KR101302655B1

KR101302655B1 - 네오아가로테트라오스 및 네오아가로헥사오스의 제조방법

Info

Publication number: KR101302655B1
Application number: KR1020110094576A
Authority: KR
Inventors: 홍순광; 테무진 오양가; 지원재; 장용근
Original assignee: 명지대학교 산학협력단
Priority date: 2011-09-20
Filing date: 2011-09-20
Publication date: 2013-09-03
Also published as: KR20130030955A

Abstract

본 발명은 네오아가로테트라오스 및 네오아가로헥사오스의 제조방법에 관한 것으로, 구체적으로 스트렙토마이세스 시리칼라 A3(2)(Streptomyces coelicolor A3(2)) 유래 DagA 단백질을 아가로스와 반응시켜 네오아가로테트라오스 및 네오아가로헥사오스를 제조하는 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따라 스트렙토마이세스 시리칼라 유래 아가레이즈를 이용하여 아가로스 또는 아가를 분해하면, 네오아가로테트라오스 및 네오아가로헥사오스를 효율적으로 제조할 수 있고, 본 발명에 따른 최적조건을 적용할 경우 보다 효율적인 제조가 가능하다. 뿐만 아니라 본 발명에 따른 제조방법은 화학적인 방법이 아닌 효소를 사용하는 방법이므로, 친환경적이며 제조된 올리고당의 인체에 대한 부작용이 적어 음식, 화장품 및 의약 산업에서도 유용하게 사용할 수 있다.

Description

네오아가로테트라오스 및 네오아가로헥사오스의 제조방법{Method for production of neoagarotetraose and neoagarohexaose}

본 발명은 네오아가로테트라오스 및 네오아가로헥사오스의 제조방법에 관한 것으로, 구체적으로 스트렙토마이세스 시리칼라 A3(2)(Streptomyces coelicolor A3(2)) 유래 DagA 단백질을 아가로스와 반응시켜 네오아가로테트라오스 및 네오아가로헥사오스를 제조하는 방법에 관한 것이다.

아가(agar)는 꼬시래기(Gracilariales)목과 우뭇가사리(Gelidiales)목의 홍조류 세포 벽에서 발견되는 다당류이다. 이 다당류는 아가로스(agarose)와 아가로펙틴(agaropectin)으로 구성된다. 아가로스는 3-O-linked β-D-galactopyranose와 4-O-linked 3,6-anhydro-α-L-galactopyranose 잔기가 교차되어 구성된 자연의 선형 다당류이며, 아가로펙틴은 황산에스테르(sulfate esters), 피루브산염 아세탈(pyruvate acetal), 메틸 에테르(methyl ethers)로 치환된 유사한 골격으로 구성된다. 따라서 아가를 완전히 소화하면 D-galactose 및 3,6-anhydro-L-galactose가 생성될 것이다. 이들 단량체는 생물정유(biorefining) 또는 생물연료(biofuel) 생산에 사용될 수 있다. 비록 아가의 분해 공정에 고온에서 강산 또는 강염기로 처리하는 화학적인 방법이 사용될 수 있지만, 친환경적이고 부작용이 적은 이유로 효소적인 공정이 선호된다. 또한 효소적인 방법은 음식, 화장품 및 의약 산업에서 유용하게 사용되는 생물학적 기능을 갖는 올리고당을 생산할 수 있다.

아가레즈(agarase)는 작용 방식에 따라 알파-아가레즈와 베타-아가레즈의 두 군으로 분류되는데, 이들은 각각 아가로스에서 α-1,3 결합과 β-1,4 결합을 가수분해한다. 베타-아가레즈는 CAZy 데이터베이스에서 GH16, GH50 및 GH86으로 표시되는 3가지의 다른 글리코시드 가수분해효소(glycoside hydrolase, GH) 패밀리에 속한다. 베타-아가레즈는 아가로스의 효소적 분해반응에 의해 환원된 부위가 D-galactose인 네오아가로-올리고당을 생산하며, Cytophaga, Pseudomonas, Vibrio, Alteromonas, Agarivorans와 같은 속의 다양한 미생물로부터 생산된다. 한편, 알파-아가레즈는 환원된 부위에 3,6-anhydro-L-galactose 잔기를 갖는 아가로-올리고당을 생산한다. 이 효소는 단지 몇 종류의 미생물에 존재하는 것으로 알려졌다. A. agarilytica는 무작위로 아가의 α-(1,3) 결합을 가수분해하며, 최종산물로 아가로테트라오스를 생성하는 알파-아가레즈(AgaA_Aa)를 분비한다. agaA_Aa 유전자에 대해 분석한 결과, 유전자 산물(154kDa)이 베타-아가레즈와 관계가 없지만, 대신 글리코시드 가수분해효소의 새로운 패밀리(GH96)에 속하는 것으로 나타났다.

스트렙토마이세스 시리칼라(Streptomyces coelicolor) A3(2)는 한천분해효소를 세포외부로 분비한다고 알려져 있으며(Stanier et al., 1942, J. Bacteriol.; Hodgson and Chater, 1981, J. Gen.Microbiol.), dagA 유전자가 베타-아가레즈 유전자로 알려져 있다. 또한 이 균주는 방선균의 분자생물학적 연구를 위해 가장 많이 연구되는 균주 중 하나로, 2002년 게놈서열이 분석되어 공개되어 있다(Bantley et al., 2002, Nature).

이에 본 발명자는 효소적인 방법을 이용하여 아가 또는 아가로스를 분해하는 방법을 개발하고자, 베타-아가레즈로 예상되는 스트렙토마이세스 시리칼라 dagA 유전자의 발현시스템을 구축하고, dagA가 암호화하는 단백질인 DagA 단백질의 효소적인 특성 등에 대해 연구하였다. 이의 결과, 스트렙토마이세스 시리칼라의 DagA가 내-형(endo-type) 베타-아가레즈이며, 아가 또는 아가로스와 반응하여 네오아가로테트라오스 및 네오아가로헥사오스를 생산한다는 것을 확인하였고, DagA의 최적 효소활성 조건 등을 확인하여 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서 본 발명의 주된 목적은 효소적인 방법을 이용하여 아가 또는 아가로스를 유용한 올리고당으로 분해하는 방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 이때 사용되는 효소의 최적 반응 조건을 제공하는데 있다.

