸산 아미나아제 변이체는 상기한 서열번호 16, 18, 20 또는 22의 아미노산 서열을 갖는 단백질 뿐만 아니라 이러한 변이체 단백질과 기능적으로 동등한 활성을 나타낼 수 있는 이의 등가물을 포함한다. 본원에서 용어 "기능적 등가물"이란 본 발명의 암모니아 특이적 5'-크산틸산 아미나아제 변이체의 아미노산 서열과 하나 이상의 아미노산 잔기가 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합에 의하여 상이한 서열을 가지되, 동일하게 암모니아 특이적 성질을 가지며 동등한 정도의 활성을 가지는 5'-크산틸산 아미나아제 변이체의 활성을 나타내는 단백질을 의미한다.　 분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질 및 펩티드에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다(H.Neurath, R.L.Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979).
후술할 바와 같이, 본 발명에 따른 암모니아 특이적 5'-크산틸산 아미나아제 변이체는 상시발현 시스템을 이용하여 발현시켰을 때 반응액 당 활성이 야생형에 비해 5'-크산틸산 아미나아제 변이체 G1C의 활성은 1.6 배, G3C는 1.4 배, F12C는 1.67배, 그리고 F63C는 1.45 배 활성이 증가함을 확인할 수 있으므로, 이들 암모니아 특이적 5'-크산틸산 아미나아제 변이체는 5'-구아닐산의 생성에 효율적으로 이용될 수 있을 것이다.
본 발명에 따른 암모니아 특이적 5'-크산틸산 아미나아제 변이체는 합성(Merrifleld, J. Amer. chem. Soc.. 85:2149-2156, 1963) 또는 DNA 서열을 기본으로 하는 재조합 방법에 의해 제조될 수 있다(Sambrook et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbour Laboratory Press, New York, USA, 2판, 1989).　 유전자 재조합 기술을 이용할 경우,　암모니아 특이적 5'-크산틸산 아미나아제 변이체를 코딩하는 핵산을 적절한 발현 벡터에 삽입하고, 재조합 발현 벡터를 숙주세포로 형질전환하여 암모니아 특이적 5'-크산틸산 아미나아제 변이체가 발현되도록 숙주 세포를 배양한 뒤, 숙주세포로부터 암모니아 특이적 5'-크산틸산 아미나아제 변이체를 회수하는 과정으로 수득할 수 있다.
따라서, 또 하나의 바람직한 양태로서, 본 발명은 활성이 증진된 암모니아 특이적 5'-크산틸산 아미나아제 변이체를 제조하는 방법을 제공한다. 구체적으로, 본 발명은 5'-크산틸산 아미나아제의 글루타미나아제 활성을 억제함으로써, 글루타미나제 활성이 제거된 5'-크산틸산 아미나아제 변이체가 세포 내에서는 활성을 최 소화하여 세포에 대한 독성이 감소되면서도, 암모니아에 대한 활성은 변성되지 않아 5'-크산틸산을 5'-구아닐산으로 효율적으로 전환시킬 수 있는 암모니아 특이적 5'-크산틸산 아미나아제 변이체의 제조방법을 제공한다.
바람직한 양태에 있어서, 본 발명은 에세리키아 콜리 유래의 5'-크산틸산 아미나아제의 글루타미나제 활성부위에 존재하는 86번째 시스테인을 위치 특이적 돌연변이법(site-directed mutagenesis)에 의해 상이한 아미노산으로 대체함으로써, 대체된 86번 위치의 아미노산과 183번 위치의 글루탐산이 감마 글루타민 티오에스터((g-glutamyl thioester)를 형성하지 못함으로써 글루타미나제 활성이 억제되고 암모니아 특이적인 5'-크산틸산 아미나아제 변이체를 제조하는 방법을 제공한다. 더욱 바람직한 양태에서, 본 발명에 따른 암모니아 특이적 5'-크산틸산 아미나아제 변이체의 제조 방법은, 에세리키아 콜리 유래의 5'-크산틸산 아미나아제의 86번 시스테인을 알라닌으로 치환하는 것을 포함한다.
특히 바람직한 양태에 있어서, 본 발명에 따른 암모니아 특이적인 5'-크산틸산 아미나아제 변이체의 제조 방법은 에세리키아 콜리로부터 유래되는 야생형 5'-크산틸산 아미나아제 또는 이의 활성 증진된 변이체로부터 제조되는 것을 특징으로 한다.
더욱 특히 바람직한 양태에 있어서, 본 발명에 따른 암모니아 특이적인 5'-크산틸산 아미나아제 변이체는 에세리키아 콜리로부터 유래되는 야생형 5'-크산틸산 아미나아제 또는 본 발명의 구체적인 실시예에 따라 제조되는 서열번호 4, 6, 8, 10, 12 또는 14의 아미노산 서열을 가지는 에세리키아 콜리 유래의 활성 증진된 5'-크산틸산 아미나아제 변이체의 86번 시스테인 잔기를 알라닌으로 치환시킴으로써 제조하는 방법을 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 암모니아 특이적인 5'-크산틸산 아미나아제 변이체를 코딩하는 핵산 분자에 관한 것이다.
바람직한 양태로서, 본 발명의 구체적 실시예에 따라 제조되는 서열번호 16의 암모니아 특이적 5'-크산틸산 아미나아제 변이체 G1C는 서열번호 15의 핵산 분자에 의해 코딩되며, 서열번호 18의 암모니아 특이적 5'-크산틸산 아미나아제 변이체 G3C는 서열번호 17의 핵산 분자에 의해 코딩되고, 서열번호 20의 암모니아 특이적 5'-크산틸산 아미나아제 변이체 F12C은 서열번호 19의 핵산 분자에 의해 코딩되며, 서열번호 22의 암모니아 특이적 5'-크산틸산 아미나아제 변이체 F63C은 서열번호 21의 핵산 분자에 의해 코딩된다. 이러한 핵산 분자의 서열은 단쇄 또는 이중쇄일 수 있으며, DNA 분자 또는 서열상의 티민(T)이 우라실로 치환된 RNA(mRNA) 분자일 수 있다.　
본 발명의 암모니아 특이적 5'-크산틸산 아미나아제 변이체를 코딩하는 핵산 서열은 이를 발현하는 벡터에 의해 제공되어 단백질로 발현될 수 있다.　
또 다른 양태에서, 본 발명은 상기한 암모니아 특이적 5'-크산틸산 아미나아제 변이체를 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 발현벡터에 관한 것이다.
본 발명에서 "발현벡터"란 적당한 숙주세포에서 목적 단백질을 발현할 수 있는 벡터로서, 유전자 삽입물이 발현되도록 작동가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 작제물을 말한다.　
