KR101615141B1

KR101615141B1 - 알테로모나스 속 gnum-1 유래 베타아가레이즈

Info

Publication number: KR101615141B1
Application number: KR1020140030226A
Authority: KR
Inventors: 홍순광; 지원재
Original assignee: 명지대학교 산학협력단
Priority date: 2014-03-14
Filing date: 2014-03-14
Publication date: 2016-05-13
Also published as: KR20150107972A

Abstract

본 발명은 알테로모나스 속 GNUM-1 유래 베타아가레이즈에 관한 것으로, 구체적으로 해양 미생물인 알테로모나스 속 GNUM-1으로부터 유래하여 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖고 아가 또는 아가로오스와 반응하여 네오아가로비오스(neoagarobiose), 네오아가로테트라오스(neoagarotetraose) 및 네오아가로헥사오스(neoagarohexaose)와 같은 네오아가로 올리고당(neoagaro-oligosaccharide)을 생산하는 베타아가레이즈, 이의 유전자, 이 유전자 DNA를 포함하는 베타아가레이즈 재조합 발현 벡터, 이 재조합 발현 벡터로 형질전환된 베타아가레이즈 생산용 세포, 이 세포를 사용하여 베타아가레이즈를 제조하는 방법 및 이 베타아가레이즈를 사용하여 네오아가로 올리고당을 제조하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 베타아가레이즈는 아가 또는 아가로오스를 기질로 하여 네오아가로비오스(neoagarobiose), 네오아가로테트라오스(neoagarotetraose), 네오아가로헥사오스(neoagarohexaose)와 같이 인체에 유용한 생리활성을 나타내고 산업적으로 활용할 수 있는 네오아가로 올리고당(neoagaro-oligosaccharide)을 생산할 수 있어, 이를 통해 천연 해양자원인 아가를 산업적으로 보다 유용하게 이용할 수 있다.
또한, 본 발명의 베타아가레이즈 유전자, 재조합 발현 벡터, 형질전환 세포 및 베타아가레이즈 제조방법을 사용하면 상기와 같이 유용한 베타아가레이즈를 매우 효율적으로 제조할 수 있다.

Description

알테로모나스 속 GNUM-1 유래 베타아가레이즈{Beta agarase from Alteromonas sp. GNUM-1}

본 발명은 알테로모나스 속 GNUM-1 유래 베타아가레이즈에 관한 것으로, 구체적으로 해양 미생물인 알테로모나스 속 GNUM-1으로부터 유래하여 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖고 아가 또는 아가로오스와 반응하여 네오아가로비오스(neoagarobiose), 네오아가로테트라오스(neoagarotetraose) 및 네오아가로헥사오스(neoagarohexaose)와 같은 네오아가로 올리고당(neoagaro-oligosaccharide)을 생산하는 베타아가레이즈, 이의 유전자, 이 유전자 DNA를 포함하는 베타아가레이즈 재조합 발현 벡터, 이 재조합 발현 벡터로 형질전환된 베타아가레이즈 생산용 세포, 이 세포를 사용하여 베타아가레이즈를 제조하는 방법 및 이 베타아가레이즈를 사용하여 네오아가로 올리고당을 제조하는 방법에 관한 것이다.

근대 사회의 진화로 많은 양의 에너지가 소모되고 있어 화석연료가 고갈되는 결과가 나타나고 있다. 이에 따라, 화석연료를 대체할 수 있는 새로운 에너지원의 개발에 대한 관심이 높아지고 있으며, 특히 바다의 생물자원은 전분 또는 목질섬유소(lignocellulose) 유래 생물자원에 비해 여러 장점이 있어 새로운 대체 에너지원으로 주목받게 되었다(Chi et al. 2012).

Gracilariales와 Gelidiales 같은 몇몇 홍조류(red algae)는 주요 세포벽 성분이 아가(한천)(agar) 다당류(oligosaccharide)로 이루어진다. 아가는 갈락탄(galactan) 패밀리에 속하고 3-O-linked β-D-galactopyranose(G)와 4-O-linked α-L-galactopyranose(L)가 순차적으로 결합하여 이루어진다. 아가의 주요 반복 구조는 아가로오스(agarose)의 주요성분인 agarobiose(G-LA)와 포피란(porphyran)의 주요성분인 porphyrobiose(G-L6S)이다. 포피란은 3,6-anhydro-L-galactose(LA)가 α-L-galactopyranose-6-sulfate(L6S)로 치환된 구조이다 (Knutsen et al. 1994). 갈락탄 골격은 agarobiose와 porphyrobiose가 혼합된 구조이며, 종종 ester sulfate 그룹, methyl 그룹 또는 pyruvic acid acetal 그룹으로 변형된다(Usov 1998; van de Velde et al. 2002; Hehemann et al. 2010). 아가 다당류 중 아가로스는 주성분인 agarobiose와 소수의 porphyrobiose로 이루어졌고, 따라서 적은 함량(0.15% 미만)의 sulfate ester를 갖는다(Correc et al. 2011). 아가를 효과적으로 이용하기 위해서는 아가레이즈(agarase)와 porphyranase 뿐만 아니라 sulfohydrolase에 의해 완전히 가수분해되어야 한다. 이중에서도 아가레이즈는 효소적 가수분해 과정에서 가장 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다.

아가레이즈는 작용기작에 따라 α-아가레이즈(EC 3.2.1.158), β-아가레이즈(EC 3.2.1.81) 및 β-porphyranase(EC 3.2.1.-)(Chi et al. 2012)의 세 가지 그룹으로 나뉜다. β-아가레이즈는 아가로오스의 β-1,4 결합을 가수분해하여 환원말단에 D-galactose 잔기를 갖는 네오아가로-올리고당(neoagaro-oligosaccharide)을 생산한다(Araki 1959). α-아가레이즈는 아가로오스의 α-1,3 결합을 가수분해하여 환원말단에 3,6-anhydro-L-galactose 잔기를 갖는 아가로-올리고당을 생산한다(Araki 1959). β-porphyranase는 아가로오스의 porphyran 반복단위(G-L6S)의 β-1,4 결합을 가수분해하여 환원말단에 D-galactose 잔기를 갖는 다당류를 생산한다(Hehemann et al. 2010). 이들 아가레이즈는 아가를 D-galactose, 3,6-anhydro-α-L-galactose 또는 α-L-galactopyranose-6-sulfate 단량체로 완전히 가수분해하기 위해 사용될 수 있으며, 이들 단량체는 에탄올 및 부탄올과 같은 바이오연료 또는 정밀화학제품으로 전환될 수 있다. 추가로, 아가레이즈는 건강에 유익한 다양한 생물학적 효과를 나타내는 (네오)아가로-올리고당을 제조하는데 사용될 수 있다(Kobayashi et al. 1997).