본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은

스트렙토마이세스 시리칼라(Streptomyces coelicolor) 유래 아가레즈(agarase)와 아가로스(agarose) 또는 아가(agar)를 반응시키는 것을 특징으로 하는 네오아가로테트라오스(neoagarotetraose) 및 네오아가로헥사오스(neoagarohexaose)의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 제조방법에 있어서, 상기 스트렙토마이세스 시리칼라 유래 아가레즈는 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 것이 바람직하나, 상기 아가레즈의 기능이 전혀 다른 것으로 변경되거나 아가레즈 활성을 잃지 않는 범위 내에서 통상적인 유전자 재조합 방법 즉, 단백질의 정제를 유리하게 하기 위해 표지 아미노산을 포함시키거나, 이종 발현을 위해 아미노산 서열을 변경하는 등의 방법에 따라 아미노산 서열이 변경될 수 있다.

본 발명의 제조방법은

a) 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 스트렙토마이세스 시리칼라(Streptomyces coelicolor) 유래 dagA 유전자를 발현하여 DagA 단백질을 제조하는 단계;

b) 상기 DagA 단백질과 아가로스(agarose) 또는 아가(agar)를 반응시키는 단계;를 포함하여 이루어질 수 있다.

본 발명의 제조방법에 있어서, 상기 반응은 35 내지 45℃의 온도 조건 및 pH 6 내지 8의 수소이온농도 조건에서 이루어지는 것이 바람직하며, 보다 바람직하게는 상기 온도 조건이 39 내지 41℃, 상기 수소이온농도조건이 pH 6.8 내지 7.2인 것이 좋다. 이는 본 발명에서 스트렙토마이세스 시리칼라 유래 단백질인 DagA 단백질의 활성을 분석한 결과에 따라 결정된 것이다.

본 발명의 제조방법에 있어서, 상기 a)단계에서 dagA 유전자를 발현하기 위해 스트렙토마이세스 리비던스(Streptomyces lividans)의 발현 시스템을 이용하는 것이 바람직하며, 보다 바람직하게는 상기 스트렙토마이세스 리비던스가 스트렙토마이세스 리비던스 TK24인 것이 좋다.

본 발명의 제조방법에 있어서, 상기 DagA 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 것이 바람직하다.

본 발명의 제조방법에 있어서, 상기 a)단계에서 dagA 유전자를 발현할 때, dagA 유전자의 전사가 ermE 프로모터에 의해 조절되도록 하는 것이 바람직하다. 이는 여러 종류의 프로모터를 사용하여 dagA 유전자를 발현시켜본 결과에 따른 것으로, ermE 프로모터를 사용할 경우 가장 효과적으로 발현된다는 것을 확인하였다.

본 발명의 제조방법에 있어서, 상기 a)단계에서 dagA 유전자를 발현하기 위해 도 1의 pWHM3-DagA, pUWL201-DagA 및 pSEV1-DagA 중에서 선택된 도면으로 표시되는 발현벡터를 사용하는 것이 바람직하다.

본 발명의 제조방법에 있어서, 상기 a)단계에서 제조된 DagA 단백질을 정제하는 단계를 더 포함하는 것이 바람직하며, 이때 정제는 아가로스를 매개로 하는 흡착 컬럼 크로마토그래피를 수행하여 이루어지는 것이 바람직하다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 제조방법으로 제조된 네오아가로테트라오스를 제공한다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 제조방법으로 제조된 네오아가로헥사오스를 제공한다.

S. coelicolor A3(2)는 단독 탄소원으로 아가를 사용할 수 있는 소수의 미생물 종 중 하나이다. 본 발명자는 세포외 아가레즈를 암호화하는 S. coelicolor의 dagA 유전자를 클로닝하고, S. lividans TK24에서 성공적으로 과발현시켰다.

DagA 단백질은 309개의 아미노산을 갖고, 분자량이 약 35kDa이며, N-말단의 30개의 아미노산 시그널 펩티드가 잘려져서 완성된 세포외형 단백질(약 32kDa)의 상태로 분비된다. In vitro 실험을 통해 확인된 바에 따르면, 이 유전자의 전사는 RNA 중합효소의 적어도 다른 3가지의 완전효소(holoenzyme)에 의해 인지되는 4 또는 5가지의 다른 프로모터에 의해 조절된다. dagA 유전자의 전사단계 분석을 통해, 전사가 암호화 서열의 상부 32, 77, 125 및 220번째 염기에서 개시되는 것으로 나타났다.

하지만 아직까지 이러한 DagA의 효소적 특성에 대해서는 자세하게 연구된 적이 없다. 따라서 본 발명자는 DagA를 강력한 ermE 프로모터를 사용하여 S. lividans TK24에서 과발현시키고, 아가로스 비드를 사용하는 흡착 컬럼 크로마토그래피를 이용하여 정제한 다음, 이 효소의 특성을 조사하였다.

이의 결과, DagA가 내-형(endo-type) 베타-아가레즈이며, 아가 또는 아가로스와 반응하여 네오아가로테트라오스 및 네오아가로헥사오스를 생산한다는 것을 확인하였다.

아래의 표 1은 기존에 알려진 대표적인 아가레즈와 본 발명에 따른 아가레즈인 DagA를 비교한 것이다.

