KR102208956B1 - β-아가라아제 DagA 효소의 과발현 유도 기술의 개발 - Google Patents

β-아가라아제 DagA 효소의 과발현 유도 기술의 개발 Download PDF

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Abstract

본 발명은 β-아가라아제(β-agarase) Dag A 효소가 과발현 되어 있는 형질전환 방선균 균주 및 상기 균주를 개발하는 방법에 관한 것이다. 또한 상기 형질전환 방선균 균주를 이용하여 인 비보(in vivo)에서 네오아가로헥사오스 또는 네오아가로테트라오스를 생산하는 방법에 관한 것이다.

Description

β-아가라아제 DagA 효소의 과발현 유도 기술의 개발{DEVELOPMENT OF TECHNOLOGY FOR INDUCING AN OVEREXPRESSION OF β-AGARASE DagA ENZYME}
본 발명은 β-아가라아제(β-agarase) DagA 효소를 과발현할 수 있는 형질전환 방선균 균주 및 이를 개발하는 방법에 관한 것이다.
전통적으로 물에 녹여 식용으로 사용되기도 하는 한천 또는 우뭇가사리는 홍조류의 세포벽을 이루고 있는 다당류 성분으로, 대체로 40%의 아가로펙틴과 60%의 아가로오스로 구성되어 있다.
상기 한천은 화학적 또는 효소를 이용하여 미백, 보습, 항균, 항염증 등의 다양한 효능을 나타내는 네오아가로올리고당(neoagarooligosaccharide; NAO)으로 가수분해 될 수 있다. 상기 네오아가로올리고당 중 한천의 중간산물에 해당하는 네오아가로헥사오스(neoagarohexose) 및 네오아가로테트라오스(neoagarotetrose)는 피로회복, 항비만, 항당뇨 등에 특히 효능이 존재한다고 보고되어 있다.
한편 다양한 효능이 존재하는 네오아가로올리고당을 제조하기 위하여 화학적 방법을 사용하는 경우 시간적, 비용적 이득이 존재하지만, 화학적 방법을 통해 가수분해 하는 경우 유독성 물질인 5-하이드로옥시메틸퍼퓨말(5-HMF)가 함께 생성된다는 문제점으로 인해 의약품 및 화장품 산업에 바로 적용하기 어렵다.
이에 상기와 같은 문제점을 극복하고자 화학적 방법이 아닌, 가수분해 효소를 이용하여 네오아가로올리고당을 생산하는 방법을 사용하고 있다. 구체적으로, 상기 한천을 가수분해 하는데 사용되는 효소들로는 한천의 α-1,3 결합을 자르는 효소인 α-아가라아제(EC 3.2.1.158)와 β-1,4 결합을 자르는 효소인 β-아가라아제(EC 3.2.1.81)가 존재한다. α-아가라아제는 α-1,3 결합이 절단된 아가로올리고당(agarooligosaccharide)들을 생성할 수 있고, β-아가라아제를 이용하여 한천을 가수분해 하는 경우에는 β-1,4 결합이 절단된 네오아가로올리고당(neoagarooligosaccharide)들을 생성할 수 있다.
한편 상기 가수분해에 사용되는 β-아가라아제는 Psedoalteronomonas, Alteromonas, Micrococcus, Vivrionaceae 등과 같은 해양 유래 미생물뿐만 아니라, 이차 대사산물을 생산하는 토양미생물인 스트렙토마이세스 코엘리컬라 (Streptomyces coelicolor) A3(2)에서도 발견된다.
상기 스트렙토마이세스 코엘리컬라 A3(2)에 존재하는 β-아가라아제는 DagA, DagB 및 DagC 효소로 구성되어 있으며(도 1), 상기 3개의 효소를 코딩하는 유전자는 클러스터 형태로 게놈 유전자 상에 존재한다. 상기 DagA 효소는 아가로오스를 네오아가로헥사오스(Neoagarohexaose, 이하 'NA6'라고 함)와 네오아가로테트라오스(neoagarotetraose, 이하 'NA4'라고 함)로 분해하며, sco3471 유전자에 의해 코딩되고, 309개의 아미노산(예상 분자량 35 kDa)을 가지며, 세포 밖으로 분비되는 경우 32 kDa의 크기를 갖는다. 또한 상기 DagB 효소는 네오아가로올리고당을 네오아가로바이오스로 분해하거나, DagA가 생산한 NA4와 NA6를 네오아가로바이오스로 분해하며, sco3487 유전자에 의해 코딩된다. 또한 상기 DagC 효소는 세포 내에서 DagB가 생산한 네오아가로바이오스가 세포 내로 흡수되면, 단당류인 D-갈락토오스(D-galactose)와 3,6-안하이드로-L-갈락토오스(3,6-anhydro-L-galactose, 3,6-ANG)로 분해하는 기능을 가진 것으로 추정하고 있다.
도 2에서 보는 바와 같이 상기 효소들은 한천을 최종적으로 세포 내 흡수될 수 있는 형태인 네오아가로바이오스 형태로 분해하는 바, 중간 산물에 해당하는 네오아가로헥사오스 및 네오아가로테트라오스만을 얻기 위해서는 아가로오스를 네오아가로헥사오스와 네오아가로테트라오스로 분해하는 DagA 효소를 상기 스트렙토마이세스 코엘리컬라 A3(2)로부터 분리하여, 한천의 가수분해 반응을 인 비트로(in vitro) 내에서 수행하여야 한다는 한계점이 존재하였다.
이에, 인 비트로(in vitro)에서 β-아가라아제 효소를 이용한 네오아가로헥사오스 및 네오아가로테트라오스의 생산 효율을 향상시키기 위해 DagA 효소를 높은 수율로 수득할 수 있는 기술, 나아가 인 비트로가 아닌 인 비보(in vivo)에서 네오아가로헥사오스 및 네오아가로테트라오스를 매우 효율적으로 생산해 낼 수 있는 기술에 대한 연구가 여전히 필요한 실정이다.
본 발명은 β-아가라아제(β-agarase) DagA 효소가 과발현되는 형질전환 방선균 균주 및 이의 제조 방법을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명은 상기 균주를 이를 이용한 β-아가라아제 DagA 효소의 생산 방법을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명은 β-아가라아제 DagA 효소의 분리 및 정제 과정 없이, 인 비보(in vivo)에서 네오아가로헥사오스나 네오아가로테트라오스를 생산하는 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 일 측면은 sco3485 유전자 및/또는 sco3487 유전자의 활성이 감소 또는 상실된, β-아가라아제(β-agarase) DagA 효소 과발현 형질전환 방선균 균주를 제공한다.
또한, 본 발명의 다른 측면은 상기 형질전환 방선균 균주의 제조 방법을 제공한다.
