JPWO2008102743A1 - 新規なα−ガラクトシダーゼ - Google Patents
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Abstract
Description
[1] 下記の特性を有するα−ガラクトシダーゼ。
(1)作用:本酵素は、スクロースとガラクトースを原料とした脱水縮合反応において、生成オリゴ糖中のラフィノース含有率が0.5%以上のとき、ラフィノース合成選択率が65%以上という性質を有する。
(2)至適pH範囲:3.5〜5.0
(3)安定pH範囲:3.5〜10.0
(4)分子量:約80,000
[2] Bacillus coagulansに属する微生物に由来する、[1]に記載のα−ガラクトシダーゼ。
[3] Bacillus coagulansがBacillus coagulans AKC003株、AKC004株(FERM−ABP10948)、AKC005株、AKC006株のいずれかである[2]に記載のα−ガラクトシダーゼ。
[4] Bacillus coagulans AKC003株、AKC004株(FERM−ABP10948)、AKC005株、AKC006株のいずれかに属するBacillus coagulansおよびその変異体。
(a)配列番号2で表わされるアミノ酸配列;
(b)配列番号2で表されるアミノ酸配列において、1又は数個のアミノ酸が欠失、置換、及び/又は付加されたアミノ酸配列であって、α−ガラクトシダーゼ活性を有するアミノ酸配:
(c)配列番号2に表されるアミノ酸配列に対して60%以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、α−ガラクトシダーゼ活性を有するアミノ酸配列:
[6] 下記(a)、(b)又は(c)の何れかのアミノ酸配列からなるα−ガラクトシダーゼをコードするα−ガラクトシダーゼ遺伝子。
(a)配列番号2で表わされるアミノ酸配列;
(b)配列番号2で表されるアミノ酸配列において、1又は数個のアミノ酸が欠失、置換、及び/又は付加されたアミノ酸配列であって、α−ガラクトシダーゼ活性を有するアミノ酸配:
(c)配列番号2に表されるアミノ酸配列に対して60%以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、α−ガラクトシダーゼ活性を有するアミノ酸配列:
[7] 以下の(a)または(b)の塩基配列からなるα−ガラクトシダーゼ遺伝子。
(a)配列番号1で表される塩基配列;
(b)配列番号1で表される塩基配列において、1又は数個の塩基が欠失、置換、及び/又は付加された塩基配列であって、かつ、α−ガラクトシダーゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列:
[9] [6]又は[7]に記載のα−ガラクトシダーゼ遺伝子又は[8]に記載の組み換えベクターを導入した形質転換体。
[10] [9]に記載の形質転換体を培養して得られるα−ガラクトシダーゼ。
[11] [1]〜[3]、[5]、又は[10]のいずれか一項に記載のα−ガラクトシダーゼを含む酵素組成物。
[12] α−グルコシダーゼ、β−グルコシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、セルラーゼ、キシラナーゼ、プロテアーゼ、ガラクタナーゼ、アラビナナーゼ、マンナナーゼ、ラムノガラクツロナーゼ、ポリガラクツロナーゼ、ペクチンメチルエステラーゼ、ペクチンリアーゼ、及びポリガラクツロン酸リアーゼから選択される少なくとも1種以上の成分をさらに含有する、[11]に記載の酵素組成物。
[13] [11]又は[12]のいずれかに記載の酵素組成物を含むラフィノース合成試薬。
[14] [1]〜[3]、[5]、又は[10]のいずれか一項に記載のα−ガラクトシダーゼ、[11]又は[12]に記載の酵素組成物、若しくは[13]に記載のラフィノース合成試薬を用いることを特徴とするラフィノースの製造方法。
[16] Bacillus coagulans AKC003株、AKC004株(FERM−ABP10948)、AKC005株、AKC006株のいずれかに属するBacillus coagulans及び/又はその変異体を培養して得た微生物触媒を利用することを特徴とするラフィノースの製造方法。
[17] [9]に記載の形質転換体を培養して得た微生物触媒を利用することを特徴とするラフィノースの製造方法。
[19] 原料としてスクロース及びガラクト−スを用いる、[14]〜[18]のいずれかに記載のラフィノースの製造方法。