아가레즈	기질	최종산물	K_m(㎎/㎖)	V_max(U/㎎)	K_cat(s¹)	K_cat/K_m(s¹M¹)
DagA	Agarose	DP4(DP6)	2.15	40.0	2.2×103	1.2×108
AgaB34^a	Agarose	DP4	0.2	50	4.1×101	1.7×106
AgaA^b	Agarose	DP4(DP6)	0.2	N.A.	1.5×102	7.5×104
AgaB^b	Agarose	DP2(DP4)	1.0	N.A.	1.0×102	1.1×105
AgaA7^c	Agar	DP4	3.0	N.A.	2.9×106	3.9×102

N.A. : not available, DP2 : neoagarobiose, DP4 : neoagarotetraose, DP6 : neoagarohexaose

a : Agarivorans albus YKW-34(Fu et al. 2009)

b : Zobellia galactanivorans(Jam et al. 2005)

c : Mircobulbifer strain JAMB-A7(Ohta et al. 2004)

이상 설명한 바와 같이, 본 발명에 따라 스트렙토마이세스 시리칼라 유래 아가레이즈를 이용하여 아가로스 또는 아가를 분해하면, 네오아가로테트라오스 및 네오아가로헥사오스를 효율적으로 제조할 수 있고, 본 발명에 따른 최적조건을 적용할 경우 보다 효율적인 제조가 가능하다. 뿐만 아니라 본 발명에 따른 제조방법은 화학적인 방법이 아닌 효소를 사용하는 방법이므로, 친환경적이며 제조된 올리고당의 인체에 대한 부작용이 적어 음식, 화장품 및 의약 산업에서도 유용하게 사용할 수 있다.

도 1은 dagA 유전자를 위한 발현벡터의 구성을 나타낸 것으로, 화살표는 각각의 ORF를 나타내고, dagA의 암호화 부위는 각각 3 가지 강력한 프로모터에 연결되어 있다. 클로닝을 위한 제한효소 인식부위를 표시하였으며, dagA 발현을 위해 사용된 프로모터는 sprT _p , ermE _p , tipA _p 와 같이 해당 유전자 심볼에 아래첨자 “p”로 표시하였다. sgtR1 및 sgtR2 유전자는 sprT 발현을 위한 양성 조절 유전자이다.
도 2는 배양 시간에 따른 S. lividans TK24 형질전환체의 자이모그램 플레이트 분석 결과를 나타낸 사진이다. 세포를 최소 아가 배지 플레이트 상에서 5일간 배양한 다음, 루골 용액으로 염색한 것이다. dagA 클로닝을 위해 사용된 벡터는 상단에 표기하였으며, 배양 시간은 왼쪽 측면에 표기하였다. C : 벡터만으로 형질전환한 균주, DagA : dagA의 재조합벡터를 형질전환한 균주.
도 3은 배양 시간에 따른 pWHM3-DagA 형질전환체의 세포 생장률(㎎ 단백질/ℓ) 및 아가레즈 활성(A₅₄₀)을 나타낸 그래프이다. 형질전환체는 7일간 변형된 R2YE 배지에서 28℃로 배양하였으며, 아가레즈 활성을 측정하기 위해 날짜별로 샘플을 수집하였다. □ : 빈 벡터만으로 형질전환한 대조군 균주의 단백질 농도, ○ : 대조군의 아가레즈 활성, ■ : dagA의 재조합벡터를 형질전환한 균주의 단백질 농도, ● : dagA의 재조합벡터를 형질전환한 균주의 아가레즈 활성.
도 4는 배양 시간에 따른 pHSEV-DagA 형질전환체의 세포 생장률(㎎ 단백질/ℓ) 및 아가레즈 활성(A₅₄₀)을 나타낸 그래프이다. 형질전환체는 7일간 변형된 R2YE 배지에서 28℃로 배양하였으며, 아가레즈 활성을 측정하기 위해 날짜별로 샘플을 수집하였다. □ : 빈 벡터만으로 형질전환한 대조군 균주의 단백질 농도, ○ : 대조군의 아가레즈 활성, ■ : dagA의 재조합벡터를 형질전환한 균주의 단백질 농도, ● : dagA의 재조합벡터를 형질전환한 균주의 아가레즈 활성.
도 5는 배양 시간에 따른 pUWL201-DagA 형질전환체의 세포 생장률(㎎ 단백질/ℓ) 및 아가레즈 활성(A₅₄₀)을 나타낸 그래프이다. 형질전환체는 7일간 변형된 R2YE 배지에서 28℃로 배양하였으며, 아가레즈 활성을 측정하기 위해 날짜별로 샘플을 수집하였다. □ : 빈 벡터만으로 형질전환한 대조군 균주의 단백질 농도, ○ : 대조군의 아가레즈 활성, ■ : dagA의 재조합벡터를 형질전환한 균주의 단백질 농도, ● : dagA의 재조합벡터를 형질전환한 균주의 아가레즈 활성.
도 6은 세포외 단백질의 SDS-PAGE 분석결과를 나타낸 사진이며, 상단에 각각 형질전환에 사용된 플라스미드를 표기하였다.
도 7은 S. lividans TK24/pUWL210-DagA로부터 아가로스 비드를 사용한 친화성 컬럼 크로마토그래피로 DagA를 정제한 것을 나타낸 사진이다. S. lividans 배양액의 세포외 단백질 및 각 정제단계의 샘플을 15% SDS-PAGE 겔로 전기영동한 다음, Coomassie Brilliant Blue로 염식하였다. Lane M : 분자량 마커, Lane 1 : S. lividans TK24/pUWL201PW의 총 세포외 단백질(대조군), Lane 2 : S. lividans TK24/pUWL201-DagA의 총 세포외 단백질, Lane 3 : 암모늄 설페이트 침전 이후의 샘플, Lane 4 : 아가로스 비드를 사용한 친화성 컬럼 크로마토그래피로 정제한 샘플. DagA 단백질은 화살표로 표시하였다.
도 8은 아가로스 상에서 작용하는 DagA의 역학 변수를 결정하기 위한 LineweaverBurk plot 그래프이다.
도 9는 반응 시간에 따른 TLC(thin layer chromatography) 크로마토그램을 나타낸 것이다. 0.2% 아가로스를 함유하는 50mM sodium phosphate buffer(pH7.0)를 사용하여 40℃에서 24시간 가수분해 반응을 수행한 다음, 각 반응시간에 따른 샘플을 실리카 겔 60 TLC 플레이트 상에서 분리하였다.
도 10은 MALDI-TOF mass spectrogram 결과를 나타낸 그래프이다. 도 9에서 생산된 총 올리고당을 건조시키고, 메탄올로 추출한 다음, direct MALDI-TOF mass spectrometer를 사용하여 분자량의 분포를 결정하였다.
도 11은 주요 아가로스-가수분해물의 ¹³C-NMR 스펙트럼을 나타낸 것이다. TLC 상의 주요 점(spot-1)을 수득하고, Superconducting FT-NMR spectrometer를 사용하여 ¹³C-NMR 스펙트럼을 기록하였다. 아노머형-탄소 부위에 대한 적당한 화학 변위를 결정하였다. 네오아가로테트라오스의 반복 유닛에서, G는 3-O-linked β-D-galactopyranose를 나타내고, A는 4-O-linked 3,6-anhydro-α-galactopyranose를 나타낸다. Ar 및 Gr은 반복되는 이당류의 환원말단(r) 잔기를 나타내는 것으로, Gr은 α(Grα) 또는 β(Grβ) 아노머를 나타낸다. 비환원말단(nr)에서 반복되는 이당류의 당은 Anr 및 Gnr로 표시하였다. 본 도에서 나타낸 구조 및 심볼은 이전에 갈락탄(galactan) 시리즈를 위해 사용되었다(Rochas et al. 1986).
도 12는 DagA 반응 혼합물의 점도 변화를 나타낸 것이다. 반응 혼합물(0.6% 아가로스 용액)의 점도 감소는 Cannon-Ubbelohde viscometer를 사용하여 40℃에서 규칙적인 간격으로 측정하였다.
도 13은 기존에 알려진 베타-아가레즈들의 아미노산 서열과 DagA의 아미노산 서열을 비교한 것이다. AgaA의 3D 구조 분석을 기초로 하여, 촉매 잔기가 보존된 부분은 검은색 원 및 진회색으로 표시하였고, 칼슘 이온 결합과 관련된 잔기가 보존된 부분은 검은색 사각형으로 표시하였다. 모든 서열에서 보존된 잔기는 밝은 회색으로 표시하였고, 하단에 별표로 표시하였다. 보존된 치환 부위는 콜론으로 표시하였고, 준-보존 치환 부위는 점으로 표시하였다. 삭제된 부위는 대쉬로 표시하였다. 아미노산 서열 정보 : P. atlantica의 베타-아가레즈(AAA91888), Z. galactanivorans의 AgaA(AX008608), S. coelicolor A3(2)의 DagA(XO5811).

