KR101206006B1 - 한천분해활성을 갖는 플라메오비르가 속 균주 및 상기 균주를 이용한 한천올리고당의 제조방법 - Google Patents

한천분해활성을 갖는 플라메오비르가 속 균주 및 상기 균주를 이용한 한천올리고당의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 한천분해활성을 갖는 플라메오비르가 속(Flammeovirga sp.) 균주, 상기 선별된 플라메오비르가 속 균주로부터 제조한 한천분해활성을 갖는 생촉매 및 상기 플라메오비르가 속 균주를 이용하여 한천올리고당을 제조하는 방법에 관한 것으로, 특히 상기 플라메오비르가 속 균주의 한천분해효소는 한천분해활성이 뛰어난 베타-아가라제(β-agarase)이므로, 상기 플라메오비르가 속 균주 및 상기 생촉매를 이용할 경우 한천으로부터 다양한 기능성 한천올리고당을 생산할 수 있어 산업적으로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

한천분해활성을 갖는 플라메오비르가 속 균주 및 상기 균주를 이용한 한천올리고당의 제조방법{STRAIN OF FLAMMEOVIRGA SP. HAVING A AGAR-DECOMPOSITION ACTIVITY AND METHOD OF PRODUCING AGAROOLIGOSACCHARIDES USING THE SAME}
본 발명은 한천분해활성을 갖는 플라메오비르가 속(Flammeovirga sp.) 균주 및 상기 플라메오비르가 속 균주를 이용하여 한천올리고당을 제조하는 방법에 관한 것이다.
한천(agar)은 홍조류의 세포벽 구성성분인 점질성의 난소화성 복합다당류로서, 일종의 식이섬유원이다. 보다 상세하게는, 한천은 갈락토스(galactose)와 갈락토피라노스(galactopyranose)로 구성된 중합체로, 아가로스(agarose)와 아가로펙틴(agaroection)으로 구성되어 있는 복합다당류이다(Duckworth, M. and W. Yaphe., Carbo . Res . 16, 189-197(1971)). 상기 아가로스와 아가로펙틴의 구성비와 관련하여, 한천은 주로 아가로스 70%와 아가로펙틴 30%으로 구성되어 있는 것으로 보고되고 있다. 상기 아가로스는 중성 다당류로서, 알파-D-갈락토스 잔기와 3,6-안하이드로(anhydro)-알파-L-갈락토스 잔기로 구성되며, 이들 잔기가 상호반복하여 직쇄구조를 이루고 있다. 상기 아가로펙틴은 산성 다당류로서, 아가로스에 황산염, 글루콘 산(gluconic acid) 및 파이루베이트(pyruvate)기가 결합된 형태이다. 이 중 황산염과 글루콘 산 잔기의 결합위치는 불분명하나, 파이루베이트 잔기는 D-갈락토스 잔기의 4,6 위치에 결합하여 4,6-o-(1-c-아르복시에틸리딘)-D-갈락토스의 구조를 형성하며, 홍조류에 따라서 아가로스 중의 D-갈락토스 잔기의 일부는 6-O-메틸화되어 있다.
한천은 소화 효소에 의해 분해되기 어려운 다당류이므로 영양원으로 제공되지는 아니하였으나, 오래전부터 젤리 등의 원료 등 식품산업에 사용되었고, 건강에 대한 관심의 고조와 함께 다이어트 식품으로도 이용되고 있다. 또한, 한천은 미생물 고체 배지와 실험실 시약 등 분자생물학 실험의 중요 재료로 이용되고 있다. 구체적으로, 제육가공, 유제품 또는 청량음료 제조에서는 안정제로 이용되고, 화장품이나 음식물에서는 겔화제 또는 증점제로 사용되며, 전분노화방지제, 치과인상(dental impression) 재료 또는 사진에멀젼의 콜로이드 방지제로 이용되고, 의약품 원료 등 제약분야에서도 사용되는 등 매우 다양한 산업 분야에서 사용되고 있다.
뿐만 아니라, 한천의 분해산물은 생체에 다양한 기능성을 나타내는 고부가가치 재료로서의 활용 가능성이 높고, 신약개발에도 중요한 것으로 보고되어 있다. 구체적으로, 상기 한천의 분해산물 중 네오아가로올리고당(N대agarooligosaccharides)은 현재까지 세균성장 억제 효과, 전분노화 방지 효과, 대식세포 활성화 효과, 항산화 효과, 항암활성, 피부보습효과 및 피부미백효과가 있는 것으로 보고되어, 항암제, 소염제, 빈혈제, 면역증강제 및 노화방지제 등으로 활용 가능한 것으로 보고되고 있다.
상기한 바와 같이, 신약개발에 활용될 수 있는 등 고부가가치 소재로서의 활용가능성이 높은 한천올리고당은 2 내지 20개의 아가로스와 아가로펙틴 체인으로 이루어진 다당류이다.
상기 한천올리고당의 구조와 관련하여, 아가로스에 갈락토스가 베타-1,4 결합으로 이루어진 단위체를 네오아가로비오스(neoagarobiose)라고 하고, 상기 단위체가 두개 붙어 있는 것을 네오아가로테트라오스(neoagarotetraose)라고 하며, 상기 단위체가 세 개 붙어 있는 것을 네오아가로헥사오스(neoagarohexaose)라 한다.
상기와 같은 기능성을 가진 한천올리고당을 생산하기 위한 한천의 분해 방법은 산가수분해법 및 한천분해효소(agarase)를 이용한 효소가수분해법이 있다.
상기 산가수분해법은 온도에 영향을 받지 않고, 반응속도가 높아 한천올리고당을 대량 생산할 수 있으나, 올리고당의 갈변 문제, 식용가능한 식품 첨가물로서의 부적합성, 분해시 부산물이 다량 생성되는 단점 및 올리고당의 기능성 및 안정성과 관련된 문제가 있어, 산가수분해법에 비하여 효소가수분해법이 유용한 것으로 인식되고 있다.
상기 효소가수분해법에 이용되는 한천분해효소는 알파-아가라제와 베타-아가라제의 2종류의 효소가 보고되어 있는데, 상기 화학식 1의 아가로스의 베타-1,4 결합은 베타-아가라제에 의해 분해되고, 상기 화학식 1의 아가로스의 알파-1,4 결합은 알파-아가라제에 의해 분해되는 것으로 알려져 있다. 상기 종류가 다른 효소의 확인은 동일한 기질에 대한 분해산물의 차이를 확인함으로써 수행할 수 있다. 예를 들어, 네오아가로헥사오스(neoagarohexaose)를 기질로 하여 반응을 시키는 경우, 베타-아가라제에 의해 생산되는 분해산물은 네오아가로테트라오스(neoagarotetraose)와 네오아가로비오스(neoagarobiose)인 반면에 알파-아가로스에 의해 생산되는 분해산물은 아가로펜토스(agaropentose)와 아가로트리오스(agarotriose)이다.