본원에서 용어 "작동가능하게 연결된(operably linked)"은 일반적 기능을 수행하도록 핵산 발현 조절 서열과 목적하는 단백질을 코딩하는 핵산 서열이 기능적으로 연결되어(functionally linked) 있는 것을 말한다.　 예를 들어 프로모터와 단백질을 코딩하는 핵산 서열이 작동가능하게 연결되어 코딩하는 핵산 서열의 발현에 영향을 미칠 수 있다.　　 재조합 발현벡터와의 작동적 연결은 당해 기술분야에서 잘 알려진 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당해 기술 분야에서 일반적으로 알려진 효소 등을 사용한다. 발현벡터에 사용되는 프로모터에는, 예를 들어 숙주가 에세리키아 속 균인 경우에는 trc 프로모터, trp 프로모터, lac 프로모터, recA 프로모터, λP L 프로모터, lpp 프로모터, T7 프로모터 등이, 숙주가 바실러스 속 균인 경우에는 SPO1 프로모터, SPO2 프로모터, penP 프로모터 등이 바람직하다.　 개시 코돈 및 종결 코돈은 유전자 작제물이 투여되었을 때 개체에서 반드시 작용을 나타내야 하며 코딩 서열과 인프레임(in frame)에 있어야 한다.　 발현벡터는 또한 벡터를 함유하는 숙주 세포를 선택하기 위한 선택성 마커를 포함하고, 복제가능한 발현벡터인 경우 복제 기원을 포함할 수 있다.　
본 발명의 구체적 실시에서는 암모니아 특이적 5'-크산틸산 아미나아제 변이체의 유전자를 포함하는 발현벡터 pCJ1-G1C, pCJ1-G3C, pCJ1-F12C, 및 pCJ1-F63C를 제작하였으며, 이들 제작된 벡터의 개요를 도 4e, 4f, 4g, 및 4h에 나타내었다. 이들 발현벡터를 각각 에세리키아 콜리DH5α도입하여 최종적으로 형질전환된 에세리키아 콜리를 수득하였다. 전기 형질전환체를 각각 "Escherichia coli DH5α /pCJ1-G1C", "Escherichia coli DH5α/pCJ1-G3C", "Escherichia coli DH5α/pCJ1-F12C" 및 "Escherichia coli DH5α/ｐCJ1-F63C"로 명명하였으며, 이들 균체를 2005년 12월 2일자로 한국종균협회에 각각 기탁번호 KCCM-10715P, KCCM-10717P, KCCM-10721P 및 KCCM-10720로 기탁하였다. 또 다른 양태에서, 본 발명은 상기한 발현벡터로 형질전환된 형질전환체에 관한 것이다.
형질전환은 핵산 분자를 유기체, 세포, 조직 또는 기관에 도입하는 어떤 방법도 포함되며, 당 분야에서 공지된 바와 같이 숙주 세포에 따라 적합한 표준 기술을 선택하여 수행할 수 있다.　 이런 방법에는 전기충격유전자전달법(electroporation), 원형질 융합, 인산칼슘(CaPO4) 침전, 염화칼슘(CaCl2) 침전, 실리콘 카바이드 섬유를 이용한 교반, 아그로 박테리아 매개된 형질전환, PEG, 덱스트란 설페이트, 리포펙타민 등이 포함되나 이들로 제한되지 않는다.　
본 발명의 암모니아 특이적 5'-크산틸산 아미나아제 변이체를 발현하는 발현벡터로　형질전환되는 숙주세포에 따라서 단백질의 발현량과 수식 등이 다르게 나타나므로, 목적에 가장 적합한 숙주세포를 선택하여 사용하면 된다.　 숙주세포로는 원핵세포가 바람직하며, 예를 들어 에세리키아 콜리(Escherichia coli), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 스트렙토마이세스(Streptomyces), 슈도모나스(Pseudomonas), 프로테우스 미라빌리스(Proteus mirabilis) 또는 스타필로코쿠스(Staphylococcus)와 같은 원핵 숙주 세포가 있으나 이들로 제한되는 것은 아니다.　
또한, 진균(예를 들어, 아스페르길러스(Aspergillus)), 효모(예를 들어, 피 치아 파스토리스(Pichia pastoris), 사카로마이세스 세르비시애(Saccharomyces cerevisiae), 쉬조사카로마세스(Schizosaccharomyces), 뉴로스포라 크라사(Neurospora crassa)) 등과 같은 하등 진핵세포 등도 이용할 수 있다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 상기한 형질전환체를 배양한 후, 이로부터 5'-크산틸산 아미나아제의 변이 단백질을 분리하는 단계를 포함하는, 5'-크산틸산 아미나아제의 변이체를 제조하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 암모니아 특이적 5'-크산틸산 아미나아제 변이체를 발현하는 발현벡터로 형질전환된 숙주세포(형질전환체)의 배양은 목적 단백질인 암모니아 특이적 5'-크산틸산 아미나아제 변이체의 발현을 가능하게 하는 적절한 조건하에서 수행하며, 이러한 조건은 당업자에게 익히 공지된 방법에 따라 수행할 수 있다.
숙주세포에서 발현시킨 단백질은 통상의 방식으로 정제될 수 있으며,　예를 들어, 염석(예를 들어 황산암모늄 침전, 인산나트륨 침전), 용매 침전(아세톤, 에탄올 등을 이용한 단백질 분획 침전), 투석, 겔 여과, 이온 교환, 역상 칼럼 크로마토그래피와 같은 칼럼 크로마토그래피 및 한외여과 등의 기법을 단독 또는 조합시켜 적용하여 본 발명의 암모니아 특이적 5'-크산틸산 아미나아제 변이체 단백질을 정제할 수 있다.
이하, 본 발명의 바람직한 실시예를 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오직 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위는 이들 실시예에 국한되지 않는다.
실시예 1: 5'- 크산틸산 아미나아제 돌연변이 라이브러리 구축
5'-크산틸산 아미나아제의 유전자에 돌연변이 유발형 중합효소 연쇄반응(error-prone PCR)을 수행하여 무작위적인 돌연변이를 유발함으로써 다양한 5'-크산틸산 아미나아제 돌연변이를 다음과 같이 제조하였다.
우선, 에세리키아 콜리로부터 유래된 1,578bp의 5'-크산틸산 아미나아제 유전자(서열번호 1)를 trc 프로모터를 지니고 에세리키아 콜리에서 증폭이 가능한 복제 기원을 지닌 발현벡터인 pTrc99a에 작동가능하도록 연결한 재조합 플라스미드 pG1을 제작하여 이를 돌연변이 유발형 중합효소 연쇄반응의 주형으로 준비하였다. 돌연변이 유발형 중합효소 연쇄반응에 사용된 프라이머는 서열번호 23의 N-말단 프라이머와 서열번호 24의 C-말단 프라이머를 사용하였으며, 이는 에세리키아 콜리로부터 유래된 5'-크산틸산 아미나아제 유전자의 염기서열에 근거하여 합성하였다.