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.

실시예 1.

1. 균주 및 플라스미드

S. coelicolor A3(2) 및 S. lividans TK24 균주는 영국의 John Innes Institute로부터 제공받았으며, Escherichia coli strain DH5α 균주 및 클로닝벡터 pGEM-T-Easy 벡터는 Promega corp.(USA)로부터 구입하였다. 서브클로닝벡터로 사용한 스트렙토마이세스-대장균 셔틀 벡터(Streptomyces - E. coli shuttle vector)인 pWHM3-TR1R2(Oh etal. 2007), pSEV1(Takano etal. 1995) 및 pUWL201PW(Doumith et al. 2000)를 스트렙토마이세스 세포에서 dagA를 발현하기 위해 사용하였다.

2. 배지 및 배양 조건

E. coli는 Luria-Bertani 배지 및 37℃의 조건에서 회전시키며 배양하였다. 스트렙토마이세스 균주는 리터당 sucrose 103g, K₂SO₄ 0.25g, MgCl₂·6H₂O 10.12g, glucose 10g, casamino acids 0.1g, yeast extract 5g, 0.5% K₂HPO₄ 용액 10㎖, 3.68% CaCl₂·2H₂O 용액 80㎖, 20% L-proline 용액 15㎖, 5.73% TES[pH7.2] 용액 100㎖, trace elements 용액 2㎖이 포함되고, agar가 2.2%인 R2YE agar 배지(Kieser et al. 2000)에서 배양하였으며, 아가레즈의 생산을 위해 R2YE 액체배지(R2YE agar에서 agar만을 제외한 배지)에서 120rpm 및 28℃의 조건으로 배양하였다. 원형질체(protoplast)를 준비하기 위해서는 S. lividans TK24 균주를 YEME 액체배지에서 28℃의 조건으로 배양하였다.

3. 효소 및 시약

제한효소(Restriction endonucleases), T4-DNA 리가아제(ligase) 및 Taq DNA 중합효소는 TaKaRa Shuzo(Japan)로부터 구입하였다. PCR 프라이머는 다인바이오사(DyneBio Inc, 대한민국)로부터 제공받았으며, 모든 다른 시약들은 Sigma Chemical Co.(USA)으로부터 구입하였다. 실리카 겔 60 유리판(Silica gel 60 on glass plates)은 E. Merck AG(Darmstadt, Germany)로부터 구입하였다.

4. 형질전환

E. coli 형질전환 균주는 기존에 알려진 방법(Kieser et al. 2000)에 따라 제조하였으며, 스트렙토마이세스 원형질체는 기존에 알려진 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol)-매개 형질전환 방법에 따라 제조하였다. 방선균 형질전환체는 500㎍의 thiostrepton이 함유된 1㎖의 물로 오버레이(overlaying)하여 선별하였다.