β-아가레이즈는 Alteromonas(Wang et al. 2006), Agarivorans(Ohta et al. 2005) 및 Streptomyces(Temuujin et al. 2011, 2012)를 포함하여 몇몇 분류학적으로 다양한 속의 미생물에서 보고되었다. 아미노산 서열 유사성을 기초로 하여 살펴보면, β-아가레이즈는 CAZy(Carbohydrate-Active enZYmes) database에서 GH16, GH50, GH86 및 GH118의 네 가지 별개의 패밀리에서 발견된다(Chi et al. 2012). GH50과 GH86 패밀리는 각각 128, 40종류의 β-아가레이즈로 구성되며, 현재까지 각각 18, 6종류의 효소적 특성이 확인되었다(http://www.cazy.org). GH16은 2,684종류 이상을 포함하는 가장 큰 패밀리이며, 여기에는 endo-galactosidase, endoglucanase, κ-carrageenase, lichenase 및 xyloglucanase와 같이 기능적으로 이질적인 특성이 확인된 184종류가 포함된다.

Kobayashi R, Takisada M, Suzuki T, Kirimura K, Usami S (1997) Neoagarobiose as a novel moisturizer with whitening effect. Biosci Biotechnol Biochem 61:162-163. Temuujin U, ChiWJ, Lee SY, Chang YK, Hong SK (2011) Overexpression and biochemical characterization of DagA from Streptomyces coelicolorA3(2): an endo-type β-agarase producing neoagarotetraose and neoagarohexaose. Appl Microbiol Biotechnol 92:749-59. Temuujin U, Chi WJ, Chang YK, Hong SK (2012) Identification and biochemical characterization of Sco3487 from Streptomyces coelicolor A3(2), an exo- and endo-type β-agarase-producing neoagarobiose. J Bacteriol 194:142-149. Chi WJ, Chang YK, Hong SK (2012) Agar degradation by microorganisms and agar-degrading enzymes. Appl Microbiol Biotechnol 94:917-930. Kim J, Hong SK (2012) Isolation and characterization of an agaraseproducing bacterial strain, Alteromonas sp. GNUM-1, from the West Sea, Korea. J Microbiol Biotechnol 23:1621??.1628, Erratum (2013) 23:136.

본 발명의 주된 목적은 천연자원인 아가(한천)를 산업상 유용하게 이용할 수 있도록 하기 위해 아가 또는 아가로오스를 분자량이 작은 당류로 분해할 수 있는 새로운 아가레이즈 및 이의 유전자를 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 아가레이즈를 보다 효율적으로 제조할 수 있도록 하는 재조합 발현 벡터와 형질전환 세포, 그리고 이들을 사용하여 아가레이즈를 제조하는 방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 아가레이즈를 사용하여 아가로 올리고당이나 네오아가로 올리고당과 같은 우수한 생리활성을 나타내는 한천 유래 화합물의 제조방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 베타아가레이즈(beta-agarase)을 제공한다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 서열번호 3의 염기서열로 표시되는 베타아가레이즈 유전자를 제공한다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 서열번호 3의 염기서열을 갖는 DNA를 포함하고 원핵세포 또는 진핵세포를 형질전환시킬 수 있는 베타아가레이즈 재조합 발현 벡터를 제공한다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 베타아가레이즈 재조합 발현 벡터로 형질전환된 베타아가레이즈 생산용 세포를 제공한다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 베타아가레이즈 생산용 세포를 배양하고, 배양물로부터 베타아가레이즈를 수득하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 베타아가레이즈 제조방법을 제공한다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 베타아가레이즈와 기질로 아가 또는 아가로오스를 효소반응시키는 것을 특징으로 하는 네오아가로 올리고당 제조방법을 제공한다.

본 발명의 베타아가레이즈는 해양 박테리아인 알테로모나스 속(Alteromonas sp.) GNUM-1(KCTC 23886)(Kim and Hong 2012)으로부터 유래된 효소이다. 이 미생물은 해양 조류인 Enteromorpha compressa로부터 분리되었다. 본 발명자는 상기 알테로모나스 속 GNUM-1으로부터 아가레이즈로 추정되는 유전자를 찾아 클로닝 및 이종발현을 시도하였고, 이를 성공적으로 수행하였다. 이종발현을 통해 생산된 단백질을 대상으로 다양한 연구를 진행한 결과 이 단백질이 아가레이즈 활성, 특히 베타아가레이즈 활성을 나타내고, glycoside hydrolase의 분류상 GH16 패밀리에 속하며, 아가로오스를 기질로 하여 최종산물로 네오아가로비오스(neoagarobiose)를 생산한다는 것을 확인하였다.

서열번호 1의 아미노산 서열은 시그널 펩티드(signal peptide)로 예상되는 서열이 포함되지 않은 형태이고, 서열번호 2의 이것이 포함된 형태이다. 본래 알테로모나스 속 GNUM-1에서 단백질이 생산될 때 세포외부로 분비되기 위해 필요한 19개의 아미노산을 함유하는 시그널 펩티드를 갖는 초기 단백질(premature protein)의 형태로 발현(서열번호 2와 같은 형태)되고, 이후 시그널 펩티데이즈에 의해 Ala¹⁹와 Ala²⁰ 사이가 잘려짐으로써 활성화되며, 이로 인해 약 32.7kDa의 분자량 및 4.8의 이론상 등전점(isoelectric point)을 갖는 282개의 아미노산으로 이루어진 완성형 단백질이 형성되는 것으로 판단된다. 즉 단백질이 세포 내부에서 발현되었을 때에는 시그널 펩티드가 포함된 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 형태로 존재하다가, 세포 외부로 분비되면서 시그널 펩티드가 잘려 서열번호 1의 아미노산 서열을 나타낼 것으로 예상된다. 본 발명에 따르면 서열번호 1의 아미노산 서열 형태에서 효소활성을 확인하였으나, 서열번호 2의 아미노산 서열 형태에서도 동일한 특성을 나타낼 것이라 예상된다.

서열번호 4의 염기서열은 알테로모나스 속 GNUM-1의 게놈에 존재하는 상태의 유전자 염기서열로 상기 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 단백질을 암호화한다. 이 서열번호 4에서 시그널 펩티드 암호화 부위를 제외한 것이 서열번호 3의 염기서열이다.

상기 서열번호 2의 아미노산 서열 및 서열번호 4의 염기서열은 DDBJ/EMBL/GenBank에 accession no. KF574012으로 등록되어 있다.

본 발명의 베타아가레이즈 및 이의 유전자는 그 기능이 전혀 다른 것으로 변경되거나 활성을 잃지 않는 범위 내에서 통상적인 유전자 재조합 방법 즉, 단백질의 정제를 유리하게 하기 위해 표지 아미노산을 포함시키거나, 이종 발현을 위해 아미노산 서열을 변경하는 등의 방법에 따라 아미노산 서열 또는 염기서열이 변경될 수 있다.

본 발명에 따르면 상기 베타아가레이즈는 아가(agar) 또는 아가로오스(agarose)와 반응하여 네오아가로 올리고당(neoagaro-oligosaccharide)을 생산할 수 있다. 이때 네오아가로 올리고당은 네오아가로비오스(neoagarobiose), 네오아가로테트라오스(neoagarotetraose) 및 네오아가로헥사오스(neoagarohexaose) 중에서 선택된 것이다.

본 발명에 따르면 상기 베타아가레이즈는 38 내지 42℃의 온도조건에서 최고 활성을 나타낼 수 있고, 또한 pH 6.5 내지 7.5의 수소이온농도 조건에서 최고 활성을 나타낼 수 있다.

