KR100463118B1

KR100463118B1 - 데코이닌 내성을 갖는 대장균변이주

Info

Publication number: KR100463118B1
Application number: KR10-1998-0056576A
Authority: KR
Inventors: 이재환; 한종권; 오윤석; 이광호; 김동우; 이재흥
Original assignee: 씨제이 주식회사
Priority date: 1998-12-16
Filing date: 1998-12-16
Publication date: 2005-04-08
Also published as: KR20000040840A

Abstract

본 발명은 5'-구아닐산(GMP)의 제조시 5'-크산틸산(XMP)에서 GMP로 전환시키는 반응에 필요한 대장균 유래 5'-크산틸산 아미나제(XMP aminase)를 고농도 GMP에 의한 저해작용으로부터 해제하여 그의 비효소역가(specific activity)를 증가시키고자 하는 목적으로 돌연변이원을 처리하여 얻어진 데코이닌 내성을 갖는 대장균 변이주 KD113 및 이를 이용한 GMP의 제조방법에 관한 것이다.

Description

데코이닌 내성을 갖는 대장균 변이주{Mutant strain of E. coli having resistance to decoyinine}

본 발명은 데코이닌 내성을 갖는 대장균 변이주에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 데코이닌 내성이 부여되어 고농도의 5'-구아닐산(GMP) 하에서도 높은 XMP 아미나제 효소역가를 나타내는 신규한 대장균 변이주 및 상기 변이주를 이용한 GMP의 제조방법에 관한 것이다.

퓨린계 핵산의 일종인 5'-구아닐산은 5'-이노신산(IMP) 및 5'-크산틸산(XMP)과 더불어 정미성이 뛰어난 핵산계 조미료로서 널리 알려져 있는 물질이다. 종래에 알려진 GMP의 제조방법으로는 효모의 리보핵산을 리보뉴클레아제, 포스포디에스터라제 등의 효소에 의해 가수분해시키는 방법과 미생물에 의하여 제조된 구아노신을 인산화시키는 방법 등이 있으나, 이들 방법은 원료 공급의 문제라든가 수율 및 생산량이 적은 점 등의 여러 가지 단점이 있다. 또한, GMP의 제조방법으로는 변이주에 의한 미생물의 직접 발효법도 알려져 있으나, 생체내 GMP의 합성경로가 매우 복잡한 조절 기작을 보이고 있어 목적물 이외에 부산물이 생성되며 최종 산물인 GMP의 세포막 투과성이 매우 낮아 배지 중에 그 축적량이 작기 때문에 계면활성제나 방부제를 첨가하는 방법 등을 사용하여야 하므로 공업적인 면에서 실용성이 희박한 제조방법으로 알려져 있다. 근래에는 미생물 변이주를 이용하여 배양액에 XMP를 축적하고, 여기에 5'-크산틸산 아미나제가 강화된 변이주(코리네형 미생물 또는 대장균)를 이용하여 XMP를 GMP로 전환시키는 2단계의 생산방법이 널리 이용되고 있다(일본 공개특허 출원 제85-224498호, 일본 특허공고 제39069/71호, 일본 특허공개 제78697/84호 및 대한민국 특허공고 제78-344호).

여기서 5'-크산틸산 아미나제는 다음과 같은 반응 기전을 갖고 있다:

1) XMP + ATP + NH₃ - - - - - - - - - → GMP + AMP + PPi (인산)

5'-크산틸산 아미나제

2) XMP + ATP + L-글루타민 - - - - - - - -→ GMP + AMP + L-글루타민산 + PPi

5'-크산틸산 아미나제

상기 방법에 의해 5'-크산틸산 아미나제를 강화하여야 효율적인 GMP 생산이 이루어지게 된다. 최근 논문(Biosci. Biotech. Biochem. 61(3), 840-845, 1997)에 의하면 야생 대장균으로부터 클로닝된 5'-크산틸산 아미나제의 유전자(guaA)를 함유하는 유전자 재조합 대장균을 이용한 GMP의 전환반응이 보고된 바 있다. 그러나, 야생주로부터 유래된 5'-크산틸산 아미나제는 효소 특성상 고농도의 AMP 및 GMP 존재하에서 역가가 저해되는 현상이 있기 때문에 고농도의 XMP를 대량으로 GMP로 전환시켜야 하는 산업용 균주로는 부적절한 특징을 갖고 있다. 따라서, 산업용 균주로 사용하기 위해서는 5'-크산틸산 아미나제 효소를 XMP 및 GMP와 같은 핵산 유도체들에 의한 저해작용으로부터 해제시켜 줄 필요가 있다.