서열번호 23: 5' CGCGAATTCATGACGGAAAACATTCATAA 3'
서열번호 24: 5' CTAGTCTAGATCATTCCCACTCAATGGT 3'
PCR 반응액은 각각 0.4 mM의 상기 N-프라이머 및 C-프라이머, 주형으로 상기 재조합 플라스미드 pG1 5 ng, 10 mM 트리스 완충액 (Tris-HCl, pH 8.3), 50 mM KCl, 7 mM MgCl2, 0.1 mM MnCl2, 0.2 mM dATP, 0.2 mM dGTP, 1 mM dCTP, 1 mM dTTP 및 Taq 중합효소 5 효소단위(unit)를 포함하도록 50 mL를 조제하였다. 이어 반응 액을 94oC에서 1분, 50oC에서 1분, 72oC에서 1분의 조건으로 25회 수행 후, 72oC에서 7분간 돌연변이 유발형 PCR을 수행하여 돌연변이 유전자를 얻었다.
상기와 같이 증폭된 PCR 산물들은 한천 겔 전기 영동법을 통해 분리하였고, 증폭 분리된 DNA 단편을 제한효소 EcoRI 과 HindIII으로 절단한 후, 5'-크산틸산 아미나아제 발현 벡터로 유용한 pTrc99a에 접합시켜 재조합 플라스미드를 제작하였다. 전기 제작된 돌연변이 유전자를 함유하는 벡터들을 에세리키아 콜리 BW(guaA knock-out 균주)에 도입하여 5'-크산틸산 아미나아제 변이체 라이브러리를 제작하였다. guaA 유전자가 제거된 균주인 에세리키아 콜리 BW는 통상의 분자 생물학적 방법을 통하여 얻어졌다(Datsenko KA, 2000, Proc. Nat l Acad. Sci., 97(12), 6640-6645).
실시예 2: 5'- 크산틸산 아미나아제의 변이체의 탐색
실시예 1에서 제조된 5'-크산틸산 아미나아제 변이체의 라이브러리를 0.5 % 박토 트립톤, 1 % 효모 추출물, 1 % NaCl, 1.5 % 아가 및 0.2 mM IPTG를 포함하는 LB 평판배지에 도말하였다. 이어 성장이 일어난 에세리키아 콜리 콜로니를 K웰 마이크로플레이트(deep well microplate)에 LB 배지를 넣어 배양한 후, 세포의 성장 정도에 따라 100 mL로 희석하였다. 각 웰에 크실렌 5 mL를 첨가하고 37oC에서 30분간 처리한 후, 42oC로 미리 예열한 기질 혼합물을 100 mL 첨가하고 42oC에서 20 분간 반응시켰다. 기질 혼합물은 30 mM XMP, 13 mM ATP, 16 mM MgSO4 7H2O, 40 mM (NH4)2SO4를 16 mM Trizma HCl 완충액(pH 8.6)에 녹인 반응액이다. 3.5%의 퍼클로릭산 800 mL를 첨가하여 반응을 종료시킨 후, 200 mL를 UV 측정용 96 웰 플레이트로 옮겨 290 nm 파장에서의 흡광도를 측정하였다. 5'-구아닐산의 생성량을 측정하고 효소 활성을 비교하여, 활성이 증진된 5'-크산틸산 아미나아제 변이체를 지닌 에세리키아 콜리 JM105 형질전환체를 획득하였다.
전기의 탐색과정을 통하여 얻어진 5'-크산틸산 아미나아제 돌연변이 유전자를 지닌 플라스미드 pG3와 야생형의 5'-크산틸산 아미나아제 유전자를 지닌 플라스미드 pG1을 적절한 제한 효소 처리 및 라이게이션을 수행하고 실시예 1과 동일한 조건으로 돌연변이 유발형 PCR을 수행한 후, 전기의 활성 비교 스크리닝법을 통해, 활성이 모 효소에 비해 증진된 유전자를 지닌 플라스미드 pF12, pF63, pCJ-G3-1, pCJ-F12-1 및 pCJ-F63-1을 얻었다.
전기 실시예 1과 실시예 2에 기술된 활성이 증진된 5'-크산틸산 아미나아제의 변이체를 제조하는 과정을 도1에 개략적으로 도시하였다.
실시예 2에 기술된 5'-크산틸산 아미나아제의 변이체의 라이브러리 규모 및 변이체에 대한 기술을 표 1에 정리하였다.
5'-크산틸산 아미나아제의 분자 진화 과정 및 선택된 변이체
1R 2R
모계 유전자 guaA 야생형 유전자 야생형 유전자, G3
라이브러리 제조법 돌연변이 유발형 PCR 제한 효소 절단, 돌연변이 유발형 PCR
라이브러리 크기 > ~ 10 5 > ~ 1,500
1차 스크리닝 ~ 2 X 10 3 ~ 1,500
2차 스크리닝 73 개 콜로니 66 개 콜로니
얻어진 변이체 G3 F12, F63, G3-1, F12-1, F63-1
실시예 3: 5'- 크산틸산 아미나아제 변이체를 암호화하는 유전자의 염기서열 결정
실시예 1 및 2에서 제조된 5'-크산틸산 아미나아제 변이체의 유전자 서열은 Applied Biosystem 사의 automatic sequencer ABI3730xl을 사용하여 결정하였다. 각각의 염기서열은 서열번호 3(G3), 서열번호 5(F12), 서열번호 7(F63), 서열번호 9(G3-1), 서열번호 11(F12-1) 및 서열번호 13(F63-1)으로 확인되었는 바, 각각의 아미노산 서열을 추정하여 서열번호 4(G3), 서열번호 6(F12), 서열번호 8(F63), 서열번호 10(G3-1), 서열번호 12(F12-1) 및 서열번호 14(F63-1)로 나타내었다. 아울러, 전기 G3, F12, F63, G3-1, F12-1 및 F63-1을 각각 포함하는 플라즈미드 지도를 도 3a, 3b, 3c, 3d, 3e 및 3f에 각각 나타내었다.