상기 베타-아가라제는 한천을 분해하여 네오아가로올리고당을 생성하는데, 상기 네오아가로올리고당은 세균성장 억제, 전분노화 방지, 대식세포 활성화, 보습효과 그리고 미백효과 등 많은 유용한 기능을 나타내며, 이들을 활용한 제품은 부가가치가 매우 높은 것으로 알려져 왔다. 또한, 한천에서 알파-아가라제를 이용하여 생성된 한천올리고당 역시 항산화 효과와 항암활성 등을 가지는 것으로 알려져 있다.
특히, 아가로스의 베타-1,4 결합을 분해하여 갈락토스로 분해하는 베타-아가라제를 이용한 한천분해 산물인 네오아가로올리고당은 알파-아가라제를 이용한 한천분해 산물인 아가로올리고당 보다 뛰어난 기능성 즉, 보다 우수한 세균성장 억제, 전분노화 방지, 대식세포 활성화, 보습효과 그리고 미백효과 등의 활성을 나타내므로, 이들을 활용하여 제품을 생산하는 경우 부가가치가 매우 높을 것으로 기대되고 있다.
또한, 최근에는 한천을 생산하는 우뭇가사리가 속하는 홍조류의 경우 탄수화물의 구성성분비가 높아 바이오매스 즉, 바이오에탄올 생산에 이용되는 등, 그 이용범위가 더욱 확대되고 있는 실정이다.
우리나라는 3면이 바다이고, 제주도와 남해 해안 일대에서 품질이 우수한 한천이 대량생산되고 있다. 상기한 바와 같이 한천은 우리나라에 풍부한 수산자원 중 하나이기는 하나, 현재 생산된 대부분의 한천을 1차 가공품 형태의 저부가가치 제품형태로 수출하고 있는 실정이다. 따라서 품질이 우수한 국내에서 생산되는 한천의 고부가가치화는 수산 경제 발전을 위해 필수적이라 할 것이다.
이러한 측면에서, 한천의 고부가가치화를 위해서 한천분해활성을 갖는 미생물, 특히 국내의 남해안에서 생육하는 한천분해활성을 갖는 신규한 미생물에 대한 연구의 필요성이 증가되고 있다.
상기 종래기술의 문제점을 해결하기 위하여, 본 발명은 한천분해활성이 있는 신규한 미생물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 종래기술의 문제점을 해결하기 위하여 한천분해활성을 갖는 생촉매(biocatalyst)를 이용한 한천올리고당의 제조방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 한천분해활성을 갖는 플라메오비르가 속 mbrc-1 균주 (Flammeovirga sp. mbrc-1)를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 플라메오비르가 속 mbrc-1 균주 (Flammeovirga sp. mbrc-1), 상기 균주의 배양액 및 상기 배양액의 농축액으로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 한천분해활성을 갖는 생촉매(biocatalyst)를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 한천분해활성을 갖는 생촉매를 한천과 반응시키는 단계를 포함하는 한천올리고당의 제조방법을 제공한다.
본 발명자들은 대한민국 강원도 경포 연안의 해수로부터 분리한 신규한 플라메오비르가 속 균주인 플라메오비르가 속 mbrc-1 균주(Flammeovirga sp. mbrc-1)가 현저하게 우수한 한천분해활성을 가지고, 상기 한천분해활성은 베타-아가라제(β-agarase)와 같이 네오아가로올리고당(neoagarooligosaccharide)을 생산할 수 있는 것임을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
일 측면에서, 본 발명은 한천분해활성을 갖는 플라메오비르가 속 mbrc-1 균주 (Flammeovirga sp. mbrc-1)에 관한 것이다.
상기 플라메오비르가 속 mbrc-1 균주는 대한민국 강원도 경포 연안의 해수에서 분리된 것으로, 한천분해활성이 우수하고, 16S rDNA 염기서열 분석결과 상기 도 2 및 서열번호 3의 서열을 갖는 균주이다. 본 발명의 선별된 균주인 mbrc-1은 도 3에 나타낸 바와 같이, 감마-프로테오박테리아(Gamma-Proteobacteria)인 플라메오비르가 카모가웬시스(Flammeovirga kamogawensis[AB251934])와 99%의 상동성을 나타내고, 플라메오비르가 아레나리아(Flammeovirga arenaria[AB078078])와 95%의 상동성을 나타내어, 플라메오비르가 속(Flammeovirga sp.) 균주와 높은 상동성을 나타내는 것으로 확인되어, 플라메오비르가 속 mbrc-1 균주(Flammeovirga sp. mbrc-1)로 명명하였다.
본 발명의 균주는 플라메오비르가 속 mbrc-1 균주(Flammeovirga sp. mbrc-1)로 명명하였다. 상기 플라메오비르가 속 mbrc-1 균주를 대한민국 서울특별시 서대문구 홍제 1동 361-221번지 유림빌딩에 위치한 한국미생물보존센터에 2010년 12월 16일자로 기탁하여 기탁번호 KCCM 11151P를 부여받았다.
상기 플라메오비르가 속 mbrc-1 균주(KCCM 11151P)는 탄소원 및 에너지원으로 한천을 이용할 수 있는 한천분해효소 생성균주이고, 하기 표 3에 기재된 바와 같이, 특정 당에 대한 당대사능을 가지고, 특정 유기산, 특정 아미노산 및 특정 질소성 염기에 대한 이용능을 가지는 것으로 확인되었다.
상기 플라메오비르가 속 mbrc-1 균주는 통상의 해양 배지, LB 배지 또는 무기염 한천배지에서 배양할 수 있으며, 일 예로 NaCl이 포함된 무기염 한천배지에서 배양할 수 있다. 또한, 한천이 첨가되지 않은 배지 또는 한천이 첨가된 배지에서 배양할 수 있다.
상기 플라메오비르가 속 mbrc-1 균주는 한천분해활성을 가지며, 본 발명의 실시예에 의해 확인된 바와 같이, 약 49 kDa 내지 53 kDa과 약 40 kDa 내지 44 kDa의 크기를 갖는 한천분해효소를 생산할 수 있다. 상기 한천분해효소의 최적반응온도가 45℃이고, 45℃에서의 상기 한천분해효소의 한천분해활성을 100%로 하였을 때, 50℃에서는 상대활성 94%의 활성을 가지고, 55℃에서는 상대활성 88%의 활성을 가지며, 60℃에서도 최대 분해능을 기준으로 76%의 상대활성을 가지는 것으로 확인되어, 상기 한천분해효소는 호열성 효소인 것으로 예상되었다.
또한, 상기 최적반응온도 45℃에서 2시간 이상 처리한 경우에도 상대활성 90%의 활성이 유지되어, 상기 온도에서 장시간 반응을 수행하는 경우에도 한천분해활성이 유지될 수 있는 것으로 확인되었다.