5. dagA 의 발현벡터 제조

각기 다른 프로모터의 조합을 사용하여 dagA 유전자의 발현을 위한 다양한 발현벡터를 제작하였다(도 1). 첫째, sprT 프로모터가 포함된 310bp 단편(EcoRI/NdeI), dagA의 전체 코딩부위(DagA의 시그널 및 완성형 펩타이드)가 암호화된 947bp 단편(NdeI/SphI), sgtR1 및 sgtR2 유전자를 포함하는 1,214bp 단편을 표 2의 프라이머를 사용한 PCR을 통해 증폭하였고, EcoRI 및 HindIII로 처리한 pWHM3에 접합하여, pWHM-DagA를 제작하였다. 상기와 달리 다른 제한효소 부위(NdeI/BamHI)를 갖는 dagA의 전체 코딩부위를 암호화하는 947bp 단편을 증폭하고, 스트렙토마이세스 속 균주의 강력한 프로모터(각각 ermE 및 tipA)를 갖는 pUWL201PW 및 pSEV1 벡터에 클로닝하여, 각각 pUWL201-DagA 및 pSEV1-DagA를 제작하였다. 제작된 벡터의 제한효소지도를 도 1에 나타내었고, 표 2에 PCR 프라이머를 나타내었다. 재조합 플라스미드를 E. coli로부터 정제하였고, 스트렙토마이세스 균주의 원형질체 형질전환에 사용하였다.

프라이머	염기서열^*
sgtR1 및 sgtR2의 클로닝을 위한 프라이머
SgtR1R2-F	5′-CCCGCATGCTCTGACGGCACGTACCG-3′ (SphI)
SgtR1R2-R	5′-CCTCAAGCTTCGACCCCTGCTCCACC-3′ (HindIII)
sprTp의 클로닝을 위한 프라이머
sprTp-F	5′-GGGGAATTCGGCCCGCCCCCTCTGCC-3′(EcoRI)
sprTp-R	5′-CTTCACCATATGCCTTCTTTCGTGGGGG-3′(NdeI)
pWHM3-TR1R2에 아가레즈 유전자를 클로닝하기 위한 프라이머
AsmT-F	5′-GACATATGGTGGTCAACCGACGTGATC-3′(NdeI)
AsmT-R	5′-GGTGCATGCCTACACGGCCTGATACG-3′(SphI)
pUWL201PW 및 pHSEV-1에 아가레즈 유전자를 클로닝하기 위한 프라이머
Asm-F	5′-GACATATGGTGGTCAACCGACGTGATC-3′(NdeI)
Asm-R	5′-GGTGGATCCCTACACGGCCTGATACG-3′(BamHI)

* 이후 DNA 단편의 클로닝을 위한 제한효소 인식부위를 이탤릭체로 표기하였고, 괄호 안에 해당 제한효소를 기재하였다.

6. 단백질 분석

단백질의 농도는 Bradford의 방법(1976)에 따라 결정하였고, BSA를 표준으로 하였다. 단백질 샘플은 Laemmli의 방법(1970)에 따라 0.1% sodium dodecyl sulfate - 10% polyacrylamide 겔 전기영동(SDS-PAGE)을 통해 분석하였다. 전기영동 후, 단백질 밴드를 Coomassie Brilliant Blue R-250으로 염색하여 확인하였다. 분자량은 myosin(200kDa), β-galactosidase(116kDa), phosphorylase(97kDa), albumin(66kDa), ovalbumin(45kDa), carbonic anhydrase(31kDa) 및 soybean trypsin inhibitor(20.1kDa)의 분자량 마커를 사용하여 결정하였다.

7. DNS 기법에 의한 아가레즈 활성 분석

아가레즈 활성은 다음의 표준 조건에 따라 측정하였다.

유리시험관에서 100㎕의 효소 용액을 0.2% 아가로스를 함유하는 50mM sodium phosphate 완충액(pH 7.0) 3.9㎖과 혼합하여, 40℃에서 30분간 반응시킨 후, 4㎖의 dinitrosalicylic acid(DNS) 반응 용액(6.5g의 dinitrosalicylic acid, 325㎖의 2M NaOH 및 45㎖의 glycerol/1ℓ 멸균수)과 혼합하고, 색이 전개될 때 까지 10분간 중탕하였다. 냉수욕조에서 시험관을 식혀 반응을 멈추게 하고, 540nm에서 흡광도를 기록하였다. 효소활성 1 유닛은 30분의 반응기간 동안 0.001의 흡광도(A540)를 나타내는 정도의 활성으로 정의하였다.

정제된 DagA의 활성에서 온도와 pH의 효과를 표준 분석 조건에 따라 결정하였다.

아가레즈 활성에 있어서 pH의 효과는 40℃에서 50mM sodium phosphate 완충액(pH 7.0)에 50mM citrate phosphate 완충액(pH 4.0 - 6.0), 50mM sodium phosphate 완충액(pH 7.0 및 8.0) 또는 50mM glycine-NaOH 완충액(pH 9.0 - 11.0)을 사용하여 달성한 다양한 pH에서 분석하였다.

아가레즈 활성에 있어서 온도의 효과는 50mM sodium phosphate 완충액(pH 7.0) 상에서 20℃ ~ 90℃의 다양한 온도조건에서 효소를 분석하여 결정하였다. 효소 용액을 결정된 온도에서 1시간 전반응시켰고, 잔여 아가레즈 활성을 측정하기 위해 남은 성분을 혼합하였다. 관련 활성은 아가레즈 활성 최대값에 대한 퍼센트 활성으로 결정하였다.

8. 자이모그램(zymogram)에 의한 아가레즈 분석

각 균주(S. lividans TK24 형질전환체)를 thiostrepton(50㎍/㎖)이 함유된 최소 agar 배지(0.5g L-asparagine, 0.5g K₂HPO_4,0.2g MgSO₄·7H₂O, 0.01g FeSO₄·7H₂O, 10g glucose 및 10g agar/1ℓ 멸균수)에 점접종하고, 28℃에서 48 내지 120시간 배양하였다. 배양배지를 Lugol의 iodine 용액(25g iodine 및 50g potassium iodine/1ℓ 멸균수)으로 오버레이 및 염색하였다.