전기 pG3에 포함된 고활성의 5'-크산틸산 아미나아제 변이체인 G3 유전자의 염기배열로부터 G3의 아미노산 배열을 추정하여 이를 서열번호 4로 나타내었다. 또한, pF12에 포함된 고활성의 5'-크산틸산 아미나아제 변이체인 F12 유전자의 염기배열로부터 F12의 아미노산 배열을 추정하여 이를 서열번호 6으로 나타내었다. 마찬가지로, pF63에 포함된 고활성의 5'-크산틸산 아미나아제 변이체인 F63 유전자의 염기배열로부터 F63의 아미노산 배열을 추정하여 이를 서열번호 8로 나타내었다. 또한, pG3-1에 포함된 고활성의 5'-크산틸산 아미나아제 변이체인 G3-1 유전자의 염기배열로부터 G3-1의 아미노산 배열을 추정하여 이를 서열번호 10으로 나타내었다. 또한, pCJ-F12-1에 포함된 고활성의 5'-크산틸산 아미나아제 변이체인 F12-1 유전자의 염기배열로부터 F12-1의 아미노산 배열을 추정하여 이를 서열번호 12로 나타내었다. 마찬가지로, pCJ-F63-1에 포함된 고활성의 5'-크산틸산 아미나아제 변이체인 F63-1 유전자의 염기배열로부터 F63-1의 아미노산 배열을 추정하여 이를 서열번호 14로 나타내었다.
본 발명의 고활성 5'-크산틸산 아미나아제인 G3, F12, F63, G3-1, F12-1 및 F63-1의 아미노산 서열을 서열번호 2의 야생형 5'-크산틸산 아미나아제의 아미노산 서열과 비교할 경우, 각각 2개, 2개, 4개, 4개, 3개 및 6개의 아미노산이 치환되어 새로운 아미노산 배열을 갖는 단백질임을 확인할 수 있었다.
즉, G3의 경우 52번째 및 191 번째 아미노산 서열이 각각 시스틴 및 쓰레오닌으로, F12의 경우 93번째 및 152번째 아미노산 서열이 각각 발린 및 프롤린으로, F63의 경우 93번째, 113번째, 191번째, 및 467번째 아미노산 서열이 각각 발린, 알라닌, 쓰레오닌, 및 글리신으로 치환되었음을 확인할 수 있었고, G3-1의 경우 52번째, 191 번째, 153 번째, 및 454 번째 아미노산 서열이 각각 시스틴, 쓰레오닌, 아르기닌, 및 이소로이신으로, F12-1의 경우 93번째, 152번째, 및 454번째 아미노산 서열이 각각 발린, 프롤린, 및 이소로이신으로, 그리고 F63-1의 경우 93번째, 100번째, 113번째, 191번째, 454번째, 및 467번째 아미노산 서열이 각각 발린, 이소로이신, 알라닌, 쓰레오닌, 이소로이신, 및 글리신으로 치환되었음을 확인할 수 있었다.
상술한 아미노산 서열 및 활성 측정 탐색법에 의하여, 본 발명의 G3, F12, F63, G3-1, F12-1 및 F63-1은 아미노산 배열이 기존의 에세리키아 콜리 5'-크산틸산 아미나아제와 상이할 뿐 아니라 고활성을 지닌 신규의 5'-크산틸산 아미나아제로 판단할 수 있다.
실시예 4: 5'- 크산틸산 아미나아제 변이체의 상시발현 벡터 제조
상기 얻어진 고활성 5'-크산틸산 아미나아제 변이체를 상시 발현 벡터를 이용하여 발현시키기 위하여 아래의 과정을 수행하였다.
5'-크산틸산 아미나아제 야생형 및 변이체의 유전자를 CJ1 프로모터를 지니고 에세리키아 콜리와 코리네박테리움 암모니아게네스에서 증폭이 가능한 복제 기원을 지닌 상시 발현벡터인 pECG117-CJ1에 작동 가능하도록 연결한 재조합 플라스미드를 제작하였다. 돌연변이 유발형 중합효소 연쇄반응을 수행하였다. 돌연변이 유발형 중합효소 연쇄반응에 사용된 프라이머는 서열번호 25의 N-말단 프라이머(guaA-f)와 서열번호 26의 C-말단 프라이머(guaA-r)를 사용하였으며, 이는 에세리키아 콜리로부터 유래된 5'-크산틸산 아미나아제 유전자의 염기서열에 근거하여 합성하였다.
서열번호 25: 5' ACGTGCCGGCATGACGGAAAACATTCATAAGC 3'
서열번호 26: 5' ACGTGGATCCTCATTCCCACTCAATGGTAGC 3'
PCR 반응액은 각각 0.4 mM의 상기 N-프라이머 및 C-프라이머, 주형으로 pG1, pCJ-G3-1, pCJ-F12-1 및 pCJ-F63-1 각각 5 ng, 10 mM 트리스 완충액 (Tris-HCl, pH 8.3), 50 mM KCl, 7 mM MgCl2, 0.2 mM dATP, 0.2 mM dGTP, 0.2 mM dCTP, 0.2 mM dTTP 및 Pfu 중합효소 5 효소단위(unit)를 포함하도록 50 mL를 조제하였다. 이어 반응액을 94oC에서 1분, 50oC에서 1분, 72oC 에서 1분의 조건으로 25회 수행 후, 72oC에서 5분간 PCR을 수행하여 유전자를 얻었다.
상기와 같이 증폭된 PCR 산물들은 한천 겔 전기 영동법을 통해 분리하였고, 증폭 분리된 DNA 단편을 제한효소 NaeI 과 BamHI로 절단한 후, 5'-크산틸산 아미나아제 발현 벡터로 유용한 pECG117-CJ1에 접합시켜 재조합 플라스미드를 제작하였다(도 2). 상기 5'-크산틸산 아미나아제의 야생형 및 변이체를 포함하는 발현벡터를 각각 pCJ1-G1 (야생형), pCJ1-G3-1, pCJ1-F12-1 및 pCJ1-F63-1로 명명하였으며, 상기 제작된 벡터의 개요를 도 4a, 4b, 4c 및 4d에 나타내었다.
실시예 5: 암모니아 특이적 5'- 크산틸산 아미나아제의 제조
5'-크산틸산 아미나아제의 야생형 및 전기 실시예에서 얻은 고활성 5'-크산틸산 돌연변이체를 이용하여 암모니아 특이적 5'-크산틸산 아미나아제 변이체를 제조하기 위하여, 이들 단백질의 86 번째 시스테인을 알라닌으로 특이적으로 변이시키기 위한 프라이머를 제작하고 이를 서열번호 27 및 서열번호 28로 나타내었다.