[20] 原料中のスクロース濃度が30%(w/v)〜90%(w/v)であり、原料中のガラクトース濃度が2%(w/v)〜45%(w/v)である、[19]に記載のラフィノースの製造方法。
本発明のα−ガラクトシダーゼは、Bacillus coagulansに属する微生物に由来するものであり、当該微生物としては、Bacillus coagulansに属する微生物であればどのようなものを用いてもよく、ラフィノースを選択的に合成可能なα−ガラクトシダーゼを発現する任意の微生物を用いることができる。好ましくは、Bacillus coagulans AKC-003株, AKC-004株, AKC-005株, AKC-006株が挙げられる。また、本発明における微生物は、Bacillus coagulansに属する微生物を親株として得られる変異株であってもかまわない。Bacillus coagulans AKC-003株, AKC-004株, AKC-005株, AKC-006株はそれぞれ、2006年(平成18年)11月14日に独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター(日本国茨城県つくば市東一丁目1番地1 中央第6)に寄託されている。受託番号は以下の通りである。なお、AKC-004株は、2008年(平成20年)1月30日に、受領番号FERM−ABP10948、及び受託番号FERM−BP10948として国際寄託に移管されている。
AKC-003株(FERM P−21091)
AKC-004株(FERM P−21092;FERM−ABP10948;FERM−BP10948)
AKC-005株(FERM P−21093)
AKC-006株(FERM P−21094)
(1)作用:本酵素は、スクロースとガラクトースを原料とした脱水縮合反応において、生成オリゴ糖中のラフィノース含有率が0.5%以上のとき、ラフィノース合成選択率が65%以上という性質を有する。
(2)至適pH範囲:3.5〜5.0
(3)安定pH範囲:3.5〜10.0
(4)分子量:約80,000
基質特異性:p−ニトロフェニル−α−D−ガラクトピラノシドを基質とした場合、分解活性は最も高く、次いでメリビオース、次いでラフィノースの順である。一方、p−ニトロフェニル−β−D−ガラクトピラノシド、ラクトース、スクロースは分解しない。
金属イオンの影響:カリウム、カルシウム、マグネシウム、クロム、マンガン、コバルト、鉄(II)、鉄(III)イオンをそれぞれ添加した場合、活性の低下は見られない。一方、ニッケル、亜鉛イオンをそれぞれ添加した場合、活性の低下が見られ、銅イオンを添加した場合に最も活性が低下する。
さらに本発明の酵素の具体例としては、下記の特性を有するものでもよい。
(5)(正反応の)至適温度範囲:35〜50℃
(6)安定温度範囲:45℃まで安定である。
Bacillus coagulans AKC−004株を上記の培地で培養し、得られた培養液を、遠心分離、濾過等の公知の手段により菌体と濾液とに分離する。上記のようにして得られた菌体についてリゾチームや超音波破砕機、フレンチプレス等を用いた菌体の破砕を行い、染色体DNAを単離する。上記のようにして得られた染色体DNAを種々の制限酵素で消化し、DNA断片を得る。上記のようにして得られた染色体DNA断片を用いて、ショットガンクローニングやインバースPCR法等を利用した公知の手段によりα−ガラクトシダーゼ遺伝子の全長、またはその一部を含むDNA断片を取得する。ここで得られたα−ガラクトシダーゼ遺伝子を含むDNA断片の塩基配列をDNAシークエンサー等を利用した公知の方法で解析し、その塩基配列を明らかにする。また、α−ガラクトシダーゼ遺伝子の部分的な塩基配列のみが明らかになった場合、その塩基配列を基に再度α−ガラクトシダーゼ遺伝子を含むDNA断片を取得することもできる。また、この操作を繰り返すことで、α−ガラクトシダーゼ遺伝子全長の塩基配列を明らかにすることも可能である。上記のようにして解読したα−ガラクトシダーゼ遺伝子の塩基配列を基に、PCR法や制限酵素を用いた公知の方法によって、α−ガラクトシダーゼ遺伝子の全長を含むDNA断片を得ることができる。上記のようにして解読したα−ガラクトシダーゼ遺伝子の塩基配列から、α−ガラクトシダーゼのアミノ酸配列を決定することができる。
(a)配列番号2で表わされるアミノ酸配列;
(b)配列番号2で表されるアミノ酸配列において、1又は数個のアミノ酸が欠失、置換、及び/又は付加されたアミノ酸配列であって、α−ガラクトシダーゼ活性を有するアミノ酸配:
(c)配列番号2に表されるアミノ酸配列に対して60%以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、α−ガラクトシダーゼ活性を有するアミノ酸配列:
(a)配列番号2で表わされるアミノ酸配列;
(b)配列番号2で表されるアミノ酸配列において、1又は数個のアミノ酸が欠失、置換、及び/又は付加されたアミノ酸配列であって、α−ガラクトシダーゼ活性を有するアミノ酸配:
(c)配列番号2に表されるアミノ酸配列に対して60%以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、α−ガラクトシダーゼ活性を有するアミノ酸配列:
(a)配列番号1で表される塩基配列;
(b)配列番号1で表される塩基配列において、1又は数個の塩基が欠失、置換、及び/又は付加された塩基配列であって、かつ、α−ガラクトシダーゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列:
ラフィノース合成反応終了後、反応液を25倍希釈して、99℃で10分間保持することで反応を停止した。反応停止後、遠心分離により微生物を除去し、得られた反応溶液を高速液体クロマトグラフィー(HPLC)を用いて定量した。測定には、Thermoelectron社製 Hypercarbカラム、検出器はRIを用いた。生成オリゴ糖中のラフィノース含有率は、HPLC分析チャートに検出された各々のピーク面積比から(ラフィノースのピーク面積)/(生成オリゴ糖のピーク面積)×100により算出した。
Bacillus coagulans AKC−004株(受託番号FERM P−21092(FERM−ABP10948に移管):寄託機関; 独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター)をTBAB(Tryptose Blood Agar Base)プレート (Difco)で、55℃、1日間培養してコロニーを形成させた。
実施例1で得られた精製α−ガラクトシダーゼを用いて、その作用に関する実験を行った。
各pHの100mM緩衝液に溶解させた6mMのp−ニトロフェニル−α−D−ガラクトピラノシド150μLに、100倍希釈した本発明の精製酵素液50μLを混合し、40℃で5分間反応させた。反応後、遊離されたp−ニトロフェノールを定量することで活性を測定し、最大活性を100とする相対活性を求めた。この結果を図1に示す。なお、使用した緩衝液は、グリシン−HCl緩衝液(pH2.5〜3.5)、酢酸ナトリウム緩衝液(pH3.5〜6.0)、リン酸ナトリウム緩衝液(pH6.0〜8.5)、グリシン−NaOH緩衝液(pH8.5〜10.0)である。
pH4.0〜10.0の範囲で10mMの緩衝液を用いて、各pHで45℃、140分間の加熱処理を行い、その残存活性を測定し、前記と同様に最大活性を100とする相対活性を求めた。この結果を図2に示す。なお、使用した各pHの緩衝液の種類は前記のものと同様である。
pH4.5の酢酸ナトリウム緩衝液に溶解させた4.7mMのp−ニトロフェニル−α−D−ガラクトピラノシド190μLに、20倍希釈した本発明の精製酵素液10μLを混合し、20〜60℃の範囲で5分間反応させた。反応後、遊離されたp−ニトロフェノールを定量することで活性を測定し、最大活性を100とする相対活性を求めた。この結果を図3に示す。
pH4.5の100mM酢酸ナトリウム緩衝液を用いて、30〜55℃の各温度で20分間加熱処理を行い、その残存活性を測定し、前記と同様に最大活性を100とする相対活性を求めた。この結果を図4に示す。
分離ゲル濃度が10%の「レディーゲルJ」(日本バイオ・ラッド ラボラトリーズ株式会社)を用いるSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により、分子量を求めた。この結果を図5に示す。分子量は約80,000であり、アミノ酸配列から推定される分子量83,122とほぼ一致した。
10mMの各種基質を含むpH4.5の100mM酢酸ナトリウム緩衝液150μLに100倍希釈した本発明の精製酵素液50μLを混合し、40℃で20分間反応させた。ただし、p−ニトロフェニル−α−D−ガラクトピラノシドを基質に用いた反応では、反応時間を5分間とした。反応後、遊離されたp−ニトロフェノールの定量、あるいは「Shodex SUGAR」(昭和電工株式会社)カラムを用いた高速液体クロマトグラフィーによる分析から分解された基質の定量を行い、最大活性を100とした各基質に対する相対活性を求めた。この結果を表2に示す。また、そのなかで基質となり得たものについて、反応速度を測定した結果を表3に示す。
pH4.5の酢酸ナトリウム緩衝液に溶解させた6mMのp−ニトロフェニル−α−D−ガラクトピラノシドに各種金属イオンを終濃度1mMとなるように添加して150μLとし、100倍希釈した本発明の精製酵素液50μLを混合し、40℃で20分間反応させた。反応後、遊離されたp−ニトロフェノールを定量することで活性を測定し、最大活性を100とする相対活性を求めた。この結果を表4に示す。