9. 아가레즈 정제

모든 정제 과정을 4℃에서 수행하였다.

배양액(1ℓ)을 14,000rpm으로 15분간 원심분리하고, 세포가 제거된 상층의 총 단백질을 75% 포화상태의 암모니움 설페이트 침전으로 농축하였다. 침전물을 8㎖의 완충액 A(20mM Tris-Cl, pH7.0)에 용해시키고, 16시간 동안 1ℓ의 완충액 A에 대한 투석을 2회 실시하였다. 샘플을 완충액 A에 아가를 용해(2%)시켜 준비한 아가로스 비드(직경 2㎜)와 혼합하고, 2 ~ 3시간 놓아 두었다. 혼합물을 유리 컬럼(직경 2㎝ × 길이 4.5㎝)에 채우고, 컬럼을 15 부피배의 완충액 A로 세척하였다. 아가레즈의 용출은 250mM imidazole 및 0.5M NaCl을 포함하는 완충액 A로 수행하였다. 아가레즈 활성 분획을 수집하고 아미콘(Amicon) 농축장치(10kDa cutoff)로 농축한 다음, 분석용 완충액 1㎖에 현탁하였다. 정제된 효소는 -20℃에서 100mM NaCl 및 50%(wt/vol) 글리세롤(glycerol)이 포함된 완충액 A에 담긴 상태로 보관하였다.

10. 역학변수 결정

아가로스(0.5-5㎎/㎖의 최종 농도)에 작용하는 DagA(3.5㎍)의 Km 및 Vmax 값을 상기 조건 하에서 얻어진 개시속도 데이터의 Lineweaver-Burk 이중역수 그래프를 선형회귀분석하여 계산하였다. Kcat 값(회전횟수, turnover number)과 Kcat/Km(촉매 효율, catalytic effiiency)을 Km, Vmax 및 [E](아가레즈의 농도) 값을 기초로 하여 계산하였다.

11. 생성물의 구조 분석

가수분해 반응은 정제된 DagA 및 0.2% 아가로스가 포함된 50mM 인산나트륨 완충액(pH7.0)에서 40℃에서 수행되었다. 24시간 후에 샘플을 회수하였고, 실리카 겔 60 TLC 판에 적용시키고, n-butanol-acetic acid-물 용액(2:1:1 부피)으로 전개하였다. 10%(부피) H₂SO₄ 에탄올을 분사하고, 90℃로 가열하여 전개된 올리고당을 검출하였다. 가수분해물에 해당하는 점을 칼날로 긁어 낸 다음, 건조를 위해 메탄올에 용해시켰다. 생성물의 분자량 분포를 직접 MALDI-TOF mass spectrometer(Autoflex III; Bruker, USA)를 사용하여 결정하였다. 생성물의 13C 핵 자기 공명(NMR) 스팩트럼을 Superconducting FT-NMR spectrometer(500 MHz, DRX-500; Bruker, USA)를 사용하여 기록하였다.

12. 결과

12-1. 아가 플레이트 상에서 S. lividans TK24 형질전환체의 아가레이즈 활성 비교

S. coelicolor의 염색체 DNA로부터 PCR을 통해 dagA 유전자를 증폭하고, 각각 sprT, tipA 및 ermE 프로모터에 dagA 유전자의 암호화부위가 연결되도록 pWHM3-TR1R2, pHSEV-1 및 pUWL201PW에 클로닝하여, pWHM3-DagA, pHSEV-DagA 및 pUWL201-DagA를 제조하였다(도 1 참조). DagA 아가레이즈는 세포외부로 분비되어, 아가를 분해하여 성장을 위한 탄소원으로 사용할 수 있는 올리고당으로 만드는 세포외 효소이다. 각 dagA 발현벡터로 형질전환한 S. lividans TK24 균주를 최소 아가배지에서 배양하였을 때, 모든 형질전환체 콜로니가 아가 속으로 파고드는 것이 관찰되었으며, 이러한 현상이 대조군에서는 관찰되지 않았다. 요오드 기반 시약인 루골(Lugol) 용액으로 각 배양 플레이트를 염색하였을 때, 콜로니 주위에 투명한 환(clear halo)이 나타났으며, 이것은 콜로니 주위의 아가가 분해되었다는 것을 의미한다. 이러한 현상은 대조군에서는 관찰되지 않았다(도 2 참조). S. lividans TK24에서 세 가지 발현 시스템 중 pUWL201-DagA(ermEp)가 가장 강력한 아가레이즈 활성을 나타냈고, tipAp가 포함된 pHSEV1-DagA 와 sprTp가 포함된 pWHM3-TDagA 또한 순서대로 높은 아가레이즈 생산 활성을 나타냈다(배양 5일째의 투명한 환 직경은 순서대로 각각 17, 14, 6㎜이다). 이러한 차이는 탄소원으로 유일하게 아가 만을 포함하도록 변형한 최소배지에서 각 형질전환체를 배양하였을 때, 보다 확실하게 나타났다(배양 5일째의 투명한 환 직경은 순서대로 각각 17, 10, 5㎜이다).

12-2. 액체배양 상에서 S. lividans TK24 형질전환체의 아가레이즈 활성 비교

S. lividans TK24 형질전환체를 10.3% sucrose가 포함된 일반적인 R2YE 액체배지 및 탄소원으로 유일하게 0.5% 아가를 포함하도록 변형한 R2YE 액체배지에 배양하고, 배양액의 아가레이즈 활성과 총 세포단백질의 농도를 비교하였다. 변형된 R2YE 액체배양에서 S. lividans TK24/pWHM3-DagA가 대조군에 비해 보다 빨리 자라는 것으로 나타났고(배양 6일째에서 세포 단백질이 0.48, 0.34㎎/ℓ이다), 아가레이즈 활성은 배양 6일째에 최고 단계(A₅₄₀ = 0.25)에 도달했다. 이 형질전환체의 성장은 대조군에 비해 13배 높았다(A₅₄₀ = 0.02)(도 3 참조).