본 발명에 따르면 상기 베타아가레이즈는 아가로오스에 3.5 내지 4.0㎎/㎖의 Km 값을 갖고, 20 내지 30U/㎎의 Vmax 값을 갖는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따르면 상기 베타아가레이즈는 endo형(endo type)인 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따르면 상기 베타아가레이즈는 아가로오스와 반응하여 최종산물(end product)로 네오아가로비오스(neoagarobiose)를 생산하는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따르면 상기 베타아가레이즈 발현 벡터는 발현된 베타아가레이즈의 정제가 용이해 지도록 베타아가레이즈에 글루타치온-S-전달효소(glutathione-S-transferase)가 결합되어 발현되도록 이루어지는 것이 바람직하다.

본 발명에 따르면 상기 베타아가레이즈 발현 벡터는 도 6에 개시된 pGEX-Orf1 재조합 벡터와 같은 형태로 이루어지는 것이 바람직하다. 도 6은 주로 대장균에서 단백질을 발현하기 위해 사용되는 pGEX-5X-1 벡터에 서열번호 3의 염기서열을 갖는 DNA 단편을 연결한 형태로, pGEX-5X-1 벡터에는 글루타치온-S-전달효소가 암호화된 DNA가 포함되어 있어 본 발명의 베타아가레이즈와 글루타치온-S-전달효소가 퓨전된 상태로 발현될 수 있도록 한다.

본 발명에 따르면 상기 베타아가레이즈 생산용 세포는 원핵세포인 것이 바람직하다. 이때 상기 원핵세포는 대장균(Escherichia coli)인 것이 바람직하다.

본 발명의 네오아가로 올리고당 제조방법에 있어서, 상기 효소반응은 25 내지 45℃의 온도조건에서 이루어지는 것이 바람직하며, 또한 pH 6.5 내지 7.5의 수소이온농도 조건에서 이루어지는 것이 바람직하다.

본 발명의 네오아가로 올리고당 제조방법에 있어서, 상기 네오아가로 올리고당은 네오아가로비오스인 것이 바람직하다.

본 발명의 베타아가레이즈는 아가 또는 아가로오스를 기질로 하여 네오아가로비오스(neoagarobiose), 네오아가로테트라오스(neoagarotetraose), 네오아가로헥사오스(neoagarohexaose)와 같이 인체에 유용한 생리활성을 나타내고 산업적으로 활용할 수 있는 네오아가로 올리고당(neoagaro-oligosaccharide)을 생산할 수 있어, 이를 통해 천연 해양자원인 아가를 산업적으로 보다 유용하게 이용할 수 있다.

또한, 본 발명의 베타아가레이즈 유전자, 재조합 발현 벡터, 형질전환 세포 및 베타아가레이즈 제조방법을 사용하면 상기와 같이 유용한 베타아가레이즈를 매우 효율적으로 제조할 수 있다.

도 1은 A48 클론의 유전자 배열(a)과 AgaG1의 아미노산 서열 및 이와 상동성이 높은 서열을 비교하여 나타낸다. (a)에서 각 Orf는 블록 화살표로 나타내었다. (b)에서 AgaG1은 Alteromonas sp. GNUM-1의 Orf1, S85는 Flavobacteriaceae bacterium S85의 β-agarase, ZC1은 Aquimarina agarilytica ZC1의 β-agarase를 나타낸다. (b)에서 별(*) 표시는 촉매 잔기(catalytic residue)를 나타낸다. 삼각형 표시는 시그널 펩티드가 잘리는 부위를 나타낸다.
도 2는 정제된 GST-AgaG1(GST tag가 퓨전된 AgaG1)의 SDS-PAGE 및 자이모그래피(zymography) 결과를 나타낸다. 10% SDS-PAGE 겔에서 전기영동하였다. M은 표준 분자량 샘플, 1번 레인은 정제된 GST-AgaG1, 2번 레인은 겔 상에서 아가레이즈 활성을 나타내는 자이모그램이다. GST-AgaG1은 화살표로 표시하였다.
도 3은 GST-AgaG1의 온도(a) 및 pH(b)에 따른 아가레이즈 활성과 효소 동역학(c) 그래프이다. (a) 온도에 따른 효과. 최적 온도를 결정하기 위해 25 ~ 55℃의 범위에서 pH 7.0으로 효소반응하였고, 열안정성을 확인하기 위해서는 25 ~ 55℃의 범위에서 30분간 전처리한 다음 40℃에서 효소활성을 측정하였다. 최고활성을 100%로 하고 이와 비교하여 계산한 활성으로 나타내었다. 모든 데이터는 3회 이상 반복실험한 결과의 평균값으로 나타내었다. ●은 최적온도 그래프이고, ■은 열안정성 그래프이다. (b) pH에 따른 효과. pH 5.0 ~ 10.0의 범위에서 40℃로 반응하였다. 최고활성을 100%로 하고 이와 비교하여 계산한 활성으로 나타내었다. 모든 데이터는 3회 이상 반복실험한 결과의 평균값으로 나타내었다. ▲은 20mM citrate buffer, ■은 20mM MOPS buffer, ●은 20mM Tris-Cl buffer, ◆은 20mM glycine-NaOH buffer를 사용한 것이다. (c) 아가로오스에 작용하는 GST-AgaG1의 nonreciprocal(좌측) 및 reciprocal Lineweaver-Burk(우측) 그래프를 나타낸다. 모든 데이터는 3회 이상 반복실험한 결과의 평균값으로 나타내었다.
도 4는 GST-AgaG1의 아가로오스-액화 활성(a) 및 반응시간에 따른 생성물의 TLC(thin layer chromatography) 분석결과(b)를 나타낸다. (a) 반응물의 점도변화를 나타낸다. 가수분해 반응은 2% 아가로오스, 20mM Tris-Cl(pH 7.0) 및 40℃의 조건에서 수행하였다. 점도는 일정한 간격으로 Cannon-Ubbelohde viscometer를 사용하여 40℃에서 측정하였다. (b) TLC 분석결과를 나타낸다. 좌측은 Silica Gel 60 플레이트 상에서 분석한 결과이다. 우측은 네오아가로테트라오스를 기질로 하여 반응한 결과이다. DP6는 네오아가로헥사오스, DP4는 네오아가로테트라오스, DP2는 네오아가로바이오스, G는 D-갈락토오스, S는 DP4의 DP4의 가수분해물을 나타낸다.
도 5는 GST-AgaG1로 아가로오스를 가수분해하여 생성된 반응산물의 Mass spectrogram(a) 및 ¹³C NMR 분석결과를 나타낸다. (a) 아가로오스를 GST-AgaG1로 완전히 가수분해하고 생성된 반응산물의 분자량을 결정하기위해 micrOTOF-Q로 분석하였다. (b) 도 4b에서 네오아가로테트라오스에 대응되는 spot을 회수하여 600-MHz NMR spectrometer로 분석하였다. 아노머 탄소 부분의 적절한 화학변위를 나타내었다. G는 3-O-linked β-D-galactopyranose, LA는 4-O-linked 3,6-anhydro-α-galactopyranose, Gr은 4당류 환원말단(r)의 잔기를 나타낸다. Gr은 α(Grα) 또는 β(Grβ) 아노머로 나타내었다. 비환원말단(nr)의 당은 Gnr 및 LAnr로 나타내었다.
도 6은 pGEX-Orf1 재조합 벡터의 지도를 나타낸다. 이 재조합 벡터는 pGEX-5X-1 벡터의 MCS(multi cloning site)에 agaG1 유전자를 삽입한 형태이며, 이때 agaG1은 시그널 펩티드 코드부가 제외된 상태(서열번호 3)로 삽입된다. 이 재조합 벡터는 시그널 펩티드가 제외된 AgaG1의 N-말단에 glutathione-S transferase(GST) tag가 퓨전된 형태로 발현될 수 있도록 한다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.