또한, 상기 한천분해효소의 최적반응 pH는 pH 7.0이고, 약산성 내지 약알칼리성의 범위에서 높은 활성을 유지할 수 있다. 구체적으로, 상기 한천분해효소의 최적반응 pH는 pH 7.0이고, pH 7.0에서의 상기 한천분해효소의 한천분해활성을 100%로 하였을 때, pH 5.0 및 pH 6.0에서는 상대활성 85% 이상의 활성을 가지고, pH 8.0에서도 최대 분해능을 기준으로 79%의 상대활성을 가지는 것으로 확인되어, 상기 한천분해효소는 약산성 내지 약알칼리성의 범위에서 모두 높은 효소활성이 유지되는 것으로 확인되었다.
또한, 상기 플라메오비르가 속 mbrc-1 균주가 생산하는 한천분해효소는 바람직하게는 베타-아가라제일 수 있다. 상기 플라메오비르가 속 mbrc-1 균주의 배양액으로부터 수득된 효소액은 한천을 분해하여 네오아가로올리고당, 구체적으로 네오아가로헥사오스(neoagarohexaose), 네오아가로테트라오스(neoagarotetraose) 및 네오아가로비오스(neoagarobiose)를 생산할 수 있고, 시간이 경과함에 따라, 네오아가로헥사오스, 네오아가로테트라오스 및 네오아가로비오스의 순서로 함량이 증가되는 것으로 확인되었다.
또한, 다른 측면에서 본 발명은 한천분해활성을 갖는 생촉매(biocatalyst)에 관한 것이다.
상기 한천분해활성을 갖는 생촉매는 상기 플라메오비르가 속 mbrc-1 균주(KCCM 11151P), 상기 균주의 배양액 및 상기 배양액의 농축액으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 것일 수 있다.
본 발명에 있어서, 생촉매(biocatalyst)란 여러 가지 화학반응 또는 생화학반응에서 촉매의 역할을 하는 미생물 또는 미생물이 분비하는 물질을 포함하는 것일 수 있고, 일 예로 화학반응 또는 생화학반응을 촉매하는 단백질인 효소(enzyme)를 포함하는 것일 수 있다.
상기 균주의 배양액이란 플라메오비르가 속 mbrc-1 균주(KCCM 11151P)를 배양하여 얻어진 배양배지를 의미하며, 상기 균주가 포함되어 있는 배양배지 또는 상기 균체를 제거한(cell-free) 무세포 배양배지일 수 있다. 상기 배양배지이란 미생물이나 동식물의 조직을 배양하기 위하여 배양체가 필요로 하는 영양물질을 주성분으로 포함하거나, 특수한 목적을 위하여 상기 주성분 외에 추가적인 물질을 더욱 포함하는 것을 의미한다. 상기 배양배지는 미생물이나 동식물의 조직을 배양하기 위한 통상의 배지일 수 있으며, 일 예로 무기염 한천배지일 수 있다.
상기 배양액의 농축액이란 상기 균주의 배양액을 통상적인 방법으로 하여 농축한 것을 의미한다.
또한, 본 발명은 상기 한천분해활성을 갖는 생촉매를 이용하여 한천올리고당을 제조하는 제조방법에 관한 것이다.
상기 제조방법은 상기 한천분해활성을 갖는 생촉매를 한천과 반응시키는 단계를 포함하는 것일 수 있다.
상기 한천은 통상의 한천일 수 있고, 상기 한천올리고당은 통상의 한천올리고당일 수 있으며, 바람직하게는 네오아가로헥사오스, 네오아가로비오스 및 네오아가로테트라오스로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상일 수 있고, 더욱 바람직하게는 네오아가로비오스일 수 있다.
상기 제조방법은 10 내지 80℃, 바람직하게는 25 내지 55℃에서 수행할 수 있고, 더욱 바람직하게는 35 내지 55℃에서 수행할 수 있으며, 또한 40℃ 이하의 온도에서는 겔상으로 존재하는 한천의 특성과 상기 플라메오비르가 속 mbrc-1 균주의 한천분해효소의 특성을 고려하여, 40 내지 55℃에서 수행할 수 있다. 또한, 상기 제조방법은 pH 3 내지 pH 9에서 수행할 수 있으며, 상기 플라메오비르가 속 mbrc-1 균주의 한천분해효소의 특성을 고려하여, 바람직하게는 pH 5 내지 pH 8, 더욱 바람직하게는 pH 6.5 내지 pH 7.5에서 수행할 수 있다.
본 발명의 플라메오비르가 속 mbrc-1 균주는 한천이 겔에서 졸로 변화되기 시작하는 40℃ 온도 이상에서 우수한 한천분해활성을 가지고, 한천이 졸 상태인 45℃에서 최대 활성을 보이며, 상기 최적온도에서 2시간 처리한 경우에도 효소활성의 90% 이상이 유지되고, 약산성 내지 약알칼리성의 넓은 pH 범위에서 효소활성이 높게 유지되며, 기존에 보고된 효소와 비교하여 그 한천분해활성이 현저하게 우수할 뿐만 아니라, 한천분해결과 네오아가로올리고당, 구체적으로 네오아가로헥사오스(neoagarohexaose), 네오아가로테트라오스(neoagarotetraose) 및 네오아가로비오스(neoagarobiose)를 생산할 수 있는 것으로 확인되어 알파-아가라제에 비하여 유용한 분해산물을 생산할 수 있는 베타-아가라제로 확인된 한천분해효소를 생산할 수 있는 균주이므로, 새로운 생촉매로서 유용하게 사용되어질 것으로 예상되고, 특히 의약품 및 기능성 식품과 관련된 산업에 크게 기여할 수 있을 것으로 예상된다.
