CN106282142B - 一种β-甘露糖苷酶含量低的α-半乳糖苷酶的制备方法 - Google Patents

一种β-甘露糖苷酶含量低的α-半乳糖苷酶的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种β‑甘露糖苷酶含量低的α‑半乳糖苷酶的制备方法，以里氏木霉为产酶菌株，以半乳甘露低聚糖为碳源，采用发酵法生产β‑甘露糖苷酶的酶活力不高于0.05U/mL的α‑半乳糖苷酶酶液。本发明采用里氏木霉以半乳甘露低聚糖为碳源和诱导物发酵产α‑半乳糖苷酶，在获得较高α‑半乳糖苷酶酶活力的同时，酶液中β‑甘露糖苷酶含量（活力）很低，该酶液无需纯化除去β‑甘露糖苷酶即可直接与β‑甘露聚糖酶协同水解半乳甘露聚糖制备小分子半乳甘露聚糖和半乳甘露低聚糖，可有效降低半乳甘露聚糖定向降解制备小分子半乳甘露聚糖和半乳甘露低聚糖的生产成本。

Description

一种β-甘露糖苷酶含量低的α-半乳糖苷酶的制备方法
技术领域
本发明属生物化学中微生物培养技术领域，具体涉及一种β-甘露糖苷酶含量低的α-半乳糖苷酶的制备方法。
背景技术
功能性低聚糖和功能性小分子聚糖因其特殊的生物学功能作为添加剂在功能性性食品、饲料生产中的应用日益受到重视。功能性低聚糖和功能性小分子聚糖的生物学功能主要表现为对人或动物体肠道内双歧杆菌等有益菌的选择性增殖作用、阻断病原菌在消化道中定植和可溶性膳食纤维功能等。通常来说，小分子聚糖的聚合度越低，其生物学功能尤其是对双歧杆菌等有益菌的选择性增殖作用越强，因此，提高小分子聚糖中低聚合度组分和低聚糖的含量是功能性小分子聚糖和功能性低聚糖制备的关键技术之一。
小分子半乳甘露聚糖和半乳甘露低聚糖是来源于田菁、香豆和瓜尔豆等植物中的半乳甘露聚糖的不完全降解产物。半乳甘露聚糖不完全降解制备小分子半乳甘露聚糖和半乳甘露低聚糖的方法包括物理法、化学法和酶法，其中酶法制备技术因具有反应条件温和、反应可控制、副产物少、得率高等优点而成为最有工业应用前景的技术。目前，酶法制备小分子半乳甘露聚糖和半乳甘露低聚糖的方法是采用β-甘露聚糖酶选择性降解半乳甘露聚糖。β-甘露聚糖酶是由β-甘露聚糖酶(也称内切β-甘露聚糖酶)和β-甘露糖苷酶组成的复合酶系，在用于制备小分子半乳甘露聚糖和半乳甘露低聚糖的β-甘露聚糖酶系中，β-甘露糖苷酶的存在将引起降解产物中单糖含量提高和小分子半乳甘露聚糖和半乳甘露低聚糖的得率降低。因此，在β-甘露聚糖酶降解半乳甘露聚糖制备小分子半乳甘露聚糖和半乳甘露低聚糖酶反应体系中，β-甘露糖苷酶的含量(通常用酶活力表示)应尽可能低。
来源于田菁、香豆和瓜尔豆等植物的半乳甘露聚糖是一种高分支度的聚合物，其结构是甘露糖通过β-1,4-糖苷键形成主链，在甘露聚糖主链上通过α-1,6-糖苷键连接有数量不等的半乳糖。例如，来源于田菁种子和瓜尔豆的半乳甘露聚糖分子中，甘露糖和半乳糖分子的比例是1:2，即主链上平均每2个甘露糖分子上连有一个半乳糖分子。在β-甘露聚糖酶降解半乳甘露聚糖过程中，β-甘露聚糖酶只能降解半乳甘露聚糖主链上的β-1,4-糖苷键，而不能降解半乳甘露聚糖主链分子上的甘露糖与支链半乳糖形成的α-1,6-糖苷键，相反，半乳糖支链成为β-甘露聚糖酶降解半乳甘露聚糖的一个障碍，即支链半乳糖对β-甘露聚糖酶的空间位阻效应，从而影响β-甘露聚糖酶对半乳甘露聚糖的降解程度，具体表现为半乳甘露聚糖降解产物中生物活性高的小分子聚糖和半乳甘露低聚糖组分在降解产物中所占的比例不高。