1. 실험방법

1-1. 균주 준비

아가레이즈-생산 해양 박테리아인 Alteromonas sp. GNUM-1 KCTC23886(Kim and Hong 2012)을 해양 배지(MB, Difco2216, USA)를 사용하여 배양하면서 유지하였다. 클로닝 및 이종발현에 사용하는 E. coli DH5αF' 및 E. coli BL21(DE3) pLysS는 Luria Bertani(LB) 배지를 사용하여 배양하면서 유지하였다. Agar 플레이트는 1.5%의 agar를 함유하도록 하여 제조하였다.

1-2. 시약 준비

agar와 agarose는 각각 Amresco Inc., USA 및 Takara Shuzo Inc., Japan에서 구입하였다. 모든 다른 화학물질은 Sigma Chemical Co.(USA)에서 구입하였다.

1-3. 아가레이즈 유전자의 클로닝 및 시퀀싱

Alteromonas sp. GNUM-1의 유전자 라이브러리를 구축하기 위해, MB배지에서 28℃ 2일간 배양한 세포로부터 유전체 DNA를 추출하고, HindIII로 절단한 다음 0.8% agarose 겔에서 분리하였다. 약 4 ~ 10kb의 DNA 단편을 agarose 겔에서 Gel Extraction Kit(DyneBio, South Korea)를 사용하여 추출하고 HindIII로 절단한 pBluescript KS(+) 벡터와 접합시켰다. 그 후 접합체로 E. coli DH5αF'을 형질전환 시켰다. 약 1,200개의 백색 콜로니를 새로운 LB agar 배지로 옮겨 37℃에서 24시간 배양 후, Lugol's iodine 용액으로 염색하여 콜로니를 선별하였다. 1,200개의 콜로니 중 상기 염색에서 클리어존을 형성하는 8개의 아가레이즈-양성 콜로니가 선별되었다. 제한효소 지도를 위해 아가레이즈-양성 형질전환체로부터 플라스미드 DNA를 Plasmid Extraction Kit(DyneBio, South Korea)를 사용하여 추출하였다. 제한효소 절단 패턴을 기초로, 뉴클레오티드 서열을 결정하기 위한 하나의 클론(클론 A48)이 최종적으로 선별되었다. 염기서열을 결정한 후, Open reading frames(ORFs)를 ORF finder 프로그램으로 확인하고 National Center for Biotechnology Information(NCBI)의 BlastP 프로그램으로 분석하였다.

1-4. 재조합 아가레이즈의 발현 및 정제

아가레이즈로 추정되는 유전자를 함유하는 DNA 단편을 agaG1(orf1)으로 명명하였고, ORF1-GST-F(5'-GCGGGATTCCCGCGATTCCTTTCATCAGCAAGG-3' BamHI) 및 ORF1-GST-R(5'-CGCCTCGAGTGGTCATTTATTTGGACACTA-3' XhoI) 프라이머를 이용하여 PCR(polymerase chain reaction)로 클론 A48로부터 증폭하였다. PCR 산물을 agarose 겔에서 추출하고 BamHI 및 XhoI으로 절단한 다음 pGEX-5X-1에 클로닝하여 N-말단 glutathione-S transferase(GST) tag와 퓨전된 단백질을 발현하기 위한 pGEX-ORF1(도 6)을 제작하였다. pGEX-ORF1로 E. coli BL21(DE3) pLysS를 형질전환하였다. 형질전환체를 LB 배지에서 37℃로 0.7의 최적 밀도(600㎚의 파장에서 측정)가 될 때까지 배양하였다. 형질전환 이후 최종 0.2mM 농도의 isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside(IPTG)로 단백질 발현을 유도하고, 18℃에서 12시간 추가 배양하였다. 세포 배양이 끝나고 10,000rpm으로 10분간 원심분리하여 세포를 수득하고, 소니케이션으로 파쇄하였으며, 다시 14,000rpm으로 10분간 원심분리하였다. GST-퓨전 tag 단백질(GST-AgaG1)을 glutathione sepharose 컬럼(GE Healthcare, USA)을 사용하여 제조사에서 제공하는 매뉴얼에 따라 정제하였다. 용리물을 20mM Tris-Cl, pH 7.0(buffer A)를 사용하여 12시간 투석하고, 10kDa cut-off 컬럼(PALL, USA)으로 필터링하여 농축하였다.

1-5. SDS 겔 전기영동 및 아가레이즈 자이모그래피

단백질을 10% 겔을 사용한 SDS-PAGE로 분석하였다. 아가레이즈 자이모그램 분석을 위해, 끓이지 않은 단백질 샘플을 0.3% agarose를 함유하는 겔 상에 로드하였다. 전기영동 이후, 겔을 2.5% triton X-100에 30분간 담그고 buffer A로 30분간 두 번 세척한 다음 40℃에서 60분간 처리하고 Lugol's iodine 용액으로 염색하였다.

1-6. 3,5-dinitrosalicylic acid 방법을 사용한 아가레이즈 활성 결정

아가레이즈 활성을 이전 Temuujin et al.(2011)에서 제시한 3,5-dinitrosalicylic acid(DNS) 방법으로 측정하였다. 효소 용액 10㎕를 0.2% agarose가 함유된 buffer A 490㎕와 혼합하고 45℃에서 30분간 반응시켰다. 반응액을 500㎕의 DNS 반응용액(1ℓ 당 DNS 6.5g, 2M NaOH 325㎖, 글리세롤 45㎖)과 혼합하고 끓는 물에서 10분간 가열하였다. 혼합액을 상온에서 식힌 다음, 540㎚에서 blank(효소 용액 대신 10㎕의 증류수를 사용)에 대한 흡광도를 측정하였다. 아가레이즈 1 unit(U)은 분석 조건에서 1분당 1μmol의 galactose를 생산하는 효소의 양으로 정의된다. 표준곡선을 만들기 위해, galactose를 참고용 환원당으로 사용하였다.