이상 살펴본 바와 같이, 본 발명에 따른 플라메오비르가 속 mbrc-1 균주 KCCM 11151P는 40℃ 이상의 온도에서 졸상으로 존재하는 한천의 특성을 고려할 때, 40℃ 이상에서도 우수한 한천분해활성을 유지할 수 있고, 한천을 원료로 하여 고부가가치 상품인 다양한 한천올리고당을 제조할 수 있을 뿐만 아니라, 상기 균주의 한천분해효소는 산업적으로 부가가치가 높은 네오아가로올리고당을 생산할 수 있는 베타-아가라제에 속하므로, 의약품 및 기능석 식품과 관련된 산업을 포함한 다양한 산업에서 그 산업적 이용가치가 매우 크다고 할 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른, 강원도 강릉 경포대 지역에서 분리된 mbrc-1 균주의 한천분해활성을 상기 균주를 Marine broth 2216 아가 배지에 배양하여 확인한 결과 나타난 한천분해 양상에 관한 사진이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른, 한천 분해 활성이 우수한 것으로 확인된 mbrc-1 균주의 16S rDNA의 염기서열이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른, 한천 분해 활성이 우수한 것으로 확인된 mbrc-1의 16S rDNA의 염기서열을 기초로 한 다른 세균과의 계통발생론적 관계(Phylogenetic tree)를 나타내는 표이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른, 플라메오비르가 속 mbrc-1 균주 (Flammeovirga sp. mbrc-1)가 생산하는 효소 중, 한천분해활성이 있는 효소 즉, 한천분해효소(agarase)를 확인한 지모그람(Zymogram)을 나타낸 사진으로, 상기 도 4에서 M은 마커(molecular markers)를 의미하고, 1은 플라메오비르가 속 mbrc-1 균주가 생산하는 효소의 정제물을 나타낸 것이고, 2는 상기 효소의 정제물의 지모그람을 나타낸다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른, 플라메오비르가 속 mbrc-1 균주의 pH에 따른 한천분해활성을 나타낸 그래프로, 상기 그래프의 아랫축은 pH를 나타내고, 상기 그래프의 윗축은 pH 7에서의 한천분해활성을 100%로 기준하여 나타낸 상대적 활성(Relative activity)을 나타낸다. 도 5a는 각각의 완충용액을 이용하여 pH를 변화시키면서 pH에 따른 한천분해활성을 나타낸 것으로, ●는 20 mM 아세트산 나트륨(sodium acetate)을 이용하여 pH를 조절(pH 3.0 내지 pH 5.0)하였을 때의 한천분해활성을 나타낸 것이고, ■는 20 mM Tris-HCl를 이용하여 pH를 조절(pH 5.0 내지 pH 8.0)하였을 때의 한천분해활성을 나타낸 것이며, ▲는 20 mM TAPS를 이용하여 pH를 조절(pH 8.0 내지 pH 9.0)하였을 때의 한천분해활성을 나타낸 것이고, 도 5b는 20 mM GTA 완충용액(20 mM GTA buffer)을 이용하여 pH를 변화시키면서 pH에 따른 한천분해활성을 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른, 플라메오비르가 속 mbrc-1 균주의 온도에 따른 한천분해활성을 나타낸 그래프로, 상기 그래프의 아랫축은 반응온도를 나타내고, 상기 그래프의 윗축은 45℃에서의 한천분해활성을 100%로 기준하여 나타낸 상대적 활성(Relative activity)를 나타낸다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른, 플라메오비르가 속 mbrc-1 균주의 열안정성을 측정한 그래프로, 상기 그래프의 아랫축은 특정온도에서의 열처리시간(hour)을 나타내고, 상기 그래프의 윗축은 열처리를 하지 않고, 45℃에서 측정된 한천분해활성을 100%로 기준하여 나타낸 상대적 활성(Relative activity)를 나타낸다. 상기 그래프에서 ●는 25℃에서 열처리한 경우를 나타내고, ■는 35℃에서 열처리한 경우를 나타내며, ▲는 45℃에서 열처리한 경우를 나타내고, ○는 55℃에서 열처리한 경우를 나타내며, □는 65℃에서 열처리한 경우를 나타낸다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른, 플라메오비르가 속 mbrc-1 균주에 의해 분해된 한천의 분해산물을 TLC 분석을 통하여 분석한 결과를 나타낸 사진이다. 상기 사진의 아랫축은 반응시간(hour)을 나타내고, 상기 아랫축 및 위측에 표시된 NA2는 네오아가로비오스(neoagarobiose)를 의미하고, NA4는 네오아가로테트라오스(neoagarotetraose)를 의미하며, NA6은 네오아가헥사오스(neoagarohexaose)를 의미하고, Gal은 D-갈락토스(D-galatose)를 의미한다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.
[실시예]
<실시예 1> 한천분해활성을 갖는 해양 미생물의 탐색 및 분리
대한민국 강원도 경포 연안의 해수를 한천분해활성을 갖는 미생물을 분리하기 위한 시료액으로 사용하였다. 한천분해활성을 갖는 해양 미생물의 탐색 및 분리는 2단계로 진행되었다.
상세하게는, 상기 미생물의 탐색 및 분리는 1차로 상기 시료액을 2% NaCl이 첨가된 멸균희석수를 이용하여 연속적으로 희석하였고 원액과 희석수 100 ㎕ 씩을 평판배지위에 도말하여 한천분해활성을 확인하는 것으로 수행하였다. 상기 평판배지는 한천을 유일한 탄소원 및 에너지원으로 한 무기염 한천배지(Park, G. T. et al., J. Life Sci. 15, 884-888(2005))와 일반적인 해양세균 분리 및 증균용 배지로 사용되는 marine broth 2216(Difco, USA)에 한천(agar)을 1.5% 첨가하여 제조한 배지를 이용하였다. 상기 marine broth 2216의 조성은 하기 표 1과 같다.
성분 함량
Bacto peptone 5.00 g
Bacto yeast extract 1.00 g
Fe() citrate 0.10 g
NaCl 19.45 g
MgCl2(dried) 5.90 g
NaSO4 3.24 g
CaCl2 1.80 g
KCl 0.55 g
Na2CO3 0.16 g
KBr 0.08 g
SrCl2 34.00 mg
H3BO3 22.00 mg
Na-silicate 4.00 mg
NaF 2.40 mg
(NH4 )NO3 1.60 mg
NaHPO4 8.00 mg
멸균 증류수 1 L
상기 배지에 시료액을 도말한 후 25℃에서 배양한 후에, 무기염 한천배지를 함몰시키는 균주를 찾는 방법으로 한천을 분해할 수 있는 한천분해 균주를 1차 분리하였다. 상기 1차 분리된 한천분해 균주 중에서 한천분해활성이 높은 균주를 육안으로 선별하였다. 상기 선별된 균주가 배양된 배지의 함몰이 일어난 부위의 균을 백금이를 이용하여 채취한 후에, 상기 무기염 한천배지와 동일한 조성의 배지에 도말하는 것을 수차례 반복하여 상기 균주들을 순수 분리하였다.
상기 미생물의 2차 탐색 및 분리는 상기 분리된 한천분해활성이 높은 균주들을 0.2%(w/v)의 한천을 포함하는 상기 Marine broth 2216(Difco, Detroit, USA) 배지에서 25℃ 및 250 rpm의 조건으로 72시간 동안 배양하여 한천분해활성을 비교하는 방법으로 수행하였다. 상기 한천분해활성의 비교는 평판 배지를 함몰시키는 정도를 기준으로 수행하였고, 상기 한천분해활성의 비교 결과, 다른 균주에 비하여 현저하게 함몰 정도가 우수하여, 가장 분해능이 우수한 것으로 확인된 mbrc-1을 최종적으로 선정하였다. 상기 선정된 mbrc-1 균주가 나타내는 한천분해 양상을 도 1에 나타내었다. 상기 도 1에 나타낸 바와 같이, 상기 mbrc-1 균주에 의해 평판 배지가 함몰된 정도가 현저한 것이 확인되어, 상기 mbrc-1 균주의 한천분해활성이 현저할 것으로 예상되었다.