破解β-甘露聚糖酶降解分支度高的半乳甘露聚糖制备小分子半乳甘露聚糖和半乳甘露低聚糖过程中由半乳糖支链对β-甘露聚糖酶形成的空间位阻效应的策略是在β-甘露聚糖酶反应体系中添加适量的α-半乳糖苷酶。α-半乳糖苷酶是一种糖苷水解酶，能够特异性水解半乳甘露聚糖分子中甘露糖和半乳糖之间形成的α-1,6-糖苷键。采用β-甘露聚糖酶和α-半乳糖苷酶协同水解分支度高的半乳甘露聚糖，通过α-半乳糖苷酶对半乳甘露聚糖支链半乳糖的水解，降低了半乳糖支链对β-甘露聚糖酶水解半乳甘露聚糖主链的空间位阻效应，从而提高了β-甘露聚糖酶降解半乳甘露聚糖的程度并使降解产物中低聚合度小分子半乳甘露聚糖和半乳甘露低聚糖组分的含量提高。
α-半乳糖苷酶广泛存在于植物、动物和微生物中，其中微生物发酵法制备α-半乳糖苷酶是有工业应用前景的方法。利用微生物生产α-半乳糖苷酶的方法主要有两种，一是采用基因工程的方法，即通过α-半乳糖苷酶基因的克隆和表达制备α-半乳糖苷酶，但基因工程的方法存在生物安全性等问题，不是应用于食品、饲料添加剂产品制备的最佳方案。另一种α-半乳糖苷酶的制备方法是采用对人体安全的微生物通过发酵法制备α-半乳糖苷酶。里氏木霉(Trichoderma reesei)是一种公认的对人体安全的微生物，在适宜的培养基及培养条件下可合成α-半乳糖苷酶，但里氏木霉也具有合成β-甘露糖苷酶的能力，因此，在以合成用于降解半乳甘露聚糖制备小分子半乳甘露聚糖和半乳甘露低聚糖的α-半乳糖苷酶酶液中，要求酶液中β-甘露糖苷酶的含量(活力)应尽可能低，使发酵获得的酶液无需纯化即可直接用于小分子半乳甘露聚糖和半乳甘露低聚糖的生产，从而进一步降低生产成本。
发明内容
发明目的：针对现有技术存在的不足，本发明的目的是提供一种β-甘露糖苷酶含量低的α-半乳糖苷酶的制备方法，里氏木霉以半乳甘露低聚糖为碳源和诱导物发酵产酶，制备β-甘露糖苷酶含量低的α-半乳糖苷酶酶液。
技术方案：为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：
一种β-甘露糖苷酶含量低的α-半乳糖苷酶的制备方法，以里氏木霉为产酶菌株，以半乳甘露低聚糖为碳源，采用发酵法生产β-甘露糖苷酶的酶活力不高于0.05U/mL的α-半乳糖苷酶酶液。
所述的半乳甘露低聚糖是半乳甘露聚糖经β-甘露聚糖酶酶解、固液分离后，酶解清液用无水乙醇在体系乙醇浓度65％下沉淀、固液分离获得的清液中除去单糖而获得。
所述的半乳甘露低聚糖酶水解液经乙醇沉淀、固液分离后的清液，采用酿酒酵母发酵法除去其中单糖。
所述的半乳甘露低聚糖是田菁种子、香豆、瓜尔豆等植物中半乳甘露聚糖的不完全降解产物。
里氏木霉产酶培养基中含5-30g/L半乳甘露低聚糖、氮源、营养盐、微量元素、缓冲液和吐温80，里氏木霉在上述培养基中于28-30℃，170r/min条件下培养4-5d。
有益效果：与现有技术相比，本发明采用里氏木霉以半乳甘露低聚糖为碳源和诱导物发酵产α-半乳糖苷酶，在获得较高α-半乳糖苷酶酶活力的同时，酶液中β-甘露糖苷酶含量(活力)很低，该酶液无需纯化除去β-甘露糖苷酶即可直接与β-甘露聚糖酶协同水解半乳甘露聚糖制备小分子半乳甘露聚糖和半乳甘露低聚糖，可有效降低半乳甘露聚糖定向降解制备小分子半乳甘露聚糖和半乳甘露低聚糖的生产成本。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