1-7. 아가레이즈 활성의 최적 조건 결정

아가레이즈 활성의 최적 온도는 25 ~ 50℃ 범위의 온도에서 5℃의 간격으로 buffer A를 사용하여 결정하였다. 최적 pH 조건은 40℃에서 pH 5 ~ 10의 20mM buffer 용액을 사용하여 결정하였다(citrate buffer : pH 5.0 ~ 6.0, 3-(N-morpholino) propane sulfonic acid(MOPS) buffer : pH 6.0 ~ 7.0, Tris-Cl buffer : pH 7.0 ~ 9.0, glycine-NaOH buffer : pH 9.0 ~ 10.0). 재조합 아가레이즈의 온도 안정성은 25 ~ 55℃의 온도 범위에서 30분간 전반응한 다음 최적 조건(40℃ pH 7.0)하에서 결정되었다. 효소활성에서 금속이온의 효과는 1 및 5mM로 서로 다른 농도의 CoCl₂, MnCl₂, MgCl₂, CaCl₂, ZnCl₂, KCl, NaCl 및 EDTA를 함유하는 buffer A를 사용하여 40℃에서 결정하였다. 활성은 금속이온이 없는 대조군과 비교하였다.

1-8. 점도 측정

GST-AgaG1의 동점성률(Kinematic viscosity)을 Cannon-Ubbelohde viscometer(Cannon Instrument, USA)를 사용하여 결정하였다. 효소반응은 0 ~ 120분 사이의 다양한 반응시간 범위로 최적의 조건에서 수행하였다. 각 시간에서 유출시간을 측정하였다. 실험은 3회 반복하였다.

1-9. 동역학계수의 결정

효소(0.56㎍)의 Km 및 Vmax 동역학계수를 1mM CoCl₂ 및 0.5 ~ 23㎎/㎖ 사이의 다양한 양의 agarose가 함유된 buffer A에서 결정하였다. 반응은 40℃에서 10분간 수행하였다(Segel 1976). Km 및 Vmax 값은 Lineweaver and Burk(1934)의 방법을 사용하여 계산하였다.

1-10. 재조합 아가레이즈의 특성 분석

재조합 아가레이즈의 기질 특이성을 인공의 색소생산 기질인 p-nitrophenyl-α-D-galactopyranoside 및 p-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside를 사용하여 측정하였다. 500㎕의 효소용액(단백질 0.28㎍)에 500㎕의 buffer A를 첨가하고 45℃에서 2분간 전처리하였다. 20%의 기질을 함유하는 기질용액 200㎕를 첨가하고 45℃에서 12시간 반응시킨 다음 500㎕의 1M Na₂CO₃를 첨가하여 반응을 멈추게 하였다. 효소활성은 인공 색소생산 기질의 가수분해로 인해 생성되는 p-nitrophenol을 420㎚에서 분광광도법으로 측정하는 방법을 사용하여 결정하였다.

agarose 또는 다른 기질이 재조합 아가레이즈에 의한 가수분해된 생성물은 Silica Gel 60 plate(Merck, USA)를 사용한 thin layer chromatography(TLC)로 확인하였다. TLC 분석은 이전 Temuujin et al.(2012)에서 제시한 방법에 따라 수행하였다. neoagarobiose, neoagarotetraose 및 neoagarohexaose와 같은 표준 화합물은 각각 SCO3487 및 DagA에 의한 agarose 가수분해물로부터 Bio-Gel P-2 겔을 사용한 겔 투과 크로마토그래피(gel permeation chromatography)로 준비하였다(Temuujin et al. 2011, 2012).

1-11. 가수분해 산물의 구조 분석

재조합 아가레이즈에 의한 가수분해 산물의 mass 및 NMR(nuclear magnetic resonance) 분석을 위해, 가수분해 산물에 대응하는 spot을 황산을 처리하지 않은 TLC 플레이트로부터 칼로 긁어 모으고, 건조시키기 위해 100% 메탄올에 용해시켰다. 분자 질량 분포는 micrOTOF-Q(Bruker Daltonics, Germany)를 사용하여 결정하였고, mass spectra는 120 ~ 2,000 m/z의 범위에서 스캔하였다. tetramer에 대응하는 spot의 ¹³C NMR 분석은 600-MHz NMR spectrometer(Bruker Daltonics, Germany)를 사용하여 수행하였다.

1-12. 염기서열 취득번호

agaG1 유전자의 염기서열은 DDBJ/EMBL/GenBank에 accession no. KF574012으로 기탁되었다.

2. 실험결과

2-1. agarase 암호화 유전자의 분리 및 확인

Alteromonas sp. GNUM-1의 세포로부터 추출한 유전체 DNA를 HindIII로 완전히 절단하고, 4 ~ 10kb DNA 단편의 E. coli mini-expression library를 구축하였다. 8개의 agarase-양성 콜로니로부터 세포외 agarase 활성을 나타내는 하나의 콜로니를 선별하고 추가적인 실험을 위해 A48이라 명명하였다. A48 클론의 염기서열은 2개의 ORF(Orf1 및 Orf2)와 하나의 불완전 ORF(Orf3)를 포함하는 5,062bp의 HindIII insert를 갖는 것으로 확인되었다. A48 클론의 유전자의 구성 및 제한효소부위는 도 1a와 같다. orf1은 301개의 아미노산으로 구성되는 β-agarase로 추정되는 단백질을 암호화하며, 이의 염기 서열은 GenBank에 accession number KF574012로 기탁되었다. Orf1은 Flavobacteriaceae bacterium S85(GenBank accession no. ZP09496530)의 β-agarase C 및 Aquimarina agarilytica ZC1(GenBank accession no. ZP10842322)의 β-agarase C와 각각 67 및 58%의 아미노산 상동성을 나타내어 GH16 패밀리에 속한다(도 1b). orf2는 650개의 아미노산으로 구성되며, Pseudoalteromonas sp. Bsw20308(GenBank accession no. ZP11408308) 및 Glaciecola sp. HTCC2999(GenBank accession no. ZP0356045)의 TPR(tetratricopeptide repeat) 함유 단백질과 각각 56 및 51%의 아미노산 상동성을 나타내어 TPR 수퍼패밀리에 속한다. orf3는 불완전한 폴리펩티드를 암호화하고, GH42 패밀리에 속하는 박테리아 β-agarase로 추정되는 단백질의 carboxyl-terminal region과 유사성을 나타낸다.

2-2. 재조합 agarase Orf1(AgaG1)의 이종발현 및 정제

orf1만을 함유하는 DNA 단편을 클로닝하고 E. coli에 형질전환하였을 때, Lugol's iodine 용액 염색 이후 콜로니 주위에서 agar-분해 활성이 관찰되었는데, 이는 orf1이 세포외로 분비되는 agarase를 암호화하고 있다는 것을 의미하므로, 이를 agaG1이라 명명하였다. 유전자의 아미노산 서열로부터 AgaG1의 분자량이 34.7kDa인 것으로 예상된다. SignalP 프로그램을 기초로 AgaG1은 세포외 agarase의 분비에 필요한 19개의 아미노산을 함유하는 시그널 펩티드를 갖는 초기 단백질(premature protein)인 것으로 예상된다(도 1b). 초기 AgaG1의 활성화는 시그널 펩티데이즈에 의해 Ala¹⁹와 Ala²⁰ 사이가 잘려짐으로써 일어나고, 이로 인해 약 32.7kDa의 분자량 및 4.8의 이론상 등전점(isoelectric point)을 갖는 282개의 아미노산으로 이루어진 완성형 단백질이 형성된다.