< 실시예 2> 한천분해활성을 갖는 해양 미생물 mbrc -1의 동정
상기 실시예 1에서 가장 우수한 한천분해활성을 가지는 것으로 최종 선정된 mbrc-1 균주의 동정은 16S rDNA 염기서열 분석을 통하여 수행하였다. 상기 16S rDNA 염기서열 분석은 상기 mbrc-1 균주의 genomic DNA를 추출하여 PCR을 수행하고, 16S rDNA 유전자의 염기서열을 분석하여 수행하였다. 상기 PCR은 GeneAmp PCR System 2400(PerkinElmer Inc., USA)을 사용하여 수행하였다. 또한, 상기 추출한 genomic DNA로부터 16S rDNA 염기서열 분석을 위해 사용한 프라이머 쌍에 대하여 표 2에서 각각 포워드 프라이머(Forward Primer, 27F, 서열번호 1)와 리버스 프라이머(Reverse Primer, 1492R, 서열번호 2)로 나타내었다.
Primers 서열 (5'→3') 서열번호
27F 5'-AGA GTT TGA TCM[M=C:A] TGG CTC AG-3' 1
1492R 5'-TAC GGY[Y=C:T] TAC CTT GTT ACG ACT T-3' 2
상기 PCR 산물의 염기서열을 분석하고자 BigDye terminator cycle sequencing kit과 ABI PRISM 3100 Genetic Analyzer를 사용하였다. 정열간극(alignment gap) 및 염기 위치는 계산에 고려하지 않았다. 16S rDNA 염기서열분석과 관련하여 총 1,335bp 염기서열을 결정하였고, 그 결과로 얻은 염기서열(서열번호 3)을 도 2에 타나내었다.
상기 분석된 mbrc-1 균주의 16S rDNA의 서열을 분석하여 상기 균주를 동정하였다. 보다 구체적으로 상기 결정된 mbrc-1 균주의 16S rDNA의 서열을 GenBank에 등록된 기존 균주에 대한 정보를 대상으로 Blast program을 이용하여 상동성 검색을 실시하였고, 윈도우 버전의 Clustal 프로그램(ClustalX ver. 1.8)을 이용하여 다중염기배열(multiple alignment)을 수행한 후, neighbor-joining method와 bootstrap method(n=1000)로 분석하여 계통분류학적 위치를 파악하였다. 상기 파악된 결과를 바탕으로 계통 발생도(Phylogenetic tree)를 작성하였으며, 그 결과를 도 3에 나타내었다.
상기 도 3에 나타낸 바와 같이, 상기 mbrc-1 균주는 감마-프로테오박테리아(Gamma-proteobacteria)에 속하는 플라메오비르가 카모가웬시스(Flammeovirga kamogawensis[AB251934])와 99%의 가장 높은 상동성을 나타내었고, 플라메오비르가 아레나리아(Flammeovirga arenaria[AB078078])와 95%의 상동성을 나타냈으므로, 상기 mbrc-1 균주는 플라메오비르가 속(Flammeovirga sp.) 균주로 최종 동정되었고, 상기 mbrc-1 균주를 플라메오비르가 속 mbrc-1(Flammeovirga sp. mbrc-1) 균주로 명명하였다.
상기 플라메오비르가 속 mbrc-1 균주는 대한민국 서울특별시 서대문구 홍제 1동 361-221번지 유림빌딩에 위치한 한국미생물보존센터에 2012년 12월 16일자로 기탁하여 기탁번호 KCCM 11151P를 부여받았다.
상기 플라메오비르가 속 mbrc-1 균주의 생화학적 특성을 검토하기 위하여, 상기 균주의 다양한 종류의 탄수화물, 유기산, 아미노산 및 질소성 염기에 대한 이용의 분석을 수행하였다.
보다 구체적으로, 상기 플라메오비르가 속 mbrc-1 균주를 상기 Marine broth 2216(Difco, Detroit, USA) 배지에서 25℃ 및 250 rpm의 조건으로 72시간 동안 배양한 후, 5,000×g 및 4℃의 조건에서 5분간 원심분리를 수행하여 균체를 수집하였다. 상기 균체를 2차 증류수(ddH2O)를 이용하여 3번 세척하고, GN/GP Inoculating Fluid(Peptone, Yeast Extract, Sodium Chloride, Magnesium Chloride, Calcium Chloride)에 현탁시킨 후, GN2 MicroPlate(Biolog Co., USA)와 GP2 MicroPlate(Biolog Co., USA)에 각각 150 ㎕씩 분주하고 25℃의 조건으로 24시간 배양한 후, ELISA reader(Spectra MAX 250, Molecular devices, USA)를 이용하여 각각 540 nm, 580 nm 및 610 nm에서 흡광도를 측정하였다. 상기 측정한 결과를 하기 표 3에 나타내었다. 하기 표 3에 기재된 ‘-’는 이용능이 없는 경우를 의미하고, ‘+’는 이용능이 있는 경우를 의미하며, 상기 ‘+’가 증가하면 이용능이 증가하는 것을 의미한다.
Figure 112010088125919-pat00001
상기 표 3에 나타낸 바와 같이, 상기 플라메오비르가 속 mbrc-1 균주는 특정 당에 대한 당대사능을 가지고, 유기산, 아미노산 및 질소성 염기에 대해서도 그 이용능이 선택적인 것으로 확인되었다.
< 실시예 3> 플라메오비르가 속 mbrc -1 균주가 생산하는 한천분해효소의 확인
플라메오비르가 속 mbrc-1 균주가 생산하는 한천분해활성을 갖는 단백질 즉, 한천분해효소의 효소활성을 확인하기 위하여, 우선 상기 플라메오비르가 속 mbrc-1 균주의 효소를 정제하였다.
보다 구체적으로, 0.2%(w/v) 한천(agar)이 포함된 상기 조성의 Marine broth 2216 배지 50 ml가 들어있는 250 ml 삼각플라스크에 상기 순수 분리한 플라메오비르가 속 mbrc-1 균주를 접종한 후, shaking incubator를 이용하여 25℃ 및 250 rpm의 조건에서 3일 동안 진탕 배양하였다. 상기 진탕 배양한 배양액을 원심분리기를 이용하여 4℃ 및 14,000×g에서 20분간 원심분리한 후, 상기 배양액으로부터 균체를 제거하고 상층액을 수득하였다. 상기 수득한 상층액에 80% 황산암모늄(ammonium sulfate)을 첨가하여 단백질을 침전시킨 후, 침전된 단백질을 50 mM Tris-HCl(pH 7.4) 완충용액에 녹이고, 20 mM Tris-HCl(pH 7.4) 완충용액에 대하여 4℃에서 24시간 투석을 수행하였다. 상기 투석된 단백질을 DEAE Toyopeal 650 column(1.6 x 2.5 cm)에 부착시킨 후 0 M 내지 0.5 M의 NaCl의 농도기울기를 이용하여 부착된 단백질을 용출시켰다. 상기 용출된 단백질 중, 0.1M 내지 0.2M의 분획에서 한천분해활성이 검출되었다.