実施例1記載の精製α−ガラクトシダーゼ0.5Uを分取し、1.5mL容ポリプロピレン製チューブに入れた200μLの糖液(pH5.0の100mM酢酸ナトリウム緩衝液にスクロース73%、ガラクトース12%を含む)に添加、混合し、60℃、1,200rpmで反応を行った。反応開始から45時間後に反応液のうち20μLを採取し、480μL蒸留水で希釈を行った後、99℃で10分間処理することで酵素を熱失活させた。熱失活後の希釈糖液を常温に戻した後、「Hypercarb」(Thermoelectron社製)カラムを用いた高速液体クロマトグラフィーで分析を行った。その結果を図6に示す。生成オリゴ糖中のラフィノース含有率は82%であり、反応液中のラフィノース濃度は1.67重量%であった。
(1)染色体DNAの調製
常法に従ってBacillus coagulans AKC−004株の染色体DNAを調製した。実施例1記載の方法で取得したBacillus coagulans AKC−004株の培養液60mLを、遠心分離して菌体を回収した。得られた菌体をLysisバッファー(50mM Tris−HCl(pH 8.0)、20mM EDTA、50mM グルコース)に懸濁し、よく洗浄した。遠心分離して菌体を回収した後、Lysisバッファーに再懸濁し、これにリゾチームを加え37℃で45分間インキュベートした。次いでSDSとRNaseを添加し、37℃で45分間インキュベートした。その後Proteinase Kを添加し、50℃で60分間穏やかに振盪した。ここで得られた溶液をフェノール−クロロホルム、クロロホルムで処理後、エタノール沈殿し、析出した核酸をガラスピペットに巻きつけて回収した。この核酸を70%エタノールで洗浄後、乾燥し、TEに再溶解した。この操作により、約1mgの染色体DNAを調製した。
上記(1)において調製した染色体DNAから、α−ガラクトシダーゼ遺伝子断片を増幅するためのPCRプライマーを設計、合成した。プライマーの設計は公知の数種の微生物由来α−ガラクトシダーゼ遺伝子のアライメント結果を基に行い、センスプライマーは5'-GAAGTITACGGITTYAGYYTTGTITACAGYGG-3'(配列番号3)の配列を有するオリゴDNAを、アンチセンスプライマーは5'-CCAAACCAICCRTCRTCIARIACRAA-3' (配列番号4)の配列を有するオリゴDNAをそれぞれ合成した。なお、配列中、Iはイノシン、YはC又はT、RはA又はGを示す。ここで得られたPCRプライマーを用い、上記(1)において調製した染色体DNAを鋳型としてPCR法によるα−ガラクトシダーゼ遺伝子断片の増幅を行い、380塩基対からなるα−ガラクトシダーゼ遺伝子断片を取得した。ここで得られた遺伝子断片の塩基配列を、DNAシークエンサーを用いて解析した。
DNAシークエンサーを用いて、(2)で得られたPCR産物からα−ガラクトシダーゼ遺伝子の塩基配列を決定した。その結果、配列番号1に示す5’末端からのDNA塩基配列を有する2190塩基対のα−ガラクトシダーゼの構造遺伝子を解読した。この配列はこれまで見出されていない新規な遺伝子であった。また、このDNA塩基配列より類推されるBacillus coagulans AKC−004株が生産するα−ガラクトシダーゼは730個のアミノ酸からなり、配列番号2に示すようなN末端からのアミノ酸配列を有していた。データベース検索の結果、このアミノ酸配列はGeobacillus stearothermophilus由来α−ガラクトシダーゼ(AgaN)と57%、Geobacillus stearothermophilus由来α−ガラクトシダーゼ(AgaA)と56%、Geobacillus stearothermophilus由来α−ガラクトシダーゼ(AgaB)と56%、Lactococcus raffinolactis由来α−ガラクトシダーゼと56%の相同性を有し、新規なα−ガラクトシダーゼをコードしていることが明らかになった。
(3)で得られたα−ガラクトシダーゼ遺伝子の配列を基に、α−ガラクトシダーゼ遺伝子のSD配列、構造遺伝子、終始コドンを含む領域を増幅するためのPCRプライマーを設計・合成した。PCRプライマーの設計は(2)で得られた4500塩基対からなるPCR産物の塩基配列を基に行い、センスプライマーは5'-TAAGGTAAAGCAGATGTGCCATT-3' (配列番号7)の配列を有するオリゴDNAを、アンチセンスプライマーは5'-TTACTCGTACACCGCCTC-3' (配列番号8)の配列を有するオリゴDNAをそれぞれ合成した。(2)で得られた4500塩基対からなるPCR産物を鋳型として、合成したPCRプライマーを用いてPCR法による増幅を行い、2325塩基対からなるPCR産物を取得した。ここで得られたPCR産物を平滑末端化、リン酸化した。