전체 agaG1 유전자를 보유한 E. coli 형질전환체를 LB 액체배지에서 배양하고 소니케이션과 원심분리로 분리하였을 때, 대부분의 agarase 활성이 세포 파편에서 나타났으나 세포외부 분획물에서도 약간 나타났다. 이는 E. coli와 Alteromonas sp. GNUM-1의 단백질 분비 체계가 서로 달라 발현된 agarase가 세포막에 결합되었기 때문인 것으로 추정되었다. 이에 따라 E. coli의 세포질에서 agaG1을 발현하기로 하였다. E. coli의 세포내부 발현을 위해, 시그널 펩티드 서열(Met¹ ~ Ala¹⁹)이 없는 완성형 단백질을 암호화하는 유전자 단편을 pGEX-5X-1에 클로닝하여, N-말단에 GST tag를 갖는 퓨전 단백질로 발현되도록 디자인하였다. GST-AgaG1 퓨전 단백질을 glutathione sepharose 컬럼 상에서 세포 용해질로부터 정제하였고, SDS-PAGE 상에서 이것의 분자량이 약 59kDa인 것으로 예상되었는데(도 2), 이는 GST-tag(26kDa)을 갖는 완성형 AgaG1(32.7kDa)의 예상되는 분자량과 완전하게 일치하였다. AgaG1의 순도는 Bio-Rad GS670 imaging densitometer(USA)에 의해 92%인 것으로 나타났다. 숙주인 E. coli로부터 오염된 것으로 보이는 AgaG1 아래의 약한 단백질 밴드(분자량 약 52kDa)가 SDS-PAGE에서 관찰되었다. 정제된 단백질은 agarase 활성을 나타냈지만, alkaline phosphatase, amylase, xylanase 및 protease와 같은 다른 효소 활성은 나타나지 않았다. 추가로, 자이모그램 분석을 통해 SDS-PAGE 상에서 정제된 GST-AgaG1에 대응하는 이 단백질이 agarase 활성을 갖는다는 것을 확인하였다 (도 2).

2-3. 효소적 특성

GST-AgaG1의 agarase 활성 상 온도의 효과를 25 ~ 55℃ 사이의 온도에서 "Material and methods"에 소개된 반응 조건에 따라 관련 활성을 측정하여 조사하였다(도 3a). GST-AgaG1은 25 ~ 45℃ 사이에서 높은 활성을 나타내며, 최고 활성은 40℃에서 나타났다. 비록 45℃에서 최고 활성의 90%까지 효소 활성을 유지하였지만, 50 및 55℃에서는 활성이 각각 20 및 3%로 급격히 낮아졌다. 이 단백질의 온도 안정성을 각각 다른 온도로 열처리한 효소 샘플을 사용한 관련 잔여 활성을 측정하여 결정하였다(도 3a). GST-AgaG1은 40℃(100%) 까지 안정적이었고, 45℃에서 초기 활성의 70% 이상을 유지하였지만, 50℃(19%)에서는 안정성이 급격히 낮아졌다.

GST-AgaG1의 활성에서 pH의 효과를 pH 5.0 ~ 10.0의 범위에서 관련 활성을 측정하여 결정하였다(도 3b). GST-AgaG1은 폭이 좁은 pH 양상을 나타내었으며, pH 7.0에서 최대 효소 활성을 갖고 pH 8.0에서 이 활성의 42% 이상 유지되었다. 이 효소는 산성(pH 6.0) 및 염기성(pH 9.0) 조건에서 낮은 활성을 나타내었다. agarose에 대한 GST-AgaG1의 Km 및 Vmax 값은 각각 3.74㎎/㎖과 23.6U/㎎으로 나타났다(도 3b).

GST-AgaG1의 agarase 활성을 서로 다른 금속 이온(표 1)의 존재하에서 기질로 agarose를 사용하여 결정하였다. 실험한 1mM 금속 이온 중에서, agarase 활성은 CoCl₂(125%)에 의해 증가한 반면, MgCl₂(78%)와 ZnCl₂(64%)에 의해 감소하였다. agarase 활성은 MnCl₂(8%) 및 CaCl₂(3%)에 의해 강하게 저해된 반면, KCl 및 NaCl과 같은 다른 일가 양이온에는 영향을 받지 않았다. 효소활성은 1mM EDTA의 첨가로 영향을 받지 않았다. 5mM 금속이온 실험 중에서, agarase 활성은 ZnCl₂(47%)에 의해 강하게 저해된 반면, MgCl₂(78%)에 의해서는 저해 정도가 절반으로 줄었다. 효소활성은 MnCl₂ 및 CaCl₂에 의해 완전히 저해된 반면, CoCl₂, KCl 및 NaCl과 같은 다른 양이온에 의해서는 영향을 받지 않았다. EDTA는 5mM의 농도에서 효소활성(88%)을 부분적으로만 저해하였다. 요약하자면, AgaG1은 효소활성화를 위해 금속이온을 필요로 하지 않으며, 몇몇 이가 금속이온이 AgaG1의 촉매영역(catalytic domain) 아미노산에 결합하여 효소활성을 저해하는 것으로 보인다.

금속이온	% 활성
금속이온	1mM	5mM
None	100	100
CoCl₂	125	99
MnCl₂	8	0
MgCl₂	78	78
CaCl₂	3	0
ZnCl₂	64	47
KCl	105	99
NaCl	99	99
EDTA	101	87

2-4. 작용기작

GST-AgaG1의 기질 특이성을 p-nitrophenyl-α-D-galactopyranoside 및 p-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside의 두 가지 색소생산성 기질을 사용하여 결정하였다. GST-AgaG1은 p-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside에 대해 강한 가수분해 활성(OD₅₄₀ = 0.547)을 나타내었으나, p-nitrophenyl-α-D-galactopyranoside에 대해서는 활성이 거의 없었다(OD₅₄₀ = 0.004). 이는 이 효소가 β-linkage를 인식하고 α-linkage는 인식하지 못한다는 것을 나타낸다. 이러한 결과는 GST-AgaG1이 agar로부터 neoagaro-oligosaccharide를 생산하는 β-agarase라는 것을 나타낸다.

GST-AgaG1을 처리한 후 agarose 용액의 점도는 초기 30분 반응 동안 유의적으로 감소하였고, 반응이 끝날 때까지 점차 감소하였다(도 4a). 이러한 가수분해 양상은 GST-AgaG1 단백질이 endo형 agarase라는 것을 나타낸다.

GST-AgaG1의 작용기작 또한 TLC(도 4b, 좌측 패널)를 통해 확인하였다. agarose는 주요 최종산물인 neoagarotetraose(DP4)와 neoagarohexaose(DP6)로 빠르게 가수분해 되었다. neoagarobiose(DP2)는 가수분해 6시간 후 최종산물로 나타났다. 반응과정동안 neoagarohexaose 보다 긴 다양한 길이의 neoagaro-oligosaccharide가 계속해서 가수분해 되고 neoagarobiose가 점차 축적되었다. 한편, D-galactose 및 3,6-anhydro-α-L-galactose와 같은 단당류는 최종산물로 가수분해 될 때까지 나타나지 않았다. 또한 GST-AgaG1 단백질은 단량체를 생성하지 않고 neoagarotetraose를 neoagarobiose로 완전히 가수분해하였다(도 4b 오른쪽 패널). 점도 변화와 함께 이들 결과는 GST-AgaG1이 agarose로부터 최종산물로 neoagarobiose를 생산하는 endo형의 β-agarase라는 것을 나타낸다.