서열번호 27: 5'CCGGTATTCGGCGTTGCATATGGCATGCAGACCATG 3'
서열번호 28: 5'CATGGTCTGCATGCCATATGCAACGCCGAATACCGG 3'
상기 프라이머를 이용하여 위치 특이적 변이(site-directed mutagenesis)를 수행하였다. 이를 위하여 Stratagene 사의 QuickChange II XL Site-Directed Mutagenesis kit를 이용하였다. 수행 방법은 제조사에서 제공한 방법에 의하여 실시되었다. 얻어진 콜로니에서 플라스미드를 공지의 방법을 통하여 추출하고, 이를 이용하여 염기서열을 결정하였다. 이를 통해 5'-크산틸산 아미나아제 야생형 및 상기 변이체의 돌연변이를 유지하고 추가로 86 번째의 시스테인이 알라닌으로 치환된 신규의 5'-크산틸산 아미나아제 변이체를 얻었으며, 이들을 각각 G1C, G3C, F12C 및 F63C로 명명하였다.
원하는 위치에 정확한 변이를 획득하였는지 평가하기 위하여, 5'-크산틸산 아미나아제의 변이체의 유전자의 서열을 Applied Biosystem 사의 automatic sequencer ABI3730xl을 사용하여 결정하였다. 각각의 염기서열은 서열번호 15(G1C), 서열번호 17(G3C), 서열번호 19(F12C), 및 서열번호 21(F63C)로 확인되었는 바, 각각의 아미노산 서열을 추정하여 서열번호 16(G1C), 서열번호 18(G3C), 서열번호 20(F12C) 및 서열번호 22(F63C)로 나타내었다. 상기 5'-크산틸산 아미나아제의 변이체를 포함하는 발현벡터를 제작하고 이들을 각각 pCJ1-G1C, pCJ1-G3C, pCJ1-F12C, 및 pCJ1-F63C로 명명하였으며, 상기 제작된 벡터의 개요를 도 4e, 4f, 4g 및 4h에 나타내었다.
실시예 6: 5'- 크산틸산 아미나아제 변이체의 활성 평가
5'-크산틸산 아미나아제의 비활성 증가를 확인하기 위하여, 우선 SDS-PAGE 겔상의 단백질 발현 양을 농도 분석기를 통하여 확인하였다. 이 때, 각 변이체의 발현량은 유사한 것으로 나타나 5'-크산틸산 아미나아제 활성의 증가가 비활성의 증가에 의한 것임을 알 수 있었다.
5'-크산틸산 아미나아제 변이체의 활성을 비교하기 위하여 아래의 과정을 진행하였다. 우선 박토 트립톤 16 g/L, 효모 추출물 10 g/L, NaCl 5 g/L, 카나마이신 50 mg/L 로 한 25 mL 배지에 각 변이체를 접종하고 37oC에서 12 시간 배양하였다. 변이체를 회수한 후, 1mL의 변이체 배양액에 20 mL의 크실렌을 첨가하고 이를 37oC에서 20 분간 250 rpm으로 방치하였다. 이를 1/10 희석하고 암모니아에 대한 반응 활성을 측정하기 위하여 30 mM XMP, 13 mM ATP, 16 mM MgSO4 7H2O, 10 mM (NH4)2SO4를 200 mM Trizma HCl 완충액(pH 8.6)에 녹인 반응액 800 mL에 200 mL의 효소액을 섞고, 42 oC에서 15 분간 반응을 진행 시켰다. L-글루타민에 대한 활성을 측정하기 위하여 시료 200 mL를 0.175 % TCA 용액 3.8 mL에 섞어 반응을 중지시켰다. 30 mM XMP, 13 mM ATP, 16 mM MgSO4 7H2O, 5 mM L-글루타민을 200 mM Trizma HCl 완충액 (pH 8.6)에 녹인 반응액 800 mL에 200 mL의 1/10 희석된 효소액을 섞고, 42 oC에서 15 분간 반응을 진행시켰다. 상기 반응액을 HPLC를 이용해서 생성된 GMP 량을 비교하였다. 이 때, 5'-크산틸산 아미나아제의 효소활성은 1 분당 1 mmol의 5'-구아닐산이 생성되는 조건을 1 단위활성으로 정하였다. HPLC 분석 조건은 다음과 같다.
Eluent: A: 0.02 % 테트라부틸암모늄 디히드로젠인산,
0.2 % 암모늄 디히드로젠인산, pH 2.4
Eluent B: 아세토니트릴
A : B = 97 : 3
측정 파장: 254 nm
유속 : 1.0 mL/min
분석된 변이체의 활성은 암모니아를 기질로 이용하였을 경우 반응액 1mL 당 야생형의 5'-크산틸산 아미나아제가 13.61 단위활성(U/ml)이었고, 변이체인 G3-1는 17.62 단위활성(U/ml), 변이체인 F12-1는 20.82 단위활성(U/ml), 변이체 F63-1은 16.47(U/ml)이었다. 암모니아 특이적인 5'-크산틸산 아미나아제 변이체인 G1C는 22.64 (U/mL), G3C는 19.30 (U/mL), F12C는 22.76 (U/mL), 그리고 F63C는 19.62 (U/mL)이었다.
반면 L-글루타민을 기질로 이용하였을 경우, 야생형 균주의 활성은 단위액 당 8.32(U/mL)이고, 변이체인 G3-1의 경우는 19.15(U/mL), F12-1의 경우는 4.31(U/mL), F63-1의 경우는 0.54(U/mL)의 활성을 보인 반면, 암모니아 특이적인 5'-크산틸산 변이체인 G1C는 0.21(U/mL), G3C는 0.16 (U/mL), F12C는 0.24 (U/mL), 그리고 F63는 0.40(U/mL)으로 나타났다.
상기 결과로부터, 암모니아 특이적인 5'-크산틸산 변이체는 L-글루타민을 기질로 하는 경우에는 5'-크산틸산의 5'-구아닐산으로의 전환 활성을 거의 나타내지 못하는 반면, 암모니아를 기질로 하는 경우, 상응하는 야생형 또는 무작위 돌연변이체에 비해 약 1.4 배 내지 1.7 배 정도 증진된 전환 활성을 보임을 확인할 수 있었다(도 5).
실시예 7. 암모니아 특이적 5'- 크산틸산 아미나제 변이체의 발현벡터의 안정성 비교
암모니아 특이적 5'-크산틸산 아미나제 변이체의 발현벡터의 세포내 안정성을 비교하기 위하여, 배양 후 남아 있는 발현벡터의 양을 비교하였다.
배양 후 발현벡터의 유지량을 비교하기 위하여, 배양 종결 후 배양액을 10-5으로 희석하고, 이를 카나마이신 50 g/mL를 포함하는 LB 배지(Bacto-Trypton 1 %, Yeast Extract 1 %, NaCl 0.5 %)와 항생제를 포함하지 않은 LB 배지에 도말한 후, 30℃에서 16 시간 배양하여 형성된 콜로니의 수를 비교하였다. 이를 상대 수치화하여 도 6에 나타내었다.