또한, 본 발명의 또 다른 측면은 상기 형질전환 방선균 균주를 배양하는 단계, 및 상기 배양된 형질전환 방선균 균주로부터 β-아가라아제 DagA 효소를 분리하는 단계를 포함하는 β-아가라아제 DagA 효소의 생산 방법을 제공한다.
또한, 본 발명의 또 다른 측면은 sco3485 유전자 및 sco3487 유전자 유전자의 활성이 감소 또는 상실된 형질전환 방선균 균주를 한천이 포함된 배양액 내에서 배양하는 단계를 포함하는, 네오아가로헥사오스 또는 네오아가로테트라오스를 인 비보(in vivo)에서 생산하는 방법을 제공한다.
본 발명의 형질전환 방선균 균주는 β-아가라아제(β-agarase) DagA 효소를 과발현하기 때문에, 이를 이용하면 상기 β-아가라아제 DagA 효소를 높은 수율로 수득할 수 있다. 뿐만 아니라, 본 발명의 상기 형질전환 방선균 균주를 이용하면, 별도로 효소의 정제 또는 분리 공정 없이, 인 비보(in vivo)에서 바로 네오아가로헥사오스나 네오아가로테트라오스를 생산해 낼 수 있어서, 네오아가로헥사오스나 네오아가로테트라오스의 생산 효율을 현저히 향상시킬 수 있다.
도 1은 스트렙토마이세스 코엘리컬라(Streptomyces coelicolor)의 β-아가라아제(β-agarase) 유전자 클러스터 모식도를 나타내는 도면이다.
도 2는 효소 종류에 따른 아가로오스 분해 모식도를 나타내는 도면이다.
도 3의 (A) 내지 (C)는 sco3485 유전자의 활성을 감소 또는 상실시키기 위한 벡터 모식도 및 중합효소연쇄반응을 통해 제작된 벡터의 사이즈를 확인한 결과를 나타내는 도면이다.
도 4의 (A) 내지 (C)는 형질전환 CRI3485 균주 내에 sco3485 유전자의 활성이 감소 또는 상실되어 있는지 확인하기 위하여 중합효소연쇄반응 및 유전자서열분석을 수행한 결과를 나타내는 도면이다.
도 5의 (A) 내지 (C)는 sco3487 유전자의 활성을 감소 또는 상실시키기 위한 벡터 모식도 및 중합효소연쇄반응을 통해 제작된 벡터의 사이즈를 확인한 결과를 나타내는 도면이다.
도 6의 (A) 내지 (C)는 형질전환 CRIDb 균주 내에 sco3487 유전자의 활성이 감소 또는 상실되어 있는지 확인하기 위하여 중합효소연쇄반응 및 유전자서열분석을 수행한 결과를 나타내는 도면이다.
도 7의 (A) 및 (B)는 형질전환 CRI85B 균주 내에 sco3487 및 sco3485 유전자의 활성이 감소 또는 상실되어 있는지 확인하기 위하여 중합효소연쇄반응 및 유전자서열분석을 수행한 결과를 나타내는 도면이다.
도 8은 형질전환 CRIDb 균주에서 얻어진 배양액 내 단백질을 통해 아가로오스와 반응시킨 물질을 TLC 크로마토그래피를 통해 확인한 결과를 나타내는 도면이다.
도 9 내지 도 11은 각각 배양액 내 포함되는 탄소원을 달리하여 단백질 생성에 따른 표현형을 확인하기 위하여 자이모그램 어세이(zymogram assay)를 수행하여 확인한 결과를 나타내는 도면이다.
도 12의 (A) 및 (B)는 형질전환 CRIDb 균주, CRI3485 균주 및 CRI85B 균주의 β-아가라아제 DagA 효소 단백질 발현 정도를 웨스턴 블롯 분석을 통해 확인한 결과를 나타내는 도면이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
1. β-아가라아제(β-agarase) DagA 효소 과발현 형질전환 방선균 균주 및 이의 제조 방법
본 발명의 일 측면은 β-아가라아제 DagA 효소 과발현을 위한 형질전환 방선균 균주를 제공한다.
본 발명의 상기 β-아가라아제 DagA 효소 과발현을 위한 형질전환 방선균 균주에서는 sco3485 유전자의 활성이 감소 또는 상실된다.
상기 sco3485 유전자는 β-아가라아제 발현, 특히 DagA 효소를 암호화 하는 유전자의 발현을 억제하는 단백질을 암호화 하는 유전자로, 서열번호 1의 염기 서열을 포함한다.
상기 유전자 활성의 감소 또는 상실은 상기 sco3485 유전자의 전체 염기 서열 또는 일부 염기 서열에, 치환, 결실, 삽입 또는 이들의 조합에 따른 변이를 유도하여 달성될 수 있다. 상기 유전자의 변이는 종래 녹-아웃이나 녹-다운이라고 일컬어지는 통상의 방법을 통해 달성될 수 있는 것이고, 일 예로 CRISPR-Cas9 등과 같은 유전자 편집 기술을 통해 달성될 수 있다.
상기와 같이 sco3485 유전자의 활성이 감소 또는 상실됨으로써, β-아가라아제 DagA 효소의 발현을 억제할 수 없는바, 이와 같이 형질전환된 방선균 균주에서는 β-아가라아제 DagA 효소가 과발현된다. 본 발명의 구체적인 실시예에서는 상기 sco3485 유전자의 활성을 감소 또는 상실시킨 CRI3485 균주에서 DagA 효소의 발현이 증가되는 것을 확인하였다(도 12 참조).
또한, 본 발명의 상기 β-아가라아제 DagA 효소 생산을 위한 형질전환 방선균 균주에서는 sco3487 유전자의 활성이 추가로 감소 또는 상실될 수 있다.
상기 sco3487 유전자는 β-아가라아제 DagB 효소를 암호화하는 유전자로, 서열번호 10의 염기 서열을 포함한다.
상기 sco3487 유전자가 암호화하는 β-아가라아제 DagB 효소는 방선균 균주 내에서 네오아가로올리고당을 네오아가로바이오스로 분해하거나, β-아가라아제 DagA 효소에 의해 생성된 네오아가로헥사오스나 네오아가로테트라오스를 네오아가로바이오스로 분해한다. 본 발명의 구체적인 실시예에서는 상기 sco3487 유전자의 활성을 감소 또는 상실시킨 CRIDb 균주를 아가로오스가 포함되어 있는 배지에서 배양한 뒤, 상기 배양액을 TLC 크로마토그래피를 이용하여 성분 분석한 결과, 상기 배양액에서는 네오아가로바이오스가 생성되지 않음을 확인하였다(도 8 참조).