以下实施例中，半乳甘露低聚糖和不同分子量区间的小分子半乳甘露聚糖的平均分子量采用凝胶渗透色谱法(GPC)测定。色谱条件如下：色谱仪：安捷伦高效液相色谱仪1260，色谱柱：Waters Ultrahydrogel TM 2000(7.8×300mm)、Waters Ultrahydrogel TM250(7.8×300mm)和Waters Ultrahydrogel TM 120(7.8×300mm)三柱依次串联，保护柱：Waters Ultrahydrogel TM Guard Column(6×40mm)，检测器：示差检测器，流动相：水，流动相流速：0.60mL/min，柱温：65℃，进样体积：10.0μL，采用聚乙二醇作为标准样品进行分子量测定。
以下实施例中，α-半乳糖苷酶活力测定方法：在15mL试管中加入0.9mL2mmol/L对硝基苯基-α-D-半乳糖苷(pNPG)溶液和0.1mL适当稀释的酶液(50℃预热5min)，于50℃反应10min，立即加入2.0mL 1mol/L Na2CO3溶液终止反应，加入10mL蒸馏水，摇匀。在400nm下测定吸光度A。以蒸馏水作空白对照。
以每分钟水解pNPG释放1μmol对硝基苯酚所需的酶量定义为1个α-半乳糖苷酶活力单位(U)。α-半乳糖苷酶活力计算公式如下：
以下实施例中，β-甘露糖苷酶活力测定方法：在15mL试管中加入0.9mL2mmol/L对硝基苯基-β-D-甘露糖苷(pNPM)溶液和0.1mL适当稀释的酶液(50℃预热5min)，于50℃反应10min，立即加入2.0mL 1mol/L Na2CO3溶液终止反应，加入10mL蒸馏水，摇匀。在400nm下测定吸光度A。以蒸馏水作空白对照。
以每分钟水解pNPM释放1μmol对硝基苯酚所需的酶量定义为1个β-甘露糖苷酶活力单位(U)。β-甘露糖苷酶活力计算公式如下：
实施例1
半乳甘露低聚糖的制备方法，包括以下步骤：
(1)将粉碎至20-100目的田菁种子加入到酶解瓶中，按酶用量20U/g半乳甘露聚糖加入β-甘露聚糖酶，加入1M柠檬酸缓冲液、蒸馏水，充分混合，使反应体系中半乳甘露聚糖浓度为20g/L、初始pH值为4.80，置于50℃、150转/分恒温摇床中酶水解12h，酶水解反应结束后，反应物于100℃下处理10min，于10,000转/分下离心10min，上清液即为含半乳甘露低聚糖的酶水解清液。
(2)取步骤(1)得到的含半乳甘露低聚糖的酶水解清液，在搅拌条件下加入无水乙醇，使体系中乙醇浓度为65％(v/v)，于10000转/分条件下离心10min，得到上清液和沉淀。
(3)取步骤(2)的离心上清液，于70℃、160mbar下减压旋转蒸发除去其中的乙醇，在除去乙醇的上清液中加入10g/L酿酒酵母发酵12h，完全除去其中的单糖，10000转/分条件下离心10min，固液分离获得二次上清液。二次上清液于70℃、160mbar下减压旋转蒸发、干燥后获得固形物，即为半乳甘露低聚糖。
采用凝胶渗透色谱法(GPC)测定半乳甘露低聚糖的平均分子量，结果表明，半乳甘露低聚糖的平均分子量为910Da。