2-5. 가수분해물의 분석

neoagaro-oligosaccharide의 분자량을 mass spectrometry 분석으로 확인하였다. m/z 347(M+Na)⁺, 653(M+Na)⁺ 및 959(M+Na)⁺의 생성 이온이 각각 neoagarobiose, neoagarotetraose 및 neoagarohexaose에 대응하였다(도 5a).

TLC 플레이트에서 긁어 모은 spot의 ¹³C NMR 스팩트럼은 neoagaro-oligosaccharide의 전형적인 양상을 나타내었다(Morrice et al. 1983; Temuujin et al. 2012). 93 및 97ppm에서 파장 신호는 neoagaro-oligosaccharide 환원말단의 D-galactose 잔기의 탄소 원자를 가리키고(Rochas et al. 1986), 이러한 특징은 β-agarase에 의해 β-(1,4) linkage가 잘렸다는 것을 나타낸다(도 5b). 추가로, 환원말당의 3,6-anhydro-α-L-galactose 잔기의 탄소 원자에 대응하는 73.38, 73.76, 76.46, 83.15, 85.49 및 90.77ppm의 신호(Aoki et al. 1990 Rochas et al. 1994)는 나타나지 않았다. 이러한 증거들로부터 GST-AgaG1이 agarose의 β-(1,4) linkage를 가수분해하여 최종산물로 neoagarobiose를 생성하는 endo형 β-agarase라는 것으로 결론지었다.

<110> Myongji University Industry and Academia Cooperation Foundation <120> Beta agarase from Alteromonas sp. GNUM-1 <130> PA140211-C01 <160> 4 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 282 <212> PRT <213> Alteromonas sp. GNUM-1 <400> 1 Ala Ile Pro Phe Ile Ser Lys Ala Thr Glu Lys Ser Phe Asp Val Asp 1 5 10 15 Glu Ala Ser Pro Leu Met Pro Ser Phe Val Ala Phe Glu Asp Thr Thr 20 25 30 Pro Ala Gly Met Thr Trp Gln Lys Val Glu Ala Leu Ser Asp Glu Phe 35 40 45 Asn Gln Ser Trp Asp Ala Ser Lys Trp Lys Arg Ser Asn Trp Asn Tyr 50 55 60 Ser Asp Thr Pro Val Asn Met Val Asp Thr Asn Ser Gly Val Glu Asn 65 70 75 80 Gly Tyr Leu Trp Ile Ser Ala Thr Leu Asp Asp Ser Thr Glu Glu Ser 85 90 95 Trp Phe Lys Thr Ser Arg Val His Ser Lys Ala Lys Ile Ser Phe Pro 100 105 110 Met Tyr Thr Glu Thr Arg Leu Lys Val Ala His Ile Ala Ala Tyr Asn 115 120 125 Thr Phe Trp Leu Asn Asn Gly Asp Ala Asp Asn Arg Asp Glu Ile Asp 130 135 140 Ile Ile Glu Ile Asn Ser Asp Pro Thr Cys Gly Glu Asn Asp Glu Tyr 145 150 155 160 Pro Trp Gln Met Asn Ser Gln Tyr Phe Ile Val Lys Asn Gly Glu Thr 165 170 175 Glu Arg Asn Lys Gly Pro Trp Ser Thr Lys Lys Leu Ser Asp Ala Asn 180 185 190 Thr Arg Lys Gly Val Thr Trp Asn Gln Asp Tyr His Val Phe Gly Ala 195 200 205 Trp Trp Lys Asp Glu His Asn Val Gln Phe Tyr Leu Asn Gly Glu Pro 210 215 220 Ala Gly His Val Val Ser Ser Gln Pro Phe Thr Leu Gln Gln Glu Leu 225 230 235 240 Ile Trp Asp Leu Trp Thr Gln Asp Ser Ser Trp Val Cys Gly Leu Pro 245 250 255 Glu Lys Glu Asp Leu Leu Asp His Lys Arg Asn Thr Met Lys Val Asp 260 265 270 Trp Val Arg Thr Trp Lys Leu Val Ser Lys 275 280 <210> 2 <211> 301 <212> PRT <213> Alteromonas sp. GNUM-1 <400> 2 Met Ser Ser Met Lys Lys Met Val Tyr Ile Phe Val Ala Val Ser Thr 1 5 10 15 Ala Val Ala Ala Ile Pro Phe Ile Ser Lys Ala Thr Glu Lys Ser Phe 20 25 30 Asp Val Asp Glu Ala Ser Pro Leu Met Pro Ser Phe Val Ala Phe Glu 35 40 45 Asp Thr Thr Pro Ala Gly Met Thr Trp Gln Lys Val Glu Ala Leu Ser 50 55 60 Asp Glu Phe Asn Gln Ser Trp Asp Ala Ser Lys Trp Lys Arg Ser Asn 65 70 75 80 Trp Asn Tyr Ser Asp Thr Pro Val Asn Met Val Asp Thr Asn Ser Gly 85 90 95 Val Glu Asn Gly Tyr Leu Trp Ile Ser Ala Thr Leu Asp Asp Ser Thr 100 105 110 Glu Glu Ser Trp Phe Lys Thr Ser Arg Val His Ser Lys Ala Lys Ile 115 120 125 Ser Phe Pro Met Tyr Thr Glu Thr Arg Leu Lys Val Ala His Ile Ala 130 135 140 Ala Tyr Asn Thr Phe Trp Leu Asn Asn Gly Asp Ala Asp Asn Arg Asp 145 150 155 160 Glu Ile Asp Ile Ile Glu Ile Asn Ser Asp Pro Thr Cys Gly Glu Asn 165 170 175 Asp Glu Tyr Pro Trp Gln Met Asn Ser Gln Tyr Phe Ile Val Lys Asn 180 185 190 Gly Glu Thr Glu Arg Asn Lys Gly Pro Trp Ser Thr Lys Lys Leu Ser 195 200 205 Asp Ala Asn Thr Arg Lys Gly Val Thr Trp Asn Gln Asp Tyr His Val 210 215 220 Phe Gly Ala Trp Trp Lys Asp Glu His Asn Val Gln Phe Tyr Leu Asn 225 230 235 240 Gly Glu Pro Ala Gly His Val Val Ser Ser Gln Pro Phe Thr Leu Gln 245 250 255 Gln Glu Leu Ile Trp Asp Leu Trp Thr Gln Asp Ser Ser Trp Val Cys 260 265 270 Gly Leu Pro Glu Lys Glu Asp Leu Leu Asp His Lys Arg Asn Thr Met 275 280 285 Lys Val Asp Trp Val Arg Thr Trp Lys Leu Val Ser Lys 290 295 300 <210> 3 <211> 849 <212> DNA <213> Alteromonas sp. GNUM-1 <400> 3 gcgattcctt tcatcagcaa ggccactgaa aaaagttttg atgttgatga agcaagccca 60 ttaatgccat cgtttgtcgc attcgaagat acaacgcccg ccggtatgac atggcaaaaa 120 gttgaagctc tttccgatga gtttaatcag tcgtgggacg cgtctaaatg gaaaagatca 180 aattggaatt attctgacac tcctgtgaat atggttgata caaactcagg ggtggagaat 240 ggctaccttt ggattagtgc tacgctggat gattcaacag aagaaagctg gtttaaaact 300 tcacgggtac attctaaagc gaaaattagc tttcctatgt acacagaaac acgtttgaaa 360 gttgcacaca tagcggctta taacacattt tggttgaata atggtgatgc agataatcga 420 gatgaaattg atattattga gattaattct gatccaactt gtggggagaa tgatgaatat 480 ccttggcaga tgaattctca gtattttatt gttaaaaatg gagaaacaga gcgtaataaa 540 gggccttgga gcacgaaaaa attatcggat gccaacaccc gtaaaggcgt gacgtggaac 600 caggactatc atgtatttgg cgcatggtgg aaagatgaac acaatgtaca gttttacctg 660 aatggggaac cggcgggtca tgtagtgagc agtcagcctt tcacgttaca gcaggagctg 720 atttgggatc tctggacgca agacagttct tgggtttgcg gcctgccaga aaaagaagac 780 ttactagacc ataagcgcaa tacaatgaag gttgactggg ttaggacatg gaagttagtg 840 tccaaataa 849 <210> 4 <211> 906 <212> DNA <213> Alteromonas sp. GNUM-1 <400> 4 atgagttcta tgaaaaaaat ggtctatata tttgtggctg tttcaacagc tgttgcagcg 60 attcctttca tcagcaaggc cactgaaaaa agttttgatg ttgatgaagc aagcccatta 120 atgccatcgt ttgtcgcatt cgaagataca acgcccgccg gtatgacatg gcaaaaagtt 180 gaagctcttt ccgatgagtt taatcagtcg tgggacgcgt ctaaatggaa aagatcaaat 240 tggaattatt ctgacactcc tgtgaatatg gttgatacaa actcaggggt ggagaatggc 300 tacctttgga ttagtgctac gctggatgat tcaacagaag aaagctggtt taaaacttca 360 cgggtacatt ctaaagcgaa aattagcttt cctatgtaca cagaaacacg tttgaaagtt 420 gcacacatag cggcttataa cacattttgg ttgaataatg gtgatgcaga taatcgagat 480 gaaattgata ttattgagat taattctgat ccaacttgtg gggagaatga tgaatatcct 540 tggcagatga attctcagta ttttattgtt aaaaatggag aaacagagcg taataaaggg 600 ccttggagca cgaaaaaatt atcggatgcc aacacccgta aaggcgtgac gtggaaccag 660 gactatcatg tatttggcgc atggtggaaa gatgaacaca atgtacagtt ttacctgaat 720 ggggaaccgg cgggtcatgt agtgagcagt cagcctttca cgttacagca ggagctgatt 780 tgggatctct ggacgcaaga cagttcttgg gtttgcggcc tgccagaaaa agaagactta 840 ctagaccata agcgcaatac aatgaaggtt gactgggtta ggacatggaa gttagtgtcc 900 aaataa 906