制限酵素EcoRVで消化後に脱リン酸化したpBluescriptII KS(+)ベクターに、上記で得られた平滑末端化、リン酸化したPCR産物を連結し、新たなプラスミドベクターpBlue/agaAを構築した。このプラスミドベクターには大腸菌中で外来遺伝子として連結された遺伝子を効率的に転写できるlacプロモーターが導入されており、α−ガラクトシダーゼを効率的に発現・製造させることができる。得られたプラスミドベクターを、塩化カルシウム法で調製した大腸菌JM109株のコンピテントセルにヒートショック法で形質転換し、組換え微生物を作製した。
(4)で作製した組換え大腸菌JM109−pBlue/agaAを100mg/Lのアンピシリンを含む30mLのLB培地で37℃で24時間、振盪培養した。培養後、組換え大腸菌を遠心分離して回収した。菌体は100mM酢酸ナトリウム緩衝液(pH5.0)で洗浄後、同緩衝液に再懸濁し、超音波破砕機で破砕した。この破砕液のα−ガラクトシダーゼ活性を、前記の方法で測定したところ、19.9U/培養液(mL)であった。
実施例4記載の組換え体を培養して得られたα−ガラクトシダーゼ1.0Uを分取し、1.5mL容ポリプロピレン製チューブに入れた200μLの糖液(pH5.0の100mM酢酸ナトリウム緩衝液にスクロース73%、ガラクトース12%を含む)に添加、混合し、60℃、1,200rpmで反応を行った。反応開始から16時間後に反応液のうち20μLを採取し、480μL蒸留水で希釈を行った後、99℃で10分間処理することで酵素を熱失活させた。熱失活後の希釈糖液を常温に戻した後、「Hypercarb」(Thermoelectron社製)カラムを用いた高速液体クロマトグラフィーで分析を行った。その結果を図7に示す。生成オリゴ糖中のラフィノース含有率は82%であり、反応液中のラフィノース濃度は1.20重量%であった。
Bacillus coagulans AKC-004株(受託番号FERM P−21092(FERM−ABP10948に移管):寄託機関; 独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター)をTBAB(Tryptose Blood Agar Base)プレート (Difco)で、55℃、1日間培養してコロニーを形成させる。その1白金耳を表1に記載の培地30mLを150mL容三角フラスコに分注したものに接種して、55℃、150rpmで2日間培養した。
Bacillus coagulans AKC-003株(受託番号FERM P−21091:寄託機関; 独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター)をTBAB(Tryptose Blood Agar Base)プレート (Difco)で、55℃、1日間培養してコロニーを形成させる。その1白金耳を表1に記載の培地30mLを150mL容三角フラスコに分注したものに接種して、55℃、150rpmで2日間培養した。
Bacillus coagulans AKC-005株(受託番号FERM P−21093:寄託機関; 独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター)をTBAB(Tryptose Blood Agar Base)プレート (Difco)で、55℃、1日間培養してコロニーを形成させる。その1白金耳を表1に記載の培地30mLを150mL容三角フラスコに分注したものに接種して、55℃、150rpmで2日間培養した。
Bacillus coagulans AKC-006株(受託番号FERM P−21094:寄託機関; 独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター)をTBAB(Tryptose Blood Agar Base)プレート (Difco)で、55℃、1日間培養してコロニーを形成させる。その1白金耳を表1に記載の培地30mLを150mL容三角フラスコに分注したものに接種して、55℃、150rpmで2日間培養した。
Claims (20)
- 下記の特性を有するα−ガラクトシダーゼ。
(1)作用:本酵素は、スクロースとガラクトースを原料とした脱水縮合反応において、生成オリゴ糖中のラフィノース含有率が0.5%以上のとき、ラフィノース合成選択率が65%以上という性質を有する。
(2)至適pH範囲:3.5〜5.0