实施例2
里氏木霉以半乳甘露低聚糖为碳源发酵产酶，包括以下步骤：
(1)产酶培养基(g/L)：半乳甘露低聚糖10.0(实施例1制备)，葡萄糖1.0，磷酸二氢钾2.0，七水硫酸镁0.08，七水硫酸亚铁0.005，一水硫酸锰0.0016，七水硫酸锌0.0014，氯化钴0.0037。培养基用1M柠檬酸缓冲液调节pH值为4.8。
(2)发酵产酶
50mL培养基置于250mL带棉塞的三角瓶中，按10％的接种量接入里氏木霉种子，置于28-30℃、170转/分的恒温摇床中培养4天。培养结束后，培养液于3000转/分下离心10min。取上清液分别测定α-半乳糖苷酶活力和β-甘露糖苷酶活力。
结果表明，里氏木霉以半乳甘露低聚糖为碳源发酵合成α-半乳糖苷酶，α-半乳糖苷酶活力为2.45U/mL，产酶液中β-甘露糖苷酶活力很低，仅为0.02U/mL。
比较例1
里氏木霉以半乳甘露聚糖为碳源发酵产酶，包括以下步骤：
1)半乳甘露聚糖的提取：粉碎至20-100目的田菁种子，按1:50固液比加入蒸馏水，于50℃抽提24h后，于10000转/分条件下离心10min，获得上清液，向上清液中加入无水乙醇得到沉淀，沉淀物经真空干燥得到半乳甘露聚糖粉状固体。
2)里氏木霉以半乳甘露聚糖为碳源发酵产酶
产酶培养基同实施例2，其中用半乳甘露聚糖替换半乳甘露低聚糖，半乳甘露聚糖由步骤1)制备获得。
发酵产酶方法同实施例2。
结果表明，里氏木霉以半乳甘露聚糖为碳源发酵合成α-半乳糖苷酶，α-半乳糖苷酶活力为0.12U/mL，低于里氏木霉以半乳甘露低聚糖为碳源发酵合成的α-半乳糖苷酶活力；产酶液中β-甘露糖苷酶活力为0.45U/mL，高于里氏木霉以半乳甘露低聚糖为碳源发酵合成的β-甘露糖苷酶活力。
比较例2
里氏木霉以不同分子量区间的小分子半乳甘露聚糖为碳源发酵产酶，包括以下步骤：
1、不同分子量区间的小分子半乳甘露聚糖的制备：
1)将粉碎至20-100目的田菁种子加入到酶解瓶中，按酶用量20U/g半乳甘露聚糖加入β-甘露聚糖酶液，加入1M柠檬酸缓冲液、蒸馏水，充分混合，使反应体系中半乳甘露聚糖浓度为20g/L、初始pH值为4.80，置于50℃、150转/分恒温摇床中酶水解12h，酶水解反应结束后，反应物于100℃下处理10min，于10,000转/分下离心10min，上清液即为含小分子半乳甘露聚糖和半乳甘露低聚糖的酶水解清液。
2)取步骤1)得到的酶水解清液，在搅拌条件下加入无水乙醇，使体系中乙醇浓度为40％(v/v)，于10000转/分条件下离心10min，得到上清液和沉淀。沉淀用与酶水解清液同体积的40％(v/v)的乙醇水溶液分3次洗涤、离心(10000转/分、10min)，冷冻干燥得到组分I，采用凝胶色谱法测定小分子半乳甘露聚糖组分I的分子量。上清液继续用于下一级的分级分离。
3)取步骤2)固液分离后的上清液，在搅拌条件下加入无水乙醇，使体系中乙醇浓度为50％(v/v)，于10000转/分条件下离心10min，得到上清液和沉淀。沉淀用与酶水解清液同体积的50％(v/v)的乙醇水溶液分3次洗涤、离心(10000转/分、10min)，冷冻干燥得到组分II，采用凝胶色谱法测定小分子半乳甘露聚糖组分II的分子量。上清液继续用于下一级的分级分离。