Claims

서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지는 것을 특징으로 하는 베타아가레이즈(beta-agarase).
제 1항에 있어서,
상기 베타아가레이즈는
아가(agar) 또는 아가로오스(agarose)와 반응하여
네오아가로 올리고당(neoagaro-oligosaccharide)을 생산하는 것을 특징으로 하는 베타아가레이즈.
제 2항에 있어서,
상기 네오아가로 올리고당은
네오아가로비오스(neoagarobiose), 네오아가로테트라오스(neoagarotetraose) 및 네오아가로헥사오스(neoagarohexaose) 중에서 선택된 것임을 특징으로 하는 베타아가레이즈.
제 1항에 있어서,
상기 베타아가레이즈는
38 내지 42℃에서 최고 활성을 나타내는 것을 특징으로 하는 베타아가레이즈.
제 1항에 있어서,
상기 베타아가레이즈는
pH 6.5 내지 7.5에서 최고 활성을 나타내는 것을 특징으로 하는 베타아가레이즈.
제 1항에 있어서,
상기 베타아가레이즈는
아가로오스에 대해 3.5 내지 4.0㎎/㎖의 Km 값을 갖는 것을 특징으로 하는 베타아가레이즈.
제 1항에 있어서,
상기 베타아가레이즈는
아가로오스에 대해 20 내지 30U/㎎의 Vmax 값을 갖는 것을 특징으로 하는 베타아가레이즈.
제 1항에 있어서,
상기 베타아가레이즈는
endo형(endo type)인 것을 특징으로 하는 베타아가레이즈.
제 1항에 있어서,
상기 베타아가레이즈는
아가로오스와 반응하여
최종산물(end product)로 네오아가로비오스(neoagarobiose)를 생산하는 것을 특징으로 하는 베타아가레이즈.
서열번호 3의 염기서열로 표시되는 베타아가레이즈 유전자.
서열번호 3의 염기서열로 표시되는 DNA를 포함하고
원핵세포 또는 진핵세포를 형질전환시킬 수 있는 베타아가레이즈 재조합 발현 벡터.
제 11항에 있어서,
상기 베타아가레이즈 발현 벡터는
베타아가레이즈에 글루타치온-S-전달효소(glutathione-S-transferase)가 결합되어 발현되도록 이루어지는 것을 특징으로 하는 베타아가레이즈 재조합 발현 벡터.
제 11항에 있어서,
상기 베타아가레이즈 발현 벡터는
도 6에 개시된 pGEX-Orf1으로 표시되는 것을 특징으로 하는 베타아가레이즈 재조합 발현 벡터.
제 11항 내지 제 13항 중 어느 한 항의 베타아가레이즈 재조합 발현 벡터로 형질전환된 베타아가레이즈 생산용 세포.
제 14항에 있어서,
상기 세포는 원핵세포인 것을 특징으로 하는 베타아가레이즈 생산용 세포.
제 15항에 있어서,
상기 원핵세포는 대장균(Escherichia coli)인 것을 특징으로 하는 베타아가레이즈 생산용 세포.
제 14항의 베타아가레이즈 생산용 세포를 배양하고,
배양물로부터 베타아가레이즈를 수득하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 베타아가레이즈 제조방법.
제 1항 내지 제 9항 중 어느 한 항의 베타아가레이즈와 기질로 아가 또는 아가로오스를 효소반응시키는 것을 특징으로 하는 네오아가로 올리고당 제조방법.
제 18항에 있어서,
상기 효소반응은 25 내지 45℃의 온도조건에서 이루어지는 것을 특징으로 하는 네오아가로 올리고당 제조방법.
제 18항에 있어서,
상기 효소반응은 pH 6.5 내지 7.5의 수소이온농도 조건에서 이루어지는 것을 특징으로 하는 네오아가로 올리고당 제조방법.
제 18항에 있어서,
상기 네오아가로 올리고당은 네오아가로비오스인 것을 특징으로 하는 네오아가로 올리고당 제조방법.