KR100794593B1

KR100794593B1 - 한천 분해능을 갖는 탈라소모나스 속 균주 및 상기 균주를 이용한 한천올리고당의 제조방법

Info

Publication number: KR100794593B1
Application number: KR1020060109950A
Authority: KR
Inventors: 이상현; 이동근; 김남영; 장민경
Original assignee: 신라대학교 산학협력단
Priority date: 2006-11-08
Filing date: 2006-11-08
Publication date: 2008-01-17

Abstract

본 발명은 한천 분해능을 갖는 탈라소모나스 속 (Thalassomonas sp.) 균주, 상기 선별된 탈라소모나스 속 균주로부터 제조한 한천 분해능을 갖는 생촉매 및 상기 생촉매를 이용하여 한천올리고당을 제조하는 방법에 관한 것으로 특히, 상기 탈라소모나스 속 균주의 한천분해효소는 베타-아가라제(β-agarase)이므로 상기 탈라소모나스 속 균주를 이용하는 경우 한천으로부터 다양한 기능성 한천올리고당을 생산할 수 있어 산업적으로 유용하게 사용될 수 있을 것으로 예상된다.

한천, 한천올리고당, 아가라제

Description

한천 분해능을 갖는 탈라소모나스 속 균주 및 상기 균주를 이용한 한천올리고당의 제조방법{STRAIN OF THALASSOMONAS SP. HAVING