상기 용출된 단백질 중, 한천분해활성을 나타낸 분획들을 다시 모아서, 20 mM Tris-HCl(pH 7.4) 완충용액에 대하여 4℃에서 24시간 투석을 수행하였다. 상기 투석된 단백질에 황산암모늄(ammonium sulfate)을 30% 포화 농도가 되도록 첨가하고, 다시 Butyl Toyopeal 650 column(1.6 x 2.0 cm)에 부착시킨 후, 0% 내지 20%의 황산암모늄 농도기울기를 이용하여 부착된 단백질을 용출시켰다. 상기 용출된 단백질 중, 한천분해활성이 확인된 분획을 모아서, 다시 20 mM Tris-HCl(pH 7.4) 완충용액에 대하여 4℃에서 24시간 투석을 수행하여, 정제된 효소액으로 사용하였다.
상기 정제된 효소액에서 한천분해활성을 가지는 단백질을 지모그람(Zymogram)을 이용하여 확인하였다.
보다 구체적으로, 상기 정제된 효소액을 최종농도 0.02% 한천(agarose, w/v)이 포함된 12.5% 겔(acrylamide gel)에 전기영동한 후, 상기 겔을 0.1% Triton-X-100을 포함하는 20 mM Tris-HCl(pH 7.4) 완충용액으로 실온에서 20 분간 3회 세척하였다. 상기 세척된 겔(gel)을 새로운 20 mM Tris-HCl(pH 7.4) 완충용액에 넣어 37℃에서 90분간 방치하여 반응 시킨 후, 상기 반응을 수행한 겔에 Lugol's iodine 용액(40 mM KI, 25 mM I)을 뿌려서 한천분해활성을 나타내는 밴드(band)를 확인하였다. 상기 밴드의 분자량을 확인하기 위하여, 상기 Lugol's iodine 용액으로 처리한 겔을 코마시 블루 R-250(Coomassie brilliant blue R-250) 용액으로 염색하여 한천분해활성을 갖는 단백질의 분자량을 확인하였고, 그 결과를 도 4에 나타내었다.
상기 도 4에 나타낸 바와 같이, 한천분해활성을 갖는 밴드들의 위치가 51 kDa와 42 kDa의 위치로 확인되어, 상기 플라메오비르가 속 mbrc-1 균주가 생산하는 한천분해활성을 갖는 단백질의 크기는 51 kDa와 42 kDa의 크기를 갖는 것으로 예상되었다.
< 실시예 4> 플라메오비르가 속 mbrc -1 균주의 한천분해활성의 특징 확인
4-1: 효소활성의 측정
상기 플라메오비르가 속 mbrc-1 균주의 한천분해활성을 확인하기 위하여, 상기 실시예 3에서 제조된 정제된 효소액을 이용하였고, 상기 효소액의 한천분해활성은 한천분해효소의 반응산물인 환원당의 양을 DNS(dinitrosalicylic acid) 방법으로 실시하였다.
보다 구체적으로, 상기 DNA 법을 이용한 한천분해활성의 측정은 다음과 같이 수행한다. 우선, 표준기질은 최종농도 0.2%(w/v)의 한천이 포함된 20 mM Tris-HCl(pH 7.0)을 중탕가열한 후, 45℃까지 냉각한 기질용액을 사용하였다. 최적 반응 온도, 최적 반응 pH 및 열안정성 관련 실험은 상기 표준기질에 pH 및 온도를 조절하여 사용하였다.
우선, 20 mM Tris-HCl(pH 7.0) 완충용액 450 ㎕에 상기 실시예 3에서 제조된 정제된 효소액 50 ㎕를 첨가하고, 상기 표준기질 또는 pH 및 온도를 조절한 기질용액을 1.0 ml을 첨가한 후에, 30분간 반응을 수행하였다. 상기 반응을 수행한 후에, 3.0 ml의 DNS 시약(NaOH 13.2 g, 3,6-dinitrosalicylic acid 7.07 g, Na sulfate 5.53 g, Potassium sodium tartrate 204 g, Phenol 5.07 g / D.W. 100 ml)을 첨가하고, 10분간 끓여 효소반응을 중지시켰다.
상기 효소반응을 중지시킨 반응액을 유수를 이용하여 냉각한 후, UV-spectrophotometer을 이용해 550 nm에서 흡광도를 측정하는 방법으로 한천분해활성을 측정하였다. 상기 한천분해활성과 관련하여, 갈락토스(galactose)를 이용하여 표준적정곡선을 작성하였고, 상기 측정된 결과를 이용하여 하기에서 확인하기 위한 한천분해활성은 1분당 1 μmole의 갈락토스(galactose)를 생산해 낼 수 있는 효소의 양을 1 unit로 정의하여 사용하였다.
4-2: 플라메오비르가 속 mbrc -1 균주의 pH 에 따른 한천분해활성 측정
상기 플라메오비르가 속 mbrc-1 균주의 최적 pH 및 pH에 따른 한천분해활성을 확인하기 위하여, 상기 실시예 3에서 제조된 정제된 효소액을 이용하여 상기 실시예 4-1의 방법으로 pH에 따른 한천분해활성을 측정하였다.
보다 구체적으로, 상기 한천분해활성을 측정하기 위한 기질용액으로는 상기 실시예 4-1의 표준기질에서 20 mM 아세트산 나트륨(sodium acetate) 완충용액(pH 3 내지 pH 5), 20 mM Tris-HCl 완충용액(pH 5 내지 pH 8) 및 20 mM TAPS(3-[tris(hydroxymethyl)methyl amino]-1-propane sulfonic acid) 완충용액(pH 8.0 내지 pH 9)을 적용하여 pH를 조절한 기질용액을 이용하였다. 또한, 상기 완충용액의 종류에 따른 한천분해활성의 변화 정도를 최소화하기 위하여, 광범위한 pH 범위에서 pH 조절이 가능한 완충용액인 20 mM GTA(3,3-dimethyl-glutaric acid, Tris(hydroxymethyl)-aminomethane, 2-amino-2-methyl-1, 3-propanediol)를 이용하여, pH 3 내지 pH 9에서 한천분해활성을 측정하였다.