상기 sco3487 유전자의 활성의 감소 또는 상실 역시 종래 녹-아웃이나 녹-다운이라고 일컬어지는 통상의 방법을 이용하여 해당 유전자를 변이시킴으로써 달성될 수 있는 것이고, 일 예로 CRISPR-Cas9 등과 같은 유전자 편집 기술을 통해 달성될 수 있다.
상기와 같이 sco3485 유전자에 더하여, sco3487 유전자의 활성까지 추가로 감소 또는 상실된 형질전환 방선균 균주에서는 β-아가라아제 DagA 효소가 더욱 과발현될 수 있다. 본 발명의 구체적인 실시예에서는 sco3485 유전자 및 sco3487 유전자의 활성을 감소 또는 상실 시킨 CRI85B 균주에서 DagA 효소의 발현이 상기 CRI3485 균주에 비하여 더욱 효과적으로 발현이 증가되는 것을 확인하였다(도 12 참조).
본 발명의 다른 측면은 β-아가라아제 DagA 효소의 과발현 형질전환 방선균 균주의 제조 방법을 제공한다.
본 발명의 상기 제조 방법은 방선균 균주에서 sco3485 유전자의 활성을 감소 또는 상실시키는 단계를 포함한다.
상기 sco3485 유전자의 활성을 감소 또는 상실시키는 단계는 sco3485 유전자의 전체 염기 서열 또는 일부 염기 서열에, 치환, 결실, 삽입 또는 이들의 조합에 따른 변이를 유도하여 달성될 수 있다. 상기 유전자의 변이는 종래 녹-아웃이나 녹-다운이라고 일컬어지는 통상의 방법을 통해 달성될 수 있는 것이고, 일 예로 CRISPR-Cas9 시스템 등과 같은 유전자 편집 기술을 수행함으로써 달성될 수 있다.
상기 형질전환 방선균 균주의 유전자 변이를 위한 녹-아웃이나 녹-다운은 세포 내 유전자의 활성을 감소 또는 상실 시킬 수 있는 물질을 도입하는 본 기술 분야에 알려진 적당한 형질전환 방법에 따라 이루어질 수 있으며, 일 예로 대장균 접합(conjugation) 등과 같은 형질전환 방법을 통해 달성될 수 있다.
상기 CRISPR-Cas9 시스템은 유전자의 표적 부위에 특이적으로 결합하는 가이드 RNA가 표적 유전자의 부위를 인식하고, 상기 가이드 RNA가 Cas9 단백질과 복합체를 형성하여 Cas9 단백질이 엔도뉴클레아제 활성을 갖도록 한 뒤, 일부가 결실된 상동성 염기 서열을 주형 가닥으로 하여 상동성-지향 수선(Homology-directed repair; HDR)이 수행되도록 함으로써 유전자 편집이 달성될 수 있도록 한다. 본 발명의 구체적인 실시예에서는 상기 CRISPR-Cas9 시스템을 적용한 dCRI3485 벡터를 이용하여, 상기 sco3485 유전자의 64 bp를 결실시킴으로써 상기 sco3485 유전자의 활성을 감소 또는 상실시킬 수 있음을 확인하였다(도 4 참고).
본 발명의 상기 제조 추가적으로 sco3487 유전자의 활성도 감소 또는 상실시키는 단계를 더 포함한다. 상기 sco3487 유전자의 활성의 감소 또는 상실은 유전자 변이를 위한 녹-아웃이나 녹-다운을 통해 수행될 수 있고, 앞서 설명한 CRISPR-Cas9 등과 같은 유전자 편집 기술을 통해 달성될 수 있는바, 이에 대해서는 구체적인 설명은 생략하도록 한다. 본 발명의 구체적인 실시예에서는 상기 CRISPR-Cas9 시스템을 적용한 dCRIDb 벡터를 이용하여, 상기 sco3487 유전자의 28 bp를 결실시킴으로써 상기 sco3487 유전자의 활성을 감소 또는 상실시킬 수 있음을 확인하였다(도 6 참고).
한편, 상기 sco3485 유전자와 상기 sco3487 유전자의 활성을 감소 또는 상실시키는 과정은 순차적으로 수행될 수도 있고, 또는 동시에 수행될 수도 있다.
상기와 같이sco3485 유전자와 sco3487 유전자의 활성이 모두 감소 또는 상실시킴으로써, β-아가라아제 DagA 효소가 더욱 과발현된 형질전환 방선균 균주를 제조할 수 있다.
2. β-아가라아제(β-agarase) DagA 효소의 생산 방법
본 발명의 다른 측면은 β-아가라아제 DagA 효소를 생산하는 방법을 제공한다.
본 발명의 β-아가라아제 DagA 효소의 생산 방법은 상기 상기 “1. β-아가라아제(β-agarase) DagA 효소 과발현 형질전환 방선균 균주 및 이의 제조 방법 ” 항목에서 설명한 형질전환 방선균 균주를 배양하는 단계 및 상기 배양된 방선균 균주로부터 β-아가라아제 DagA 효소를 분리하는 단계를 포함한다.
상가 형질전환 방선균 균주에서는 β-아가라아제 DagA 효소가 과발현되기 때문에, 이를 이용하면 β-아가라아제 DagA 효소를 효율적으로 생산해 낼 수 있고, 이에 대해서는 상기 “1. β-아가라아제(β-agarase) DagA 효소 과발현 형질전환 방선균 균주 및 이의 제조 방법 ” 항목의 설명을 원용하여 상세한 설명은 생략하도록 한다.
상기 형질전환 방선균 균주는 β-아가라아제 DagA 효소가 과별현되기 때문에, 이를 이용하면 β-아가라아제 DagA의 생산 수율을 높일 수 있다. 또한, sco3485 유전자와 sco3487 유전자가 모두 활성이 감소 또는 상실되면, β-아가라아제 DagA 효소의 발현이 더욱 증가하므로, 상기 sco3485 유전자와 sco3487 유전자의 활성이 모두 감소 또는 상실된 균주를 이용하여 상기 효소의 생산 효율을 높일 수 있다.
상기 형질전환 방선균 균주의 배양은 본 기술 분야에 알려진 적당한 배지와 배양 조건에 따라 이루어질 수 있다. 통상의 기술자라면 선택되는 형질전환 방선균 균주의 종류에 따라 배지 및 배양조건을 용이하게 조정하여 사용 할 수 있다. 배양 방법은 회분식, 연속식, 유가식, 또는 이들의 조합 배양을 포함할 수 있다.
상기 배지는 다양한 탄소원, 질소원 및 미량원소 성분을 포함할 수 있다.