그 결과, 암모니아 특이적 5'-크산틸산 아미나아제 변이체 중 G1C 유전자를 포함하는 발현 벡터의 경우 54.3 %의 콜로니가 상기 발현 벡터를 포함하고 있는 반면, 야생형의 5'-크산틸산 아미나아제의 경우 36.0 %의 콜로니만이 상기 유전자의 발현 벡터를 포함하고 있었다. 이로부터, 암모니아 특이적 5'-크산틸산 아미나아제의 경우 세포 내에 발현 벡터를 더욱 잘 유지하고 있고, 그 결과 활성의 증진이 일어남을 알 수 있다.
이상 상세히 설명하고 입증한 바와 같이, 본 발명은 조미 성분으로 유용한 5'-구아닐산을 효과적으로 생산하기 위하여, 5'-크산틸산을 5'-구아닐산으로 전환시키는 5'-크산틸산 아미나아제의 야생형 및 이의 활성이 증진된 무작위 돌연변이에 의해 제조된 5'-크산틸산 아미나아제 변이체에 암모니아 특이적인 성질을 부여한 암모니아 특이적 5'-크산틸산 아미나아제 변이체 및 이의 제조 방법을 제공하였다. 따라서, 본 발명에 따른 5'-크산틸산 아미나아제 변이체는, 야생형에 비하여 활성이 증진되면서도 세포 독성이 감소하여 세포 내에서 보다 안정적으로 유지됨으로써, 5'-구아닐산을 생산하는 생물공정에 유용하게 활용될 수 있다.
<110> CJ Corporation <120> Ammonia specific 5'-XMP aminase mutant <160> 28 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1578 <212> DNA <213> Escherichia coli K12 <220> <221> gene <222> (1)..(1578) <223> DNA sequence for XMP aminase wild type gene G1 (guaA) <220> <221> CDS <222> (1)..(1575) <223> amino acid sequence of XMP aminase wild type G1 <400> 1 atg acg gaa aac att cat aag cat cgc atc ctc att ctg gac ttc ggt 48 Met Thr Glu Asn Ile His Lys His Arg Ile Leu Ile Leu Asp Phe Gly 1 5 10 15 tct cag tac act caa ctg gtt gcg cgc cgc gtg cgt gag ctg ggt gtt 96 Ser Gln Tyr Thr Gln Leu Val Ala Arg Arg Val Arg Glu Leu Gly Val 20 25 30 tac tgc gaa ctg tgg gcg tgg gat gtg aca gaa gca caa att cgt gac 144 Tyr Cys Glu Leu Trp Ala Trp Asp Val Thr Glu Ala Gln Ile Arg Asp 35 40 45 ttc aat cca agc ggc att att ctt tcc ggc ggc ccg gaa agt act act 192 Phe Asn Pro Ser Gly Ile Ile Leu Ser Gly Gly Pro Glu Ser Thr Thr 50 55 60 gaa gaa aac agt ccg cgt gcg ccg cag tat gtc ttt gaa gca ggc gta 240 Glu Glu Asn Ser Pro Arg 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act caa ctg gtt gcg cgc cgc gtg cgt gag ctg ggt gtt 96 Ser Gln Tyr Thr Gln Leu Val Ala Arg Arg Val Arg Glu Leu Gly Val 20 25 30 tac tgc gaa ttg tgg gcg tgg gat gtg aca gaa gca caa att cgt gac 144 Tyr Cys Glu Leu Trp Ala Trp Asp Val Thr Glu Ala Gln Ile Arg Asp 35 40 45 ttc aat cca tgc ggc att att ctt tcc ggc ggc ccg gaa agt act act 192 Phe Asn Pro Cys Gly Ile Ile Leu Ser Gly Gly Pro Glu Ser Thr Thr 50 55 60 gaa gaa aac agt ccg cgt gcg ccg cag tat gtc ttt gaa gca ggc gta 240 Glu Glu Asn Ser Pro Arg Ala Pro Gln Tyr Val Phe Glu Ala Gly Val 65 70 75 80 ccg gta ttc ggc gtt tgc tat ggc atg cag acc atg gca atg cag ttg 288 Pro Val Phe Gly Val Cys Tyr Gly Met Gln Thr Met Ala Met Gln Leu 85 90 95 ggc ggt cac gtt gaa gcc tct aac gaa cgt gaa ttt ggc tac gcg cag 336 Gly Gly His Val Glu Ala Ser Asn Glu Arg Glu Phe Gly Tyr Ala Gln 100 105 110 gtt gaa gtc gta aac gac agc gca ctg gtt cgc ggt atc gaa gat gcg 384 Val Glu Val Val Asn Asp Ser Ala Leu Val Arg Gly Ile Glu Asp Ala 115 120 125 ctg acc gca gac ggt aaa ccg ctg ctc gat gtc tgg atg agc cac ggc 432 Leu Thr Ala Asp Gly Lys Pro Leu Leu Asp Val Trp Met Ser His Gly 130 135 140 gat aaa gtt acc gct att ccg tcc gac ttc atc acc gta gcc agc acc 480 Asp Lys Val Thr Ala Ile Pro Ser Asp Phe Ile Thr Val Ala Ser Thr 145 150 155 160 gaa agc tgc ccg ttt gcc att atg gct aac gaa gaa aaa cgc ttc tat 528 Glu Ser Cys Pro Phe Ala Ile Met Ala Asn Glu Glu Lys Arg Phe Tyr 165 170 175 ggc gta cag ttc cac ccg gaa gtg act cat acc cgc cag ggt acg cgc 576 Gly Val Gln Phe His Pro Glu Val Thr His Thr Arg Gln Gly Thr Arg 180 185 190 atg ctg gag cgt ttt gtg cgt gat atc tgc cag tgt gaa gcc ctg tgg 624 Met Leu Glu Arg Phe Val Arg Asp Ile Cys Gln Cys Glu Ala Leu Trp 195 200 205 acg cca gcg aaa att atc gac gat gct gta gct cgc atc cgc gag cag 672 Thr Pro Ala Lys Ile Ile Asp Asp Ala Val Ala Arg Ile Arg Glu Gln 210 215 220 gta ggc gac gat aaa gtc atc ctc ggc ctc tct ggt ggt gtg gat tcc 720 Val Gly Asp Asp Lys Val Ile Leu Gly Leu Ser Gly Gly Val Asp Ser 225 230 235 240 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atg gca atg cag ttg 288 Pro Val Phe Gly Val Ala Tyr Gly Met Gln Thr Met Ala Met Gln Leu 85 90 95 ggc ggt cac gtt gaa gcc tct aac gaa cgt gaa ttt ggc tac gcg cag 336 Gly Gly His Val Glu Ala Ser Asn Glu Arg Glu Phe Gly Tyr Ala Gln 100 105 110 gtt gaa gtc gta aac gac agc gca ctg gtt cgc ggt atc gaa gat gcg 384 Val Glu Val Val Asn Asp Ser Ala Leu Val Arg