본 발명은 5'-구아닐산의 제조시 XMP에서 GMP로 전환시키는 반응에 필요한 대장균 유래 5'-크산틸산 아미나제의 효소역가를 증가시키기 위해 대장균에 돌연변이원을 처리하여 데코이닌 내성 대장균을 만드는 것이다. 데코이닌 내성을 부여하는 목적은 5'-크산틸산 아미나제의 고농도 GMP에 의한 저해작용을 해제함으로써 상기 효소의 역가를 증가시키기 위함이다.

본 발명은 5'-크산틸산 아미나제의 효소 역가가 증가되고 데코이닌에 내성을 갖는 대장균 KD113(Escherichia coli KD113)을 제공한다. 본 발명의 균주는 1998년 12월 12일자로 한국종균협회에 KFCC-11067로 기탁되었다.

다른 관점에서, 본 발명은 상기 균주 KFCC-11067을 사용하여 XMP로부터 GMP를 고수율로 제조하는 방법을 제공한다.

본 발명에서는 대장균 유래 XMP 아미나제의 저해현상을 해제하기 위해 대장균에 돌연변이원을 처리하여 데코이닌을 비롯한 퓨린계 아날로그 내성을 갖고 있는 변이주들을 선발하였고 선발된 변이주에서 과량의 GMP에 의한 5'-크산틸산 아미나제의 저해효과가 제거되었음이 확인되었다.

내성을 유도하는 퓨린계 아날로그 물질로는 데코이닌(Decoyinine, Biomol), 사이코퓨라닌(Psicofuranine, 자체 합성), 머캅토퓨린(6-Mercaptopurine, sigma)을 사용하였다. 데코이닌은 안구스트마이신 에이(Angustmycin A)라고도 하며 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스(Streptomyces hygroscopicus)에서 유래된 물질로 아데닌 아날로그로서 비경쟁적으로 5'-크산틸산 아미나제의 활성을 저해하는 물질이다. 사이코퓨라닌은 안구스트마이신 C 라고도 하며 데코이닌과 같이 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스에서 유래된 물질로 아데닌 아날로그로서 비경쟁적으로 5'-크산틸산 아미나제의 활성을 저해하는 물질이다.

본 발명에서 사용된 균주는 다음의 표 1과 같다.

[표 1]

본 발명은 하기 실시예로 보다 구체적으로 예시될 것이다.

실시예 1

데코이닌 등의 퓨린계 아날로그 내성 균주의 유발

대장균 야생균주인 W3110 균주를 37℃의 온도로 LB배지(효모 추출액 5g/l, 트립톤 10 g/l, 염화나트륨 10 g/l)에서 16시간 동안 진탕 배양한다. 이를 다시 LB배지에 흡광도(560nm)가 0.3 이하가 되도록 접종 후 37℃의 온도에서 흡광도(560nm)가 1.0이 될 때까지 진탕 배양 후 원심분리기를 사용하여 균체를 회수한다. 살균한 식염수를 이용하여 1회 세척한 후 동일 부피의 식염수에 현탁한다. 상기 현탁액에 돌연변이원으로 N-메틸-N-니트로-니트로소구아니딘을 80 균체/ml의 농도로 첨가하여 얼음 속에서 1 시간 정치한 후 식염수로 3회 세척한다. 식염수로 현탁 후 적당한 비율로 희석하여 데코이닌 농도가 0 내지 3.0 mg/ml, 사이코퓨라닌 농도 0 내지 3.0 mg/ml, 머캅토퓨린 0 내지 3.0 mg/ml씩 함유된 최소 한천 평면배지(염화나트륨 0.5 g/l, 염화암모늄 1 g/l, 인산제2수소칼륨 3 g/l, 한천 15 g/l, 글루코우스 8 g/l, 인산2나트륨 12.4 g/l, pH 7.2)에 도말한다. 1 내지 5일간 37℃에서 정치배양해서 균주들의 생장속도를 비교하면서 변이주를 얻었다. 이의 결과는 표 2, 3 및 4에 기재하였다.