상기 각각의 완충용액 450 ㎕에 정제된 효소액 50 ㎕을 첨가하고 상기 pH가 조절된 기질용액 1 ml를 넣은 후, 반응수조를 이용하여 45℃를 유지하면서 30분간 반응시켰다. 상기 반응액에 대해 상기 실시예 4-1의 방법으로 한천분해활성을 측정하였다. 상기 한천분해활성을 측정한 결과를 도 5에 나타내었다.
상기 도 5a에 나타낸 바와 같이, 상기 완충용액 및 pH에 따른 한천분해활성은 20 mM Tris-HCl 완충용액에서 pH를 pH 7.0으로 조절한 경우 가장 우수한 것으로 확인되었다. 또한, 20 mM Tris-HCl 완충용액에서 pH를 pH 5.0 및 pH 6.0으로 조절한 경우에도 한천분해활성이 상대활성 기준으로 85% 이상이 유지되는 것으로 확인이 되었고, 20 mM Tris-HCl 완충용액 및 20 mM TAPS 완충용액에서 pH를 pH 8.0으로 조절한 경우에도 한천분해활성이 상대활성 기준으로 79% 정도 유지되는 것으로 확인되었다.
또한, 상기 도 5b에 나타낸 바와 같이, 20mM GTA-HCl 완충용액을 사용하여 pH를 조절하고, 각각의 pH 별 한천분해활성을 비교한 결과에도, pH를 pH 7.0으로 조절한 경우가 가장 높은 활성을 나타내었다.
상기 결과에 따라, 플라메오비르가 속 mbrc-1 균주는 중성(pH 7.0)은 물론 약산성 및 약알카리성의 범위에서도 높은 활성이 유지되어, 플라메오비르가 속 mbrc-1 균주의 pH 적용범위가 넓은 것으로 확인되었다.
4-3: 플라메오비르가 속 mbrc -1 균주의 온도에 따른 한천분해활성 측정
상기 플라메오비르가 속 mbrc-1 균주의 온도에 따른 한천분해활성을 확인하기 위하여, 상기 실시예 3에서 제조된 정제된 효소액을 이용하여 상기 실시예 4-1의 방법으로 온도에 따른 한천분해활성을 측정하였다.
보다 구체적으로, 상기 한천분해활성을 측정하기 위한 기질용액으로는 상기 실시예 4-2에서 활성이 가장 높은 것으로 확인된 20 mM Tris-HCl 완충용액(pH 7)에 0.2%(w/v)의 한천이 포함된 용액을 사용하였고, 중탕가열법으로 가열한 후, 온도를 25℃ 내지 60℃의 범위에서 각 5℃ 범위로 구분된 온도별로 각각 냉각한 후, 반응수조를 이용하여 각 온도를 유지하면서 반응을 수행하였다.
20 mM Tris-HCl 완충용액(pH 7) 450 ㎕에 정제된 효소액 50 ㎕을 첨가하고 온도 및 pH가 조절된 기질용액 1 ml를 첨가한 후, 각각의 온도 즉, 25℃, 35℃, 45℃, 55℃ 및 65℃에서 30분간 반응시켰다. 상기 반응액에 대해 상기 실시예 4-1의 방법으로 한천분해활성을 측정하였다. 상기 한천분해활성을 측정한 결과를 도 6에 나타내었다.
상기 도 6에 나타낸 바와 같이, 45℃의 조건에서 가장 높은 활성을 갖는 것으로 확인되었다. 상기 45℃에서의 한천분해활성을 100%로 하였을 때, 50℃에서 94%의 상대활성이 확인되었고, 55℃에서 88%의 상대활성이 확인되었으며, 60℃에서 76%의 상대활성이 확인되었다.
상기 결과로부터, 플라메오비르가 속 mbrc-1 균주는 한천이 겔에서 졸상태로 전환되는 온도인 40℃ 내지 45℃ 이상의 온도에서도 비교적 높은 한천분해활성이 유지되어, 고온에서 반응을 수행할 수 있는 것으로 확인되었다.
또한, 최적조건의 한천분해활성의 강도에 있어서도, 플라메오비르가 속 mbrc-1 균주는 최고활성이 923 units/l로 확인되어, 기존에 보고된 스핑고모나스 파우시모빌리 AS-1(Sphingomonas paucimobili AS-1)의 114.4 units/l, 탈라소모나스 sp. SL-5(Thalassomonas sp. SL-5)의 363 units/l 및 글라시에콜라 sp. SL-12(Glaciecola sp. SL-12)의 233 units/l 보다 약 2.5 내지 약 8.0배 높은 활성을 나타내어, 한천분해활성의 측면에서도 현저하게 우수한 것으로 확인되었다.
한천분해의 경우 겔상태에 비하여 졸상태에서의 분해가 훨씬 용이하여, 그 분해효율이 높은데, 상기 플라메오비르가 속 mbrc-1 균주는 최적 분해활성 자체도 매우 우수하고, 상기 최적 분해 조건이 한천의 분해가 용이한 졸상태의 온도 즉, 45℃ 이상의 온도이므로, 상기 한천이 졸상태인 온도에서 현저하게 우수한 한천분해활성이 유지되는 플라메오비르가 속 mbrc-1 균주는 효과적인 한천분해공정에 응용할 수 있어서, 산업적으로 그 의미가 매우 클 것으로 예상된다.
4-4: 플라메오비르가 속 mbrc -1 균주의 온도에 열안정성 측정
상기 플라메오비르가 속 mbrc-1 균주가 생산하는 한천분해효소의 열안정성을 확인하기 위하여, 상기 실시예 3에서 제조된 정제된 효소액을 이용하여 상기 실시예 4-1의 방법으로 열처리에 따른 한천분해활성을 측정하였다.
보다 구체적으로, 상기 한천분해활성을 측정하기 위한 기질용액으로는 상기 실시예 4-2에서 활성이 가장 높은 것으로 확인된 20 mM Tris-HCl 완충용액(pH 7)에 0.2%(w/v)의 한천이 포함된 용액을 사용하였고, 상기 용액을 중탕가열법으로 가열한 후, 25℃, 35℃, 45℃, 55℃ 및 65℃의 온도로 각각 냉각한 후, 반응수조를 이용하여 각 온도를 유지하면서 반응을 수행하였다.
상기 정제된 효소액은 각각 25℃, 35℃, 45℃, 55℃ 및 65℃의 온도에서 0분, 30분, 1시간, 1시간 30분 및 2시간 동안 처리하였고, 20 mM Tris-HCl 완충용액(pH 7) 450 ㎕에 상기 각각의 온도 및 시간 조건으로 처리한 효소액 50 ㎕을 첨가하고, 온도 및 pH가 조절된 기질용액 1 ml를 첨가한 후, 각각의 온도 즉, 25℃, 35℃, 45℃, 55℃ 및 65℃에서 반응시켰다. 상기 반응액에 대해 상기 실시예 4-1의 방법으로 한천분해활성을 측정하였다. 상기 한천분해활성을 측정한 결과를 도 7에 나타내었다.