(3)安定pH範囲:3.5〜10.0
(4)分子量:約80,000 - Bacillus coagulansに属する微生物に由来する、請求項1記載のα−ガラクトシダーゼ。
- Bacillus coagulansがBacillus coagulans AKC003株、AKC004株(FERM−ABP10948)、AKC005株、AKC006株のいずれかである請求項2記載のα−ガラクトシダーゼ。
- Bacillus coagulans AKC003株、AKC004株(FERM−ABP10948)、AKC005株、AKC006株のいずれかに属するBacillus coagulansおよびその変異体。
- 下記(a)、(b)又は(c)の何れかのアミノ酸配列からなるα−ガラクトシダーゼ。
(a)配列番号2で表わされるアミノ酸配列;
(b)配列番号2で表されるアミノ酸配列において、1又は数個のアミノ酸が欠失、置換、及び/又は付加されたアミノ酸配列であって、α−ガラクトシダーゼ活性を有するアミノ酸配:
(c)配列番号2に表されるアミノ酸配列に対して60%以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、α−ガラクトシダーゼ活性を有するアミノ酸配列: - 下記(a)、(b)又は(c)の何れかのアミノ酸配列からなるα−ガラクトシダーゼをコードするα−ガラクトシダーゼ遺伝子。
(a)配列番号2で表わされるアミノ酸配列;
(b)配列番号2で表されるアミノ酸配列において、1又は数個のアミノ酸が欠失、置換、及び/又は付加されたアミノ酸配列であって、α−ガラクトシダーゼ活性を有するアミノ酸配:
(c)配列番号2に表されるアミノ酸配列に対して60%以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、α−ガラクトシダーゼ活性を有するアミノ酸配列: - 以下の(a)または(b)の塩基配列からなるα−ガラクトシダーゼ遺伝子。
(a)配列番号1で表される塩基配列;
(b)配列番号1で表される塩基配列において、1又は数個の塩基が欠失、置換、及び/又は付加された塩基配列であって、かつ、α−ガラクトシダーゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列: - 請求項6又は7に記載のα−ガラクトシダーゼ遺伝子を含む組換えベクター。
- 請求項6又は7に記載のα−ガラクトシダーゼ遺伝子又は請求項8に記載の組み換えベクターを導入した形質転換体。
- 請求項9記載の形質転換体を培養して得られるα−ガラクトシダーゼ。
- 請求項1〜3、5、又は10のいずれか一項に記載のα−ガラクトシダーゼを含む酵素組成物。
- α−グルコシダーゼ、β−グルコシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、セルラーゼ、キシラナーゼ、プロテアーゼ、ガラクタナーゼ、アラビナナーゼ、マンナナーゼ、ラムノガラクツロナーゼ、ポリガラクツロナーゼ、ペクチンメチルエステラーゼ、ペクチンリアーゼ、及びポリガラクツロン酸リアーゼから選択される少なくとも1種以上の成分をさらに含有する、請求項11記載の酵素組成物。
- 請求項11又は12のいずれかに記載の酵素組成物を含むラフィノース合成試薬。
- 請求項1〜3、5、又は10のいずれか一項に記載のα−ガラクトシダーゼ、請求項11又は12に記載の酵素組成物、若しくは請求項13に記載のラフィノース合成試薬を用いることを特徴とするラフィノースの製造方法。
- Bacillus coagulansに属する微生物を培養して得た微生物触媒を利用することを特徴とするラフィノースの製造方法。
- Bacillus coagulans AKC003株、AKC004株(FERM−ABP10948)、AKC005株、AKC006株のいずれかに属するBacillus coagulans及び/又はその変異体を培養して得た微生物触媒を利用することを特徴とするラフィノースの製造方法。
- 請求項9に記載の形質転換体を培養して得た微生物触媒を利用することを特徴とするラフィノースの製造方法。
- 生成オリゴ糖中のラフィノース含有率が65%以上である、請求項14〜17のいずれかに記載のラフィノースの製造方法。
- 原料としてスクロース及びガラクト−スを用いる、請求項14〜18のいずれかに記載のラフィノースの製造方法。
- 原料中のスクロース濃度が30%(w/v)〜90%(w/v)であり、原料中のガラクトース濃度が2%(w/v)〜45%(w/v)である、請求項19に記載のラフィノースの製造方法。
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