[표 2]

데코이닌 농도에 따른 야생균주 및 변이균주의 성장정도

[표 3]

사이코퓨라닌 농도에 따른 야생균주 및 변이균주의 성장정도

[표 4]

머캅토퓨린 농도에 따른 야생균주 및 변이균주의 성장정도

실시예 2

변이주에서 과량의 GMP에 의한 5'크산틸산 아미나제의_저해효과 제거 확인

변이균주들과 모균주를 LB 배지에서 진탕배양하고 난 후 원심분리하여 균체를 회수하고 적당량의 0.1M 트리스 완충액(pH 7.3)에 현탁하여 초음파 균체 분쇄기(ultrasonicator)로 균체를 분쇄한 뒤 원심분리하여 얻어진 상등액을 농축하여 효소액으로 사용하였다. 이렇게 하여 얻어진 효소액에 GMP가 0 내지 100 mg/ml의 농도로 포함된 2.4ml의 5'-크산틸산 아미나제 반응액(0.16M 트리스(pH 7.6), 8mM ATP, 16mM 염화마그네슘, 25mM XMP, 0.33M 황산암모늄)을 첨가하여 35 내지 50℃에서 30분 내지 1시간 반응시킨 뒤, 0.1ml 반응액을 2.9ml의 0.175% 트리클로로아세트산에 첨가하여 원심분리한 후 HPLC로 분석하였다. 변이균주인 KD113과 KP119의 경우 모균주에 비해 약 3 내지 7배 정도의 5'-크산틸산 아미나제의 비효소 활성(Specific enzyme activity)의 증가함을 볼 수 있었고 고농도 GMP에 의한 5'-크산틸산 아미나제의 저해효과가 제거되었음을 알 수 있었다. 특히, 사이코퓨라닌 내성변이주보다는 데코이닌 내성 변이주에서 비효소 활성의 증가 효과가 뚜렷하였으며 GMP의 저해 효과 제거 정도도 데코이닌 내성 변이주가 더 좋았다. 그러나, 머캅토퓨린 내성 변이주의 경우에는 모균주와 큰 차이를 나타내지 않았다. 이 결과는 표 5에 기재하였다.

[표 5]

고농도 GMP 존재 하에서 5'-크산틸산 아미나제의 비 활성도

*효소 활성의 단위(U)는 단위 분당 형성되는 마이크로그람 GMP를 나타낸다.

실시예 3

변이균주들의 XMP에서 GMP로의 전환반응 비교

실시예 1에서 얻어진 변이균주들과 모균주를 LB 배지에서 진탕배양하고 난후 원심분리하여 균체를 회수하고 적당량의 0.1M 트리스 완충액(pH 7.3)에 현탁하여 초음파 균체분쇄기(ultrasonicator)로 균체를 분쇄한 뒤 원심분리하여 얻어진 상등액을 농축하여 효소액으로 사용하였다. 이렇게 하여 얻어진 효소액에 2.4ml의 5'-크산틸산 아미나제 반응액(0.16M 트리스(pH 7.6), 10mM ATP, 16mM 염화마그네슘, 35mM XMP, 0.33M 황산암모늄)을 첨가하여 35 내지 50℃에서 6시간 반응시킨뒤, 0.1ml 반응액을 2.9ml의 0.175% 트리클로로아세트산에 첨가한 후 원심분리하여 HPLC로 분석하였다. 변이균주인 KD113와 KP119의 경우 모균주에 비해 경시적인 GMP 생성량이 증가됨을 볼 수 있었으며 역시 사이코퓨라닌 내성 변이주보다는 데코이닌 내성 변이주가 큰 효과를 나타내었다. 그러나 머캅토퓨린 내성 변이주의 경우에는 모균주와 큰 차이를 보이지 않았다. 결과는 표 6에 기재하였다.

[표 6]

변이균주들에 의한 경시적 GMP의 생성량 (g/l)

본 발명의 데코이닌 내성을 갖는 대장균 변이주 KD113은 높은 5'-크산틸산 아미나제 효소 역가를 나타내고 GMP를 고수율로 생산할 수 있어 산업적으로 매우 유용한 균주라 할 것이다.

Claims

5'-크산틸산 아미나제 효소 역가가 개선된 데코이닌 내성을 갖는 대장균 KD113(KFCC-11067),
5'-크산틸산으로부터 5'-구아닐산을 제조하는 방법에 있어서 제1항의 대장균 KD113을 사용하는 방법.