상기 탄소원은, 예를 들면, 포도당, 자당, 유당, 과당, 말토오스, 전분, 셀룰로오스와 같은 탄수화물, 대두유, 해바라기유, 피마자유, 코코넛유와 같은 지방, 팔미트산, 스테아린산, 리놀레산과 같은 지방산, 글리세롤 및 에 탄올과 같은 알코올, 아세트산과 같은 유기산, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 상기 배양은 글루코스를 탄 소원으로 하여 수행될 수 있다. 상기 질소원은, 펩톤, 효모 추출물, 육즙, 맥아 추출물, 옥수수 침지액(CSL), 및 대두밀과 같은 유기 질소원 및 요소, 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 및 질산암모늄과 같 은 무기 질소원, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 상기 배지는 인의 공급원으로서, 예를 들면, 인산이수소 칼륨, 인산수소이칼륨 및 상응하는 소듐-함유 염, 황산마그네슘 또는 황산철과 같은 금속염을 포함할 수 있다.
또한 아미노산, 비타민, 및 적절한 전구체 등이 배지에 포함될 수 있다. 상기 배지 또는 개별 성분은 배양액에 회분식 또는 연속식으로 첨가될 수 있다.
또한, 배양 중에 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다.
상기와 같은 형질전환 방선균 균주의 배양은 15℃ 내지 40℃에서 수행될 수 있고, 예를 들어, 20℃ 내지 35℃ 또는 25℃ 내지 30℃ 에서 수행될 수 있다. 상기 형질전환 방선균 균주의 배양이 15℃ 미만 또는 40℃ 초과의 온도에서 수행될 경우 상기 β-아가라아제 DagA 효소의 생성량이 충분할 수 없는 문제가 발생하게 된다. 또한 상기와 같은 형질전환 방선균 균주의 배양은 pH 4.3 내지 pH 9.5에서 수행될 수 있고, 바람직하게는 pH 5.0 내지 pH 9.0에서, 더욱 바람직하게는 pH 6.0 내지 pH 8.0에서 수행될 수 있으나, 이에 한정하지 아니한다. 상기와 같은 형질전환 방선균 균주의 배양 pH 조건은 형질전환 방선균 균주의 배양 배지에 수산화암모늄, 수산화칼륨, 암모니아, 인산 및 황산과 같은 화합물을 첨가함으로써 조정할 수 있다. 형질전환 방선균 균주의 배양 pH 조건이 상기 범위를 벗어나는 경우 형질전환 방선균 균주의 생장하기 어렵기 때문에 β-아가라아제 DagA 효소의 발현이 용이하지 않는다는 문제점이 있다.
상기와 같은 형질전환 방선균 균주의 배양을 통해 과발현된 β-아가라아제 DagA 효소는 분리 및 정제될 수 있다.
상기 β-아가라아제 DagA 효소의 분리는 원심분리, 여과 등 당해 분야에서 통상적으로 수행되는 단백질 분리 방법을 통해 수행될 수 있다. 또한, 상기 방법으로 분리된 DagA 효소는 통상의 정제 방법, 예를 들어 염석(예를 들어 황산암모늄 침전, 인산나트륨 침전), 용매 침전(아세톤, 에탄올 등을 이용한 단백질 분획 침전), 투석, 겔 여과, 이온 교환, 역상 칼럼 크로마토그래피와 같은 크로마토그래피 및 한외여과 등의 방법을 단독 또는 조합하여 정제될 수 있다.
상기와 같이 형질전환 방선균 균주로부터 수득된 β-아가라아제 DagA 효소는 인 비트로(in vitro) 환경에서 네오아가로헥사오스나 네오아가로테트라오스를 생성하는데 이용될 수 있다.
3. 네오아가로헥사오스나 네오아가로테트라오스의 인 비보 생산 방법
본 발명의 다른 측면은 네오아가로헥사오스나 네오아가로테트라오스를 인 비보(in vivo) 내에서 생산하는 방법을 제공한다.
본 발명의 네오아가로헥사오스나 네오아가로테트라오스의 인 비보 생산 방법은 상기 “1. β-아가라아제(β-agarase) DagA 효소 과발현 형질전환 방선균 균주 및 이의 제조 방법 ” 항목에서 설명한 균주 중에서, sco3487 유전자와 sco3485 유전자의 활성이 모두 감소 또는 상실된 균주를 이용하고, 이를 한천이 포함된 배양액 내에서 배양하는 단계를 포함한다.
상기와 같이 sco3487 유전자와 sco3485 유전자의 활성이 모두 감소 또는 상실된 균주의 경우에는 β-아가라아제 DagA 효소를 매우 높은 수준으로 발현함과 동시에, β-아가라아제 DagB 효소의 활성이 감소 또는 상실되어 있기 때문에, 이를 한천이 포함된 배지에서 배양하면 β-아가라아제 DagA 효소에 의해 생성된 네오아가로헥사오스나 네오아가로테트라오스가 네오아가로바이오스로 전환되지 않고 그대로 축적된다. 따라서, 상기와 같이 sco3487 유전자와 sco3485 유전자의 활성이 모두 감소 또는 상실된 형질전환 방선균 균주는, 별도의 β-아가라아제 DagA 효소 분리 과정 없이, 인 비보(in vivo) 환경 내에서 곧바로 네오아가로헥사오스나 네오아가로테트라오스를 생산해 낼 수 있다.
또한, 본 발명의 네오아가로헥사오스나 네오아가로테트라오스의 인 비보 생산 방법은 상기 균주가 배양된 배양물로부터 네오아가로헥사오스나 네오아가로테트라오스를 분리 또는 정제하는 단계를 더 포함할 수 있다.
상기 네오아가로헥사오스난 네오아가로테트라오스의 분리 또는 정제는 본 기술 분야에서 알려진 통상의 분리 및 정제 방법을 통해 수행될 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예 및 실험예에 의하여 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 구체적으로 예시하는 것이며, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 실험예에 의해 한정되지 아니한다.
[실시예 1] sco3485 유전자가 녹-다운된 형질전환 방선균 균주의 제조
[1-1] sco3485 유전자 녹-다운용 벡터의 제작
방선균 균주 내에서 sco3485 유전자를 녹-다운시키기 위하여, 도 3의 (B)에 도시된 바와 같은 형태의 벡터를 제작하였다.
먼저, 녹-다운의 대상이 되는 sco3485 유전자의 염기 서열의 일부에 상보적으로 결합할 수 있는 sgRNA를 설계하였다. 상기 설계된 sgRNA가 발현될 수 있도록 하기 위해, 하기 표 1과 같은 염기 서열을 갖는 두 단일 가닥의 DNA 올리고머를 제작한 다음, 이들 두 DNA 올리고머를 서로 어닐링시켜 이중 가닥의 염기 서열로 만들었다. 그런 다음, 상기와 같이 어닐링된 이중 가닥의 염기 서열을 pCRISPomyces-2 벡터(Addgene, 미국)의 BbsI 제한효소 자리에 삽입하였다.