S. lividans TK24/pSEV1-DagA의 성장은 배양 3일째에 대조군(0.26㎎/ℓ)에 비해 2.5배 높은 최고 단계(0.64㎎/ℓ)에 도달했다. 아가레이즈 활성은 배양 2일째에 증가하기 시작하여, 배양 6일째 최고 단계(A₅₄₀ = 0.75 unit)에 도달할 때까지 꾸준히 증가하였다. 대조군에서는 아가레이즈 활성이 관찰되지 않았다(A₅₄₀ = 0.01)(도 4 참조).

S. lividans TK24/pUWL201-DagA의 성장은 배양 2일째에 증가하기 시작하여, 배양 3일째에 최고 단계에 도달하였으며(0.58㎎/ℓ), 이 시점부터 배양 7일째까지 점차 감소하였다. 대조군은 4일째에 최고 성장률을 나타냈다(0.24㎎/ℓ)(도 5 참조). 아가레이즈 활성은 배양 2일째부터 급격히 증가하여 배양 6일째 이후에 최고 단계(A₅₄₀ = 0.91)에 도달했고, 대조군(A₅₄₀ = 0.01)에 비해 91배 높았다. 한편, 배양 7일째에는 아가레이즈 활성이 급격히 감소하였다.

탄소원이 제한되었기 때문에 대체로 모든 균주들이 변형된 R2YE에서 낮은 성장을 보였고, dagA가 없는 대조군은 DagA 생산 균주에 비해 절반정도의 성장률을 나타냈다. 대조군의 성장은 배지에 포함된 yeast extract와 다른 영양성분 때문인 것으로 보인다. 반면, 아가레이즈를 생산하는 균주들은 아가레이즈를 생산하는 능력으로 인해, 아가를 분해하여 제한된 탄소원을 보충할 수 있었기 때문에, 대조군 보다 1.4 ~ 2.5배 성장할 수 있었다. 총 세포외 단백질의 SDS-PAGE 분석을 통해, 32kDa 단백질이 S. lividans TK24/pUWL201-DagA 및 S. lividans TK24/pSEV1의 배양액에서 많이 생산된 것으로 나타났으나, 대조군에서는 그렇지 않았다. 이는 의도한 대로 형질전환체에서 DagA의 발현이 활성화되었다는 것을 의미한다(도 6).

변형된 R2YE에서 보다 일반적인 R2YE 액체배지에서, 모든 균주가 더 풍부하게 성장한 것으로 나타났으며, 각 형질전환체의 세포 성장률은 별다른 차이가 없는 것으로 나타났다. 이는 아마도 아가를 분해하는 능력에 상관없이 균주의 성장을 위해 충분한 sucrose가 존재하기 때문인 것으로 생각된다. 반면, 형질전환체의 아가레이즈 활성이 변형된 R2YE에서 나타난 결과와 유사한 패턴으로 차이가 나타났다는 것은 주목할 만하다. S. lividans TK24/pUWL201-DagA가 가장 높은 활성(A₅₄₀ = 0.40)을 나타냈고, pSEV1-DagA (A₅₄₀= 0.28)와 pWHM3-DagA (A₅₄₀= 0.1) 형질전환체가 대조군(A₅₄₀= 0.1)에 비해 높은 활성을 나타냈다. 이 모든 결과들은 DagA가 3 가지 프로모터에 의해 성공적으로 과발현 될 수 있고, ermE 프로모터를 포함하는 pUWL201-DagA가 DagA의 가장 효율적인 발현 시스템이라는 것을 나타내는 것이다.

12-3. DagA의 정제

S. lividans TK24/pUWL201-DagA가 세포외 아가레이즈 생산 효율이 높기 때문에 이의 정제가 상당히 수월하다. 아가로스 비드(bead) 매트릭스를 사용하여 수행하는 친화성 크로마토그래피는 황산암모늄(ammonium sulfate) 침전 이후 빠르고 효율적인 일단계 아가레이즈 정제를 가능하게 한다. DagA 단백질을 회수율 67%로 166배 정제하였고, 이의 순도를 SDS-PAGE로 확인한 결과, 이전 연구결과(Bibb et al. 1987)와 같이 32kDa 크기의 단일밴드로 나타났다(도 7 참조).

12-4. DagA의 특성

12-4-1. 일반적인 특성

DagA는 pH7.0에서 가장 높은 아가레이즈 활성을 나타냈고, pH5.0 ~ 8.0의 범위에서 최대 활성의 90%이상을 나타냈다. pH4.0 이하와 pH9.0 이상에서는 50% 이상의 아가레이즈 활성을 잃는 것으로 나타났다. DagA는 25 ~ 40℃의 온도범위에서 효율적으로 작동하고, 40℃에서 최대 활성의 85%를 나타냈지만, 60℃에서는 모든 활성을 잃었다. 효소활성은 1mM 농도의 Ca²⁺,Mg²⁺,Mn²⁺,Co²⁺,Cu²⁺ 또는 Zn²⁺ 처리에 의해서는 증가하지 않았으며, 오히려 효소활성을 저해하는 것으로 나타났고, 킬레이터(chelator)(EDTA, EGTA) 조차 효소활성을 완전히 없애는 것으로 나타났다. 이러한 결과는 이전 연구결과(Bibb et al. 1987)에 따른 효소의 특성 중 일부와 일치하는 것이다. 덧붙여, 20 ~ 40℃의 범위로 열처리하여도 DagA의 잔여 활성에 영향을 미치지 않았다. 50℃에서 1시간 열처리 후 오직 45%의 활성만이 남아있었다.

12-4-2. 동역학(Kinetics)

상기의 결과를 기초로, 모든 효소 반응을 sodium phosphate buffer(pH 7.0)를 사용하여 40℃에서 수행하였다. 아가레이즈의 Km값과 Vmax값은 각각 1.79 × 10^-5M(2.15㎎/㎖), 14μM/min이다(도 8 참조).