상기 도 7에 나타낸 바와 같이, 45℃의 조건에서 가장 높은 활성을 갖는 것으로 확인된 온도 조건인 45℃에서는 열처리를 2시간까지 처리한 경우에서도 모두 상대활성이 100%로 나타나, 열안정이 있는 것으로 확인되었다. 또한, 상기 55℃에서 30분간 열처리한 경우에도 상대활성이 72%를 나타내는 것으로 확인되었다.
4-5: 플라메오비르가 속 mbrc -1 균주의 기질에 대한 한천분해활성 확인
상기 플라메오비르가 속 mbrc-1 균주의 기질에 대한 한천분해활성 즉, 상기 플라메오비르가 속 mbrc-1 균주가 생산하는 한천분해효소의 종류를 확인하기 위하여, 상기 실시예 3에서 제조된 정제된 효소액을 이용하여 한천분해반응을 수행한 후, 분해결과를 TLC(thin-layer chromatography)로 분석하였다.
보다 구체적으로, 상기 한천분해활성을 측정하기 위한 기질용액으로는 상기 실시예 4-2에서 활성이 가장 높은 것으로 확인된 20 mM Tris-HCl 완충용액(pH 7)에 0.2%(w/v)의 한천이 포함된 용액을 사용하였고, 상기 용액을 중탕가열법으로 가열한 후, 45℃로 냉각한 후, 반응수조를 이용하여 온도를 유지하면서 15시간 동안 반응을 수행하였다. 상기 반응에 따른 한천분해산물은 TLC(Thin-layer chromatography) 분석을 통해 확인하였다.
상기 분해산물의 분석은 상기 반응물인 한천분해산물을 silica gel 60 TLC plate(Merck, Germany)을 이용하여 분석하는 방법으로 수행하였다(Duckworth M and W. Yaphe., Carbohydr . Res . 16, 18-197(1971) 및 Araki, T et al. J. Marine Biotechnol. 6, 193-197(1998)). 상기 분석은 n-butanol/acetic acid/H20를 부피비를 기준으로 2:1:1(n-butanol:acetic acid:H20)로 혼합한 전개액을 이용하여 전개시킨 후에, 10% H2SO4 수용액으로 가시화시켰으며, 표준물질로는 네오아가로헥사오스(Sigma, USA), 네오아가로테트라오스(V-Labs Inc., USA) 및 갈락토스(galactose, ACROS, USA)를 이용하였으며, 상기 TLC 분석에 의한 한천분해양상을 확인한 결과를 도 8에 나타내었다.
한천(agarose)을 기질로 사용하면 β-아가라제(β-agarase)는 네오아가로헥사오스(neoagarohexaose), 네오아가로테트라오스(neoagarotetraose) 및 네오아가로비오스(neoagarobiose)를 생성할 수 있으며, α-아가라제(α-agarase)는 아가로펜토스(agaropentose) 및 아가로트리오스(agarotriose)를 생성할 수 있다.
상기 도 8에 나타낸 바와 같이, 플라메오비르가 속 mbrc-1 균주로부터 수득한 효소액으로 반응시간이 경과함에 따라서 네오아가로테트라오스(neoagarotetraose)와 네오아가로비오스(neoagarobiose)의 농도가 증가하였으며, 네오아가로헥사오스(neoagarohexaose)는 12시간까지 증가(25%)하다가 15시간째부터 감소(13%)하는 양상을 나타내었다. 구체적으로, 0.1시간까지는 분해가 완전히 되지 않아서 네오아가로헥사오스, 네오아가로테트라오스와 네오아가로비오스가 소량 생성되었고, 반응시간이 경과할수록 생성된 네오아가로헥사오스의 농도가 줄어들고 0.5시간부터 네오아가로테트라오스의 농도가 증가되었으며, 네오아가로비오스도 0.1시간에는 소량 생산되었지만 시간이 지나면 지날수록 농도가 증가하였다. 또한, 15시간에는 한천(agarose)이 모두 분해되어 주로 네오아가로비오스(43.5%) 및 네오아가로테트라오스(38%)를 생산하는 것으로 나타났다.
따라서, 상기 결과로부터 플라메오비르가 속 mbrc-1 균주가 생산하는 한천분해효소는 베타-아가라제(β-agarase)에 속하는 것으로 확인되었다.
상기와 같은 결과에 의할 때, 본 발명인 플라메오비르가 속 mbrc-1 균주는 한천이 겔에서 졸상태가 되는 온도인 40℃ 내지 45℃에서 최적 활성을 가지고, 상기 온도에서 2시간 이상 반응시키는 경우에도 효소 활성이 유지되며, 효소활성이 기존에 보고된 다른 균주에 비하여 현저하게 우수할 뿐만 아니라, 상기 플라메오비르가 속 mbrc-1 균주가 갖는 한천분해활성은 베타-아가라제에 속하는 것이므로, 한천 분해산물 중 고부가가치의 기능성 한천올리고당 즉, 항균, 미백, 보습효과 등의 기능성이 우수한 네오아가로올리고당(neoagarooligosaccharides)을 생산할 수 있으므로, 의약품 및 기능성 식품과 관련 산업분야에서 그 가치가 현저하게 높을 것으로 예상된다.
한국미생물보존센터(국외) KCCM11151P 20101216
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Claims (7)

  1. 한천분해활성을 갖는 플라메오비르가 속 mbrc-1 균주 KCCM 11151P (Flammeovirga sp. mbrc-1 KCCM 11151P).
  2. 제1항에 있어서,
    상기 한천분해활성을 갖는 플라메오비르가 속 mbrc-1 균주는 최적반응온도가 45℃이고, 한천을 분해하여 네오아가로올리고당(neoagarooligosaccharides)을 생성할 수 있는 것인 KCCM 11151P (Flammeovirga sp. mbrc-1 KCCM 11151P).
  3. 제2항에 있어서,
    상기 한천분해활성을 갖는 플라메오비르가 속 mbrc-1 균주는 서열번호 3의 염기서열을 갖는 것인 KCCM 11151P (Flammeovirga sp. mbrc-1 KCCM 11151P).
  4. 제1항의 균주, 상기 균주의 배양액 및 상기 배양액의 농축액으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 한천분해활성을 갖는 생촉매(biocatalyst).
  5. 제4항의 한천분해활성을 갖는 생촉매를 한천과 반응시키는 단계를 포함하는 한천올리고당의 제조방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 한천올리고당은 네오아가로비오스, 네오아가로테트라오스 및 네오아가로헥사오스로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는 것인 한천올리고당의 제조방법.
  7. 제5항에 있어서, 상기 생촉매를 한천과 반응시키는 단계는 40 내지 55℃ 및 pH 5 내지 pH 8의 조건에서 반응시키는 것을 특징으로 하는 한천올리고당의 제조방법.
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