명칭 방향 서열(5'->3') 서열번호
sco3485 sgRNA 정방향 AAACGCCTTCCGCAGGGCGCGTGA 2
역방향 ACGCTCACGCGCCCTGCGGAAGGC 3
또한, 상기 sgRNA에 의해 표적화된 sco3485 유전자의 일부가 CAS9에 의해 절단된 후 HDR(homology directed repair) 방법에 의해 복원될 때, sco3485 유전자의 일부가 결실되도록 하기 위해, 상기 복원의 주형이 되는 염기 서열을 제작하여 pCRISPomyces-2 벡터에 함께 삽입하였다.
상기 복원의 주형이 되는 염기 서열은, 상기 sco3485 유전자의 염기 서열 중 상기 sgRNA에 의해 표적화되는 부분의 상류에 위치하는 1291 bp의 염기 서열(도 3의 (A)의 파란색 사선 부분 참고)과 하류에 위치하는 1055 bp의 염기 서열(도 3의 (A)의 붉은색 사선 부분 참고)을, 각각 하기 표 2에 개시된 프라이머들을 이용한 PCR 반응을 통해 제조한 다음, 이들 두 PCR 산물을 pCRISPomyces-2 벡터의 XbaI 제한효소 자리에 삽입함으로써 제조되었고, 이때 상기 복원의 주형이 되는 염기 서열은 상기 sco3485 유전자 중 68 bp의 갭을 포함하도록 제작되었다.
유전자 위치 이름 서열(5'->3') 서열번호
sco3485 왼쪽 8586-XbaI TCTAGAACGCGAACTTCGAGCCACCGG 4
8586-HindⅢ AAGCTTCGCCGAGGACGCAGCAGGGGAC 5
오른쪽 8485-HindⅢ AAGCTTCGACAGATCAGGGATGAGCAGCG 6
8485-XbaI TCTAGAGCCGTGCGTCGGCAGCGG 7
상기와 같은 과정을 통해 sco3485 유전자의 유전자의 염기 서열 일부에 상보적으로 결합할 수 있는 sgRNA와 sco3485 유전자의 복원의 주형이 되는 염기 서열이 각각 pCRISPomyces-2 벡터의 BbsI 제한효소 자리와 XbaI 제한효소 자리에 삽입된 도 3의 (B)와 같은 맵을 갖는 벡터(이하 'dCRI3485 벡터'라고 함)를 제작하였다.
[1-2] sco3485 유전자가 녹-다운된 방선균 균주의 제조
상기 실시예 [1-1]에서 제작된 dCRI3485 벡터를 E.coli ET12567(puz 8002)에 형질전환시켜 형질전환 E.coli를 제조하였다. 그런 다음, 상기 형질전환 E.coli를 스트렙토마이세스 코엘리컬라(Streptomyces coelicolor)와 접합(conjugation)시켜 접합 균주(conjugant)의 생성을 유도하였다. 상기 접합 균주들을 아프라마이신(apramycin) 및 날리딕스산(nalidixic acid)을 포함하는 배지에 스트리킹(streaking)시켜, E.coli가 제거된 접합 균주를 얻었다.
상기 접합 균주를 41 ℃에서 항생제가 존재하지 않는 R2YE 배지를 이용하여 5일 동안 배양하였다. 그 뒤, 배양액 내 접합 균주를 R2YE가 포함된 플레이트에 도말하여 단일 콜로니가 될 수 있도록 하였다. 상기 단일 콜로니는 R2YE 및 R2YE와 아프라마이신이 함께 포함된 배지에 각각 넣어 배양한 다음, 아프라마이신이 포함되지 않는 배지에서 자라는 단일 콜로니만을 선별하였다.
상기 선별된 단일 콜로니 중 형질전환이 일어난 접합 균주만을 최종적으로 선별하기 위하여, 상기 접합 균주에서 분리된 염색체 DNA(gDNA)를 주형으로 하기 표 3의 프라이머를 이용하여 sco3485 유전자에 대한 PCR 반응을 수행하였다. 그 뒤, 상기 PCR 산물을 1%(W/v) 아가로오스 겔에서 전기영동시켜, PCR 산물의 크기가 야생형에 비해 68 bp 감소된 콜로니를 최종적으로 선별하였다
대상 유전자 방향 프라이머 서열(5'->3') 서열번호
sco3485 정방향 ATGCCCCCTGTCATGAAGGTGG 8
역방향 GACGACACCACGCTCCGGATCA 9
또한 상기 선별된 콜로니에 해당하는 형질전환 접합 균주에서 실제로 sco3485 유전자 68 bp가 제거되어 있는지 확인하기 위하여, 도 4에 도시된 바와 같이 상기 최종적으로 선별된 형질전환 접합 균주의 유전자 대해 염기서열 분석을 수행하였다.
그 결과, 도 4의 (C)에서 보는 바와 같이, 상기 최종적으로 선별된 형질전환 접합 균주의 sco3485 유전자는 약 64 bp가 결실되어 있음을 확인하였다. 이와 같이 확인된 형질전환 접합 균주는 CRI3485 균주로 명명하였다.
[실시예 2] sco3487 유전자가 녹-다운된 형질전환 방선균 균주의 제조
[2-1] sco3487 유전자 녹-다운용 벡터의 제작
방선균 균주 내에서 sco3487 유전자를 녹-다운시키기 위하여, 도 5의 B(B)에 도시된 바와 같은 형태의 벡터를 제작하였다.
상기 벡터의 제작은 상기 실시예 [1-1]의 방법과 동일하게 수행하였다. 다만, 녹-다운의 대상이 되는 sco3487 유전자의 염기 서열 일부에 상보적으로 결합할 수 있는 sgRNA가 발현될 수 있도록 하는 염기 서열은 하기 표 4와 같은 염기 서열을 갖는 두 단일 가닥의 DNA 올리고머를 이용하여 제작하였고, 상기 sgRNA에 의해 표적화된 sco3487 유전자의 일부가 CAS9에 의해 절단된 후 HDR(homology directed repair) 방법에 의해 복원될 때, sco3487 유전자의 일부가 결실되도록 하기 위한, 복원의 주형이 되는 염기 서열은 상기 sco3487 유전자의 염기 서열 중 상기 sgRNA에 의해 표적화되는 부분의 상류에 위치하는 956 bp의 염기 서열(도 5의 (A)의 파란색 사선 부분 참고)과 하류에 위치하는 955 bp의 염기 서열(도 5의 (A)의 붉은색 사선 부분 참고)을, 각각 하기 표 5에 개시된 프라이머들을 이용한 PCR 반응을 통해 제조하였으며, 이때 상기 복원의 주형이 되는 염기 서열은 상기 sco3487 유전자 중 28 bp의 갭을 포함하도록 제작되었다.