12-4-3. 작용기작

DagA에 의해 생성된 아가로스의 가수분해물을 분리하고, TLC로 확인하였다(도 9 참조). 세 가지 주요 가수분해물의 점(spot)이 선명하게 확인되었다. MALDI-TOF mass spectra에서 주요 산물이 653, 959, 1265(M+Na)⁺ 의 m/z에서 분자 이온을 갖는 것으로 나타났고, 이는 각각 (neo)agarotetraose, (neo)agarohexaose, (neo)agarooctaose와 대응된다(도 10 참조). 표준 물질이 없었기 때문에, G-D-(+) galactose, 4-β-galactobiose 및 3α4β3α-galactotetraose를 가수분해물과의 비교를 위해 분리하였다. 이들은 TLC 상에서 전혀 다른 이동양상을 나타낸다. 주요 점(spot-1)을 MALDI-TOF로 분석한 결과, 653(M+Na)⁺ 의 m/z에서 분자 이온을 갖는 것으로 나타났고, 이는 (neo)agarotetraose라고 볼 수 있다. 따라서 spot-2와 spot-3는 각각 (neo)agarohexaose(m/z = 959), (neo)agarooctaose(m/z = 1265)라고 볼 수 있다.

마지막으로, 아노머 형태(anomeric configuration)를 ¹³C-NMR로 분석하였다. spot-1의 스펙트럼에서 아노머 탄소 신호의 화학변위는 이전 연구결과(Rochas et al. 1986)와 일치하였다(도 11 참조). 도 11에 나타난 바와 같이, neoagarotetraose의 비환원 D-galactose(Gnr) 및 3,6-anhydro-L-galactose(Anr)의 전형적인 공명 신호는 각각 101.84, 97.75ppm의 화학변위로 확인되었다(Rochas et al. 1986). 반면, 3,6-anhydro-L-galactose 수화물 형태 환원성말단(reducing end)의 특징을 나타내는 90.8ppm 피크(Rochas et al. 1994)는 나타나지 않았다. 추가로, neoagarotetraose에서 환원성 말단의 α- 및 β-아노머 형태를 나타내는 전형적인 공명 신호가 각각 96.20(Grβ), 92.21(Grα)의 화학변위에서 나타났다. 이러한 결과는 DagA의 주요 반응 산물이 neoagarotetraose라는 것을 의미한다.

효소의 아가로스 분해가 exo-형 가수분해 인지 또는 endo-형 가수분해 인지를 조사하기 위해, 아가로스의 점도변화를 측정하였다(도 12 참조). 효소용액(10U) 10㎖과 0.6% 아가로스 10㎖를 각각 반응완충액에 담긴 상태로 40℃에서 5분간 전처리한 다음 혼합하였다. 효소를 첨가한 직후부터 아가의 점도가 빠르게 감소하였고, 처음 30분 동안 같은 비율로 감소하였다. 점도는 30 ~ 120분간 점차 더욱 감소하였고 최종적으로 평행상태가 되기 시작했다. 만약 반응이 오직 exo-형 가수분해에 의해서만 진행된다면, 아가로스 겔의 점도는 도 12에 나타난 것과 같이 빠르지 않고, 천천히 감소할 것이다(Kim et al. 2010). 따라서 이 효소는 endo-형 가수분해로 아가를 올리고당으로 분해한다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims

서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 스트렙토마이세스 시리칼라(Streptomyces coelicolor) 유래 아가레즈(agarase)와 아가로스(agarose) 또는 아가(agar)를 반응시키는 것을 특징으로 하는 네오아가로테트라오스(neoagarotetraose) 및 네오아가로헥사오스(neoagarohexaose)의 제조방법.
삭제
제 1항에 있어서, 상기 반응은 35 내지 45℃의 온도 조건 및 pH 6 내지 8의 수소이온농도 조건에서 이루어지는 것을 특징으로 하는 제조방법.
제 3항에 있어서, 상기 온도 조건은 39 내지 41℃이며, 상기 수소이온농도조건은 pH 6.8 내지 7.2인 것을 특징으로 하는 제조방법.
a) 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 스트렙토마이세스 시리칼라(Streptomyces coelicolor) 유래 dagA 유전자를 발현하여 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 DagA 단백질을 제조하는 단계;
b) 상기 DagA 단백질과 아가로스(agarose) 또는 아가(agar)를 반응시키는 단계;를 포함하여 이루어지는 네오아가로테트라오스 및 네오아가로헥사오스의 제조방법.
제 5항에 있어서, 상기 반응은 35 내지 45℃의 온도 조건 및 pH 6 내지 8의 수소이온농도 조건에서 이루어지는 것을 특징으로 하는 제조방법.
제 6항에 있어서, 상기 온도 조건은 39 내지 41℃이며, 상기 수소이온농도조건은 pH 6.8 내지 7.2인 것을 특징으로 하는 제조방법.
제 5항에 있어서, 상기 a)단계에서
dagA 유전자를 발현하기 위해 스트렙토마이세스 리비던스(Streptomyces lividans)의 발현 시스템을 이용하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
제 8항에 있어서, 상기 스트렙토마이세스 리비던스는 스트렙토마이세스 리비던스 TK24인 것을 특징으로 하는 제조방법.
삭제
제 5항에 있어서, 상기 a)단계에서
dagA 유전자를 발현할 때, dagA 유전자의 전사가 ermE 프로모터에 의해 조절되도록 하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
제 5항에 있어서, 상기 a)단계에서
dagA 유전자를 발현하기 위해 도 1의 pWHM3-DagA, pUWL201-DagA 및 pSEV1-DagA 중에서 선택된 도면으로 표시되는 발현벡터를 사용하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
제 5항에 있어서, 상기 a)단계에서 제조된 DagA 단백질을 정제하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
제 13항에 있어서, 상기 정제는 아가로스를 매개로 하는 흡착 컬럼 크로마토그래피를 수행하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 제조방법.
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