Gly Ile Glu Asp Ala 115 120 125 ctg acc gca gac ggt aaa ccg ctg ctc gat gtc tgg atg agc cac ggc 432 Leu Thr Ala Asp Gly Lys Pro Leu Leu Asp Val Trp Met Ser His Gly 130 135 140 gat aaa gtt acc gct att ccg tcc gac ttc atc acc gta gcc agc acc 480 Asp Lys Val Thr Ala Ile Pro Ser Asp Phe Ile Thr Val Ala Ser Thr 145 150 155 160 gaa agc tgc ccg ttt gcc att atg gct aac gaa gaa aaa cgc ttc tat 528 Glu Ser Cys Pro Phe Ala Ile Met Ala Asn Glu Glu Lys Arg Phe Tyr 165 170 175 ggc gta cag ttc cac ccg gaa gtg act cat acc cgc cag ggt acg cgc 576 Gly Val Gln Phe His Pro Glu Val Thr His Thr Arg Gln Gly Thr Arg 180 185 190 atg ctg gag cgt ttt gtg cgt gat atc tgc cag tgt gaa gcc ctg tgg 624 Met Leu Glu Arg Phe Val Arg Asp Ile Cys Gln Cys Glu Ala Leu Trp 195 200 205 acg cca gcg aaa att atc gac gat gct gta gct cgc atc cgc gag cag 672 Thr Pro Ala Lys Ile Ile Asp Asp Ala Val Ala Arg Ile Arg Glu Gln 210 215 220 gta ggc gac gat aaa gtc atc ctc ggc ctc tct ggt ggt gtg gat tcc 720 Val Gly Asp Asp Lys Val Ile Leu Gly Leu Ser Gly Gly Val Asp Ser 225 230 235 240 tcc gta acc gca atg ctg ctg cac cgc gct atc ggt aga aac ctg act 768 Ser Val Thr Ala Met Leu Leu His Arg Ala Ile Gly Arg Asn Leu Thr 245 250 255 tgc gta ttc gtc gac aac ggc ctg ctg cgc ctc aac gaa gca gag cag 816 Cys Val Phe Val Asp Asn Gly Leu Leu Arg Leu Asn Glu Ala Glu Gln 260 265 270 gtt ctg gat atg ttt ggc gat cac ttt ggt ctt aac att gtt cac gta 864 Val Leu Asp Met Phe Gly Asp His Phe Gly Leu Asn Ile Val His Val 275 280 285 ccg gca gaa gat cgc ttc ctg tca gcg ctg gct ggc gaa aac gat ccg 912 Pro Ala Glu Asp Arg Phe Leu Ser Ala Leu Ala Gly Glu Asn Asp Pro 290 295 300 gaa gca aaa cgt aaa atc atc ggt cgc gtt ttc gtt gaa gta ttc gat 960 Glu Ala Lys Arg Lys Ile Ile Gly Arg Val Phe Val Glu Val Phe Asp 305 310 315 320 gaa gaa gcg ctg aaa ctg gaa gac gtg aag tgg ctg gcg cag ggc acc 1008 Glu Glu Ala Leu Lys Leu Glu Asp Val Lys Trp Leu Ala Gln Gly Thr 325 330 335 atc tac cct gac gtt atc gaa tct gcg gcg tct gca acc ggt aaa gca 1056 Ile Tyr Pro Asp Val Ile Glu Ser Ala Ala Ser Ala Thr Gly Lys Ala 340 345 350 cac gtc atc aaa tct cac cac aac gtg ggc ggc ctg ccg aaa gag atg 1104 His Val Ile Lys Ser His His Asn Val Gly Gly Leu Pro Lys Glu Met 355 360 365 aag atg ggc ctg gtt gaa ccg ctg aaa gag ctg ttc aaa gac gaa gtg 1152 Lys Met Gly Leu Val Glu Pro Leu Lys Glu Leu Phe Lys Asp Glu Val 370 375 380 cgt aag att ggt ctg gag ctg ggc ctg ccg tac gac atg ctg tac cgt 1200 Arg Lys Ile Gly Leu Glu Leu Gly Leu Pro Tyr Asp Met Leu Tyr Arg 385 390 395 400 cac ccg ttc ccg gga cca ggc ctt ggc gtt cgt gtt ctg ggt gaa gtg 1248 His Pro Phe Pro Gly Pro Gly Leu Gly Val Arg Val Leu Gly Glu Val 405 410 415 aag aaa gag tac tgt gac ctg ctg cgc cgt gct gac gcc atc ttc att 1296 Lys Lys Glu Tyr Cys Asp Leu Leu Arg Arg Ala Asp Ala Ile Phe Ile 420 425 430 gaa gaa ctg cgt aaa gcg gac ctg tac gac aaa gtc agc cag gcg ttc 1344 Glu Glu Leu Arg Lys Ala Asp Leu Tyr Asp Lys Val Ser Gln Ala Phe 435 440 445 act gtg ttc ctg ccg ata cgt tcc gtt ggc gta atg ggc gat ggt cgt 1392 Thr Val Phe Leu Pro Ile Arg Ser Val Gly Val Met Gly Asp Gly Arg 450 455 460 aag tat gac tgg gtt gtc tct ctg cgt gct gtc gaa acc atc gac ttt 1440 Lys Tyr Asp Trp Val Val Ser Leu Arg Ala Val Glu Thr Ile Asp Phe 465 470 475 480 atg acc gca cac tgg gcg cat ctg ccg tac gat ttc ctc ggt cgc gtt 1488 Met Thr Ala His Trp Ala His Leu Pro Tyr Asp Phe Leu Gly Arg Val 485 490 495 tcc aac cgc att atc aat gaa gtg aac ggt att tcc cgc gtg gtg tat 1536 Ser Asn Arg Ile Ile Asn Glu Val Asn Gly Ile Ser Arg Val Val Tyr 500 505 510 gac atc agc ggc aag ccg cca gct acc att gag tgg gaa tga 1578 Asp Ile Ser Gly Lys Pro Pro Ala Thr Ile Glu Trp Glu 515 520 525 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Met Leu Glu Arg Phe Val Arg Asp Ile Cys Gln Cys Glu Ala Leu Trp 195 200 205 acg cca gcg aaa att atc gac gat gct gta gct cgc atc cgc gag cag 672 Thr Pro Ala Lys Ile Ile Asp Asp Ala Val Ala Arg Ile Arg Glu Gln 210 215 220 gta ggc gac gat aaa gtt atc ctc ggc ctc tct ggt ggt gtg gat tcc 720 Val Gly Asp Asp Lys Val Ile Leu Gly Leu Ser Gly Gly Val Asp Ser 225 230 235 