명칭 방향 서열(5'->3') 서열번호
sco3487 sgRNA 정방향 ACGCGGCCTGGAAATCGACCCGGA 11
역방향 AAACTCCGGGTCGATTTCCAGGCC 12
유전자 위치 이름 서열(5'->3') 서열번호
sco3487 sgRNA 왼쪽 86-Xba TCTAGAACGTGCGTCCCGAGATGGACATCGCGCG 13
86-Hind AAGCTTCTTGTCGCCGCGACCGACG 14
오른쪽 dagB-Hind AAGCTTACTACTCCTCGTTCTCCGTACGCCCCGAG 15
dagB-Xba TCTAGAAGCTGTAGGTCTCGCCCTGCGCG 16
상기와 같은 과정을 통해 sco3487 유전자의 유전자의 염기 서열 일부에 상보적으로 결합할 수 있는 sgRNA와 sco3487 유전자의 복원의 주형이 되는 염기 서열이 각각 pCRISPomyces-2 벡터의 BbsI 제한효소 자리와 XbaI 제한효소 자리에 삽입된 도 5의 (B)와 같은 맵을 갖는 벡터(이하 'dCRIDb 벡터'라고 함)를 제작하였다.
[2-2] sco3487 유전자가 녹-다운된 방선균 균주의 제조
상기 실시예 [2-1]에서 제작한 dCRIDb 벡터를 이용하여, 상기 실시예 [1-2]와 동일한 방법으로 상기 방선균 균주 내에 sco3487 유전자를 녹-다운시켰다. 단 콜로니를 최종적으로 선별하는데 사용한 sco3487 유전자에 대한 프라이머는 하기 표 6의 염기 서열을 사용하였다.
대상 유전자 방향 프라이머 서열(5'->3') 서열번호
sco3487 sgRNA 정방향 TTGCACCACTCCGCCGCCGC 17
역방향 AGTACGTGCCACCGCCGCCG 18
선별된 접합 균주에서 분리된 염색체 DNA를 주형으로 sco3487 유전자에 대한 PCR 반응을 수행하여 얻은 PCR 산물의 크기가 야생형에 비해 28 bp 감소된 콜로니를 최종적으로 선별하였고, 이렇게 최종적으로 선별된 형질전환 접합 균주의 sco3485 유전자는, 도 6의 (C)에서 보는 바와 같이, 28 bp가 결실되어 있음을 확인하였다. 이와 같이 확인된 형질전환 접합 균주는 CRIDb 균주로 명명하였다.
[실시예 3] sco3485 유전자 및 sco3487 유전자가 녹-다운된 형질전환 방선균 균주의 제조
상기 실시예 [2-2]에서 제조된 CRIDb 균주에, 상기 실시예 [1-1]에서 제작된 dCRI3485 벡터를 상기 실시예 [1-2]와 동일한 방법으로 형질전환시켜, sco3487 유전자 및 sco3485 유전자가 모두 녹-다운된 형질전환 방선균 균주를 제조하였다. 단, 콜로니를 최종적으로 선별하는데 사용한 sco3485 유전자와 sco3487 유전자에 대한 프라이머는 상기 표 3 및 표 6의 염기 서열을 사용하였다.
선별된 접합 균주에서 분리된 염색체 DNA를 주형으로 sco3485 유전자와 sco3487 유전자에 대한 PCR 반응을 수행하여 얻은 PCR 산물의 크기가 각각 야생형에 비해 64 bp 및 28 bp 감소된 콜로니를 최종적으로 선별하였고, 이렇게 최종적으로 선별된 형질전환 접합 균주의 sco3485 유전자는, 도 7에서 보는 바와 같이,
sco3485 유전자의 경우 64 bp가, 그리고 sco3487 유전자의 경우 28 bp가 각각 결실되어 있음을 확인하였다. 이와 같이 확인된 형질전환 접합 균주는 CRI85B 균주로 명명하였다.
[실험예 1] CRIDb 균주의 한천으로부터 생산물 확인
상기 sco3487 유전자가 녹-다운된 CRIDb 균주에서 생성된 효소에 의해 한천으로부터 어떠한 생성물이 생성되는지 확인하였다.
우선 한천이 들어있는 배지에 야생형 방선균 균주와 CRIDb 균주를 5일 동안 배양시켰다. 상기 배양액을 회수하고, 회수된 배양액은 70% 암모늄 설페이트로 침전 시킨 뒤, 1 mg/ml의 농도가 되도록 희석시켰다. 상기 단백질 농축액은 기질인 0.2 % 아가로오스(20 mM Tris-HCl (pH 7.0)에 녹임) 용액과 함께 40 ℃에서 1 시간 및 18 시간 동안 반응시켰다. 상기 반응이 완료된 용액은 10분 동안 가열하고, 얼음에서 차갑게 시키고 TLC 크로마토그램을 수행하였다.
그 결과, 도 8에서 보는 바와 같이, 야생형 방선균 균주에서 분리된 단백질은 아가로오스를 분해하여 네오아가로바이오스, NA6 및 NA4를 생성하였다. 반면, CRIDb 균주에서 분리된 단백질은 아가로오스를 분해하여 NA6 및 NA4만을 생성하였다.
상기 결과를 통해 본 발명에 따른 상기 CRIDb 균주는 Sco3487 유전자가 녹-다운 되어 상기 유전자에 의해 코딩되는 β-아가라아제 DagB 효소가 기능을 발휘하지 못하도록 하기 때문에, 중간 산물인 NA6 및 NA4가 최종산물인 네오아가로바이오스로 분해되지 못하고 축적됨을 알 수 있다.
[실험예 2] CRIDb 균주, CRI3485 균주 및 CRI85B 균주의 표현형 분 석
상기 CRIDb 균주, CRI3485 균주 및 CRI85B 균주의 아가라아제 생산에 따른 표현형을 확인하였다.
상기 균주들은 아가(MM), 아가로오스 및 아가로오스에 갈락토오스(MG)를 각각 탄소원으로 포함하는 배지에서 배양시킨 뒤, 지모그램 어세이(zymogram assay)를 통한 단백질의 활성 측정에 이용하였다.
상기 지모그램 어세이 수행을 위해 우선, 배지에 상기 3종의 균주들을 동일한 크기로 접종시킨 뒤, 28 ℃에서 48 ~ 120 시간 동안 배양 시켰다. 그 뒤, 1L 당 아이오딘(iodine) 25 g 및 아이오딘화 칼륨(potassium iodine) 50 g을 포함하는 루골액(Lugol's solution)을 플레이트 위에 도말하고, 그로 인하여 형성된 환의 형태를 확인하였다.