4)取步骤3)固液分离后的上清液，在搅拌条件下加入无水乙醇，使体系中乙醇浓度为65％(v/v)，于10000转/分条件下离心10min，得到上清液和沉淀。沉淀用与酶水解清液同体积的65％(v/v)的乙醇水溶液分3次洗涤、离心(10000转/分、10min)，冷冻干燥得到组分III，采用凝胶色谱法测定小分子半乳甘露聚糖组分III的分子量。
结果表明，田菁半乳甘露聚糖经β-甘露聚糖酶水解，可得到不同分子量区间的小分子半乳甘露聚糖，采用乙醇分级沉淀法可获得不同分子量区间的小分子半乳甘露聚糖。分级得到的小分子半乳甘露聚糖组分的平均分子量分别为：组分I：12000Da，组分II：5560Da，组分III：4380Da。
2、里氏木霉分别以不同分子量区间的小分子半乳甘露聚糖为碳源发酵产酶
1)产酶培养基(g/L)：小分子半乳甘露聚糖(组分I/组分II/组分III)10.0，葡萄糖1.0，磷酸二氢钾2.0，七水硫酸镁0.08，七水硫酸亚铁0.005，一水硫酸锰0.0016，七水硫酸锌0.0014，氯化钴0.0037。培养基用1M柠檬酸缓冲液调节pH值为4.8。
2)发酵产酶
50mL培养基置于250mL带棉塞的三角瓶中，按10％的接种量接入里氏木霉种子，置于28-30℃、170转/分的恒温摇床中培养4天。培养结束后，培养液于3000转/分下离心10min。取上清液分别测定α-半乳糖苷酶活力和β-甘露糖苷酶活力。
产酶结果如表1。
表1不同分子量的小分子半乳甘露聚糖为碳源产酶对酶活力的影响
碳源 平均分子量(Da) α-半乳糖苷酶(U/mL) β-甘露糖苷酶活力(U/mL)
组分I 12000 0.49 0.31
组分II 5560 0.85 0.22
组分III 4380 1.22 0.11
结果表明，里氏木霉以半乳甘露聚糖降解后得到的不同分子量区间的小分子半乳甘露聚糖为碳源产酶，半乳甘露聚糖分子量(聚合度)对酶中的α-半乳糖苷酶活力和β-甘露糖苷酶活力均有重要的影响。结合比较例1、比较例2和实施例2可知，里氏木霉以平均分子量为910Da以下的半乳甘露低聚糖为碳源产酶，效果最佳。

Claims (4)

1.一种β-甘露糖苷酶含量低的α-半乳糖苷酶的制备方法，其特征在于，以里氏木霉为产酶菌株，以半乳甘露低聚糖为碳源，采用发酵法生产β-甘露糖苷酶的酶活力不高于0.05U/mL的α-半乳糖苷酶酶液；其中，所述的半乳甘露低聚糖是由田菁种子中的半乳甘露聚糖经β-甘露聚糖酶不完全降解得到的平均分子量为910Da的半乳甘露低聚糖。
2.根据权利要求1所述的β-甘露糖苷酶含量低的α-半乳糖苷酶的制备方法，其特征在于，所述的半乳甘露低聚糖是田菁种子中的半乳甘露聚糖经β-甘露聚糖酶酶解、固液分离后，酶解清液用无水乙醇在体系乙醇浓度65％下沉淀、固液分离获得的清液中除去单糖而获得。
3.根据权利要求2所述的β-甘露糖苷酶含量低的α-半乳糖苷酶的制备方法，其特征在于，所述的半乳甘露低聚糖酶水解液经乙醇沉淀、固液分离后的清液，采用酿酒酵母发酵法除去其中单糖。
4.根据权利要求1所述的β-甘露糖苷酶含量低的α-半乳糖苷酶的制备方法，其特征在于，里氏木霉产酶培养基中含5-30g/L半乳甘露低聚糖、氮源、营养盐、微量元素、缓冲液和吐温80，里氏木霉在上述培养基中于28-30℃，170r/min条件下培养4-5d。
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