240 tcc gta acc gca atg ctg ctg cac cgc gct atc ggt aaa aac ctg act 768 Ser Val Thr Ala Met Leu Leu His Arg Ala Ile Gly Lys Asn Leu Thr 245 250 255 tgc gta ttc gtc gac aac ggc ctg ctg cgc ctc aac gaa gca gag cag 816 Cys Val Phe Val Asp Asn Gly Leu Leu Arg Leu Asn Glu Ala Glu Gln 260 265 270 gtt ctg gat atg ttt ggc gat cac ttt ggt ctt aac att gtt cac gta 864 Val Leu Asp Met Phe Gly Asp His Phe Gly Leu Asn Ile Val His Val 275 280 285 ccg gca gaa gat cgc ttc ctg tca gcg ctg gct ggc gaa aac gat ccg 912 Pro Ala Glu Asp Arg Phe Leu Ser Ala Leu Ala Gly Glu Asn Asp Pro 290 295 300 gaa gca aaa cgt aaa atc atc ggt cgc gtt ttc gtt gaa gta 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<213> Artificial Sequence <400> 22 Met Thr Glu Asn Ile His Lys His Arg Ile Leu Ile Leu Asp Phe Gly 1 5 10 15 Ser Gln Tyr Thr Gln Leu Val Ala Arg Arg Val Arg Glu Leu Gly Val 20 25 30 Tyr Cys Glu Leu Trp Ala Trp Asp Val Thr Glu Ala Gln Ile Arg Asp 35 40 45 Phe Asn Pro Ser Gly Ile Ile Leu Ser Gly Gly Pro Glu Ser Thr Thr 50 55 60 Glu Glu Asn Ser Pro Arg Ala Pro Gln Tyr Val Phe Glu Ala Gly Val 65 70 75 80 Pro Val Phe Gly Val Ala Tyr Gly Met Gln Thr Met Val Met Gln Leu 85 90 95 Gly Gly His Ile Glu Ala Ser Asn Glu Arg Glu Phe Gly Tyr Ala Gln 100 105 110 Ala Glu Val Val Asn Asp Ser Ala Leu Val Arg Gly Ile Glu Asp Ala 115 120 125 Leu Thr Ala Asp Gly Lys Pro Leu Leu Asp Val Trp Met Ser His Gly 130 135 140 Asp Lys Val Thr Ala Ile Pro Ser Asp Phe Ile Thr Val Ala Ser Thr 145 150 155 160 Glu Ser Cys Pro Phe Ala Ile Met Ala Asn Glu Glu Lys Arg Phe Tyr 165 170 175 Gly Val Gln Phe His Pro Glu Val Thr His Thr Arg Gln Gly Thr Arg 180 185 190 Met Leu Glu Arg Phe Val Arg Asp Ile Cys Gln Cys Glu Ala Leu Trp 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405 410 415 Lys Lys Glu Tyr Cys Asp Leu Leu Arg Arg Ala Asp Ala Ile Phe Ile 420 425 430 Glu Glu Leu Arg Lys Ala Asp Leu Tyr Asp Lys Val Ser Gln Ala Phe 435 440 445 Thr Val Phe Leu Pro Ile Arg Ser Val Gly Val Met Gly Asp Gly Arg 450 455 460 Lys Tyr Gly Trp Val Val Ser Leu Arg Ala Val Glu Thr Ile Asp Phe 465 470 475 480 Met Thr Ala His Trp Ala His Leu Pro Tyr Asp Phe Leu Gly Arg Val 485 490 495 Ser Asn Arg Ile Ile Asn Glu Val Asn Gly Ile Ser Arg Val Val Tyr 500 505 510 Asp Ile Ser Gly Lys Pro Pro Ala Thr Ile Glu Trp Glu 515 520 525 <210> 23 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for mutagenesis of guaA <400> 23 cgcgaattca tgacggaaaa cattcataa 29 <210> 24 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for mutagenesis of guaA <400> 24 ctagtctaga tcattcccac tcaatggt 28 <210> 25 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for mutagenesis of guaA <400> 25 acgtgccggc atgacggaaa acattcataa gc 32 <210> 26 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for mutagenesis of guaA <400> 26 acgtggatcc tcattcccac tcaatggtag c 31 <210> 27 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for mutagenesis of guaA <400> 27 ccggtattcg gcgttgcata tggcatgcag accatg 36 <210> 28 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for mutagenesis of guaA <400> 28 catggtctgc atgccatatg caacgccgaa taccgg 36

Claims (10)

  1. 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 야생형 에세리키아 콜리 또는 서열번호 4, 6, 8, 10, 12 또는 14의 아미노산 서열을 갖는 활성 증진되도록 변이된 에세리키아 콜리 유래의 5'-크산틸산 아미나아제의 N말단으로부터 86번째 시스테인을 알라닌으로 치환하여 제조되는, 암모니아 특이적인 5'-크산틸산 아미나아제 변이체.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 서열번호 16, 18, 20 또는 22의 아미노산 서열을 갖는 암모니아 특이적 5'-크산틸산 아미나아제 변이체.
  5. 제4항의 5'-크산틸산 아미나아제 변이체를 코딩하는 핵산 분자.
  6. 제5항의 핵산 분자를 포함하는 발현벡터.
  7. 제6항의 발현벡터로 형질전환된 원핵세포인 형질전환체.
  8. 제1항 또는 제4항의 암모니아 특이적 5'-크산틸산 아미나아제 변이체를 사용하여 5'-크산틸산을 5'-구아닐산으로 전환시키는 방법.
  9. 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12 또는 14의 아미노산 서열을 갖는 에세리키아 콜리 유래의 5'-크산틸산 아미나아제의 N 말단으로부터 86번째 아미노산 잔기인 시스테인을 알라닌으로 치환하는 것을 포함하는, 글루타민에는 반응하지 않고 암모니아에만 특이적으로 반응하여 증가된 활성으로 5'-크산틸산을 5'-구아닐산으로 전환시키는 암모니아 특이적 5'-크산틸산 아미나아제 변이체의 제조 방법.
    .
  10. 제9항에 있어서, 5'-크산틸산 아미나아제의 86번 아미노산 잔기를 알라닌, 글리신 및 세린으로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산으로 치환하는 것인 방법.
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