그 결과, 도 9 내지 도 11에서 보는 바와 같이, 아가만을 탄소원으로 사용한 배지(MM), 아가와 갈락토오스를 포함한 배지(MG)에서는 야생 균주에 비하여 CRI3485 균주 및 CRI85B 균주의 아가라아제 생산에 따른 아가의 분해 영역에 해당하는 클리어 구역(clear zone)이 더 크게 존재하였다. 또한, CRIDb 균주는 아가와 갈락토오스를 포함한 배지에서 야생형과 유사한 클리어 구역을 보였다.
상기 결과를 통해 sco3485 유전자가 코딩하는 단백질은 β-아가라아제 DagA 효소와, 아가로오스를 분해하는 과정에 참여하는 단백질을 코딩하는 유전자의 발현을 억제시킬 수 있음을 알 수 있다. 뿐만 아니라, 클리어 구역의 차이가 초기부터 명확한 차이를 보이는 것을 통해, 상기 유전자는 외부 요인과 관계 없이 초기 유전자 발현을 억제하는 억제자 역할을 하는 것을 알 수 있다. 다만 아가 배지(MM)에서 CRIDb 균주의 sco3485 유전자가 녹-다운 되어 있음에도 성장이 느려지는 현상은 β-아가라아제 DagB 효소가 존재하지 않으면 유일한 탄소원인 아가와 아가로오스를 탄소원으로 쉽게 사용하지 못하기 때문일 수 있다. 이와 같은 현상은 갈락토오스 배지(MG)에 내에서 더욱 명확하고 β-아가라아제 DagA 효소의 발현을 현저하게 을 알 수 있다.
[실험예 3] CRIDb 균주, CRI3485 균주 및 CRI85B 균주의 β-아가라아제 DagA 효소 발현 분석
상기 CRIDb 균주, CRI3485 균주 및 CRI85B 균주로부터 배양액 상에 분비된 β-아가라아제 DagA 효소의 발현양을 비교하기 위하여 웨스턴 블롯을 수행하였다.
한천을 포함하는 액체배지인 RSM3+AO 배지에서 CRIDb 균주, CRI3485 균주 및 CRI85B 균주를 3일 및 5일간 배양시킨 배양액을 회수한 후, β-아가라아제 DagA 효소에 특이적인 항체로 웨스턴 블롯을 수행하여 단백질 발현 양상을 비교 확인하고, 그 결과를 도 12에 나타내었다.
도 12에서 보는 바와 같이, 3일차에 야생형 균주에 비해 β-아가라아제 DagA 효소의 발현양은 각각 CRIDb 균주는 0.3배, CRI3485 균주는 1.6 배, CRI85B 균주는 4.6 배 발현양이 증가하였다. 또한, 5일차에는 야생형 균주에 비해 β-아가라아제 DagA 효소의 발현양은 각각 CRIDb 균주는 0.5배, CRI3485 균주는 4.9배, CRI85B 균주는 8.1배 발현양이 증가하였다
상기 결과를 통해 방선균 균주 내에서 sco3485 유전자를 녹-다운 시키는 경우 β-아가라아제 DagA 효소의 발현이 증가되고, β-아가라아제 DagB 효소를 코딩하는 soc3487 유전자를 함께 녹-다운 시키는 경우에 β-아가라아제 DagA 효소의 발현이 더욱 증가된다는 것을 알 수 있다.
이상에서 본 발명은 기재된 실시예에 대해서만 상세히 설명되었지만 본 발명의 기술사상 범위 내에서 다양한 변형 및 수정이 가능함은 당업자에게 있어서 명백한 것이며, 이러한 변형 및 수정이 첨부된 청구범위에 속함은 당연한 것이다.
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cggctggacg ggtttcaggg caggctgcgc 660 gagctgggcc tggacgacac cgcccacttc gccggaacct tcagcgaggc cggcggatgc 720 gcggcggcac atggactgct tgacgcgcgg ccggagctga ccgcgctgta cgccagcacg 780 ttcccgcagg ccgtcggggt gatgaaggcg gtgcgtgacc gagggtggaa ggtgcccgcc 840 gacgtgtcgc tgatcgcgta cgacgacctc cccatggcgg agttcctcga tcctcccctc 900 accacgctcg ccatgccgct ggcgacgctg ggagccgcgg ccgtcgacgc tctcgtcgac 960 cagatagagg gccgtgtgat cggcagccgt caggtgctgg gggggtacga gatcgtggag 1020 cgggcctcgg tcgccgttcc gcgagtctga 1050 <210> 2 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sco3585 sgRNA <400> 2 aaacgccttc cgcagggcgc gtga 24 <210> 3 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sco3585 sgRNA <400> 3 acgctcacgc gccctgcgga aggc 24 <210> 4 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sco3485 HDR XbaI left <400> 4 tctagaacgc gaacttcgag ccaccgg 27 <210> 5 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sco3485 HDR XbaI left <400> 5 aagcttcgcc gaggacgcag caggggac 28 <210> 6 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sco3485 HDR HindIII Right <400> 6 aagcttcgac agatcaggga tgagcagcg 29 <210> 7 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sco3485 HDR XbaI Right <400> 7 tctagagccg tgcgtcggca gcgg 24 <210> 8 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sco3485 forward primer <400> 8 atgccccctg tcatgaaggt gg 22 <210> 9 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sco3485 reverse primer <400> 9 gacgacacca cgctccggat ca 22 <210> 10 <211> 2397 <212> DNA <213> Streptomyces coelicolor <400> 10 atgaccgtgc acaagcgcgc ttgcaccact ccgccgccgc gagccagcag gtcgttccgc 60 gtgaggtggc ctgtcctgat agcggccgcc tgcgccgggt tagtcctggc gaccaccagc 120 cctccggccg tcgcggccgg cgctcatgac ctcggcgacg agaccatgct ctacgacttc 180 caggacggcc tggtaccggc cgaggtcggc ccgtaccagg cgaagacgac aatcgtcggt 240 cgcggcgaca agaagctccg ggtcgatttc caggcccgga agaactacta ctcctcgttc 300 tccgtacgcc ccgagcccgt gtggaactgg tcggcggagg agtccgagtc gctcggcatc 360 gcgatggagc tcacgaaccc gagcgaccgc tccgtccagc tcacgatcga tctggagagc 420 tcgaccggcg tcgccacccg cagtgtcaac gtcccggccg gcggcggtgg cacgtactac 480 ttcgacgtcg acagccccgc gctccaccgc gacaccgggc tgcgcgccga tccgtcctgg 540 ctcgcggaca aggacgtcac ctctgcggtc tggatgtggg gctccaagga gacggacacg 600 agccgcatca gccagctgaa cttctacgtc gccggcctgc tgcacgaccg gtcggtcatc 660 gtggacgaca tccgcgtcgt ccgtgacgcg ccggcagacc ccgattacct caagggcctg 720 gtcgacgcct tcggtcagaa caacaaggtc gactacaagg gaaaggtctc caggacgtcg 780 gagattcttc ggcagcgcgc tgccgaagcc aaggaccttc gcaggcatcc ggttccggag 840 gaccggtcca ggtacggcgg ctggctgaac ggtccacgac tcgaggcgac gggcaacttc 900 cgcgtggaga agtaccaggg gcggtggacc ctggtggacc ctgacggcta cctgttcttc 960 tcaaccggca tcgacaacgc ccgcatgttc gactccccaa ccacgacggg ttacgacttc 1020 gaccatgacg cgatccagga gctgccgccc cccagcctga cggccggcgg ccccgaggac 1080 ctcaaccgcg tccagaagtc ggcgctgccg acccgcacga agatgtccga aacccgcgcc 1140 gacctcttca gcaagttgcc caagtaccgc acccgcgcgg gcgagggctt cggttacgcc 1200 cccgacaccc tggccggtcc cgtcgcgcag ggcgagacct acagcttcta caaggcgaac 1260 gtcgcccgga agtaccccgg cagcaactac atggagcggt ggcgggacaa cacggtcgac 1320 cggatgctca gctggggctt cacctccttc ggcaactgga ccgacccgga gatgtacgac 1380 aacgaccgta tcccgtactt cgcccacggc tggatcaagg gcgacttcaa gacggtgagc 1440 accggccagg actactgggg cccgatgccg gacccgttcg accccgcgtt ctccgacgcc 1500 gcagccagaa ccgcgcgagc agtcgccgac gaggtcgcgg acagcccgtt ggcgatcggc 1560 gtattcatgg acaacgaact gagctggggc aacgccggca gtttcagcac ccgttacggc 1620 gtcgtcatcg acaccatgtc acgtgacgcg gcagagagcc ccaccaagtc ggcgttctcc 1680 gacgaactgg aggagaagta cgggaccatc gacgctctca acgccgcgtg gcagacgaca 1740 gttccgtcat gggaggcact ccgtagcggc agtgccgacc tcggctccga cgagaccgcg 1800 aaggagtccg actactccgc gctcatgacg ctctacgcca ctcagtactt caagacggtc 1860 gacgccgagc tcgacaaggt catgccggac catctctacg cgggttcgag gttcgccagc 1920 tggggccgca caccggaggt cgtcgaggca gcgagcaagt acgtcgacat catgagctac 1980 aacgagtacc gcgagggact gcacccgagc gagtgggcgt ttctcgaaga gctcgacaag 2040 cccagcctca tcggtgagtt ccacatggga acgaccacta ccgggcagcc gcatccgggt 2100 ctcgtctcgg cgggaacgca ggccgagcgg gcacggatgt acgccgagta catggaacag 2160 ctcatcgaca acccgtacat ggtgggcggc cactggttcc agtatgccga ctcgcccgtg 2220 actggcagag cactcgacgg ggagaactac aacattggct tcgtctccgt cacggaccgt 2280 ccctacccgg agatcgtcgc cgctgcccgc gacgtgaacc agcgtctcta tgaccgccga 2340 tacggcaacc tggccacggc cgagggacat tacaccggtc ggcgttcagc ggagtag 2397 <210> 11 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sco3487 sgRNA <400> 11 acgcggcctg gaaatcgacc cgga 24 <210> 12 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sco3487 sgRNA <400> 12 aaactccggg tcgatttcca ggcc 24 <210> 13 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sco3487 HDR XbaI left <400> 13 tctagaacgt gcgtcccgag atggacatcg cgcg 34 <210> 14 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sco3487 HDR HindIII left <400> 14 aagcttcttg tcgccgcgac cgacg 25 <210> 15 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sco3487 HDR HindIII Right <400> 15 aagcttacta ctcctcgttc tccgtacgcc ccgag 35 <210> 16 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sco3487 HDR XbaI Right <400> 16 tctagaagct gtaggtctcg ccctgcgcg 29 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sco3487 forward primer <400> 17 ttgcaccact ccgccgccgc 20 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sco3487 reverse primer <400> 18 agtacgtgcc accgccgccg 20

Claims (10)

  1. sco3485 유전자의 활성이 감소 또는 상실 된, β-아가라아제(β-agarase) DagA 효소 과발현 형질전환 방선균 균주.
  2. 청구항 1에 있어서,
    상기 sco3485 유전자는 서열번호 1의 염기서열을 갖는 것인, β-아가라아제 DagA 효소 과발현 형질전환 방선균 균주.
  3. 청구항 1에 있어서,
    상기 방선균 균주는 sco3487 유전자의 활성이 추가로 감소 또는 상실된 것인, β-아가라아제 DagA 효소 과발현 형질전환 방선균 균주.
  4. 청구항 3에 있어서,
    상기 sco3487 유전자는 서열번호 10의 염기서열을 갖는 것인, β-아가라아제 DagA 효소 과발현 형질전환 방선균 균주.
  5. 방선균 균주에서 sco3485 유전자의 활성을 감소 또는 상실시키는 단계;를 포함하는 β-아가라아제 DagA 효소 과발현 형질전환 방선균 균주의 제조 방법.
  6. 청구항 5에 있어서,
    sco3487 유전자의 활성을 감소 또는 상실시키는 단계;를 더 포함하는 것인, β-아가라아제 DagA 효소의 과발현 형질전환 방선균 균주의 제조 방법.
  7. 청구항 6에 있어서,
    상기 sco3485 유전자와 상기 sco3487 유전자의 활성을 감소 또는 상실은 순차적으로 또는 동시에 수행되는 것인, β-아가라아제 DagA 효소의 과발현 형질전환 방선균 균주의 제조 방법.
  8. 청구항 1 내지 4 중 어느 하나의 형질전환 방선균 균주를 배양하는 단계; 및
    상기 배양된 방선균 균주로부터 β-아가라아제 DagA 효소를 분리하는 단계;를 포함하는 β-아가라아제 DagA 효소의 생산 방법.
  9. 청구항 3의 형질전환 방선균 균주를 한천이 포함된 배양액 내에서 배양하는 단계;를 포함하는 네오아가로헥사오스 또는 네오아가로테트라오스를 인 비보(in vivo) 내에서 생산하는 방법.
  10. 청구항 9에 있어서,
    상기 배양된 배양물로부터 네오아가로헥사오스 또는 네오아가로테트라오스를 분리 또는 정제하는 단계;를 더 포함하는 것인, 네오아가로헥사오스 또는 네오아가로테트라오스를 인 비보(in vivo) 내에서 생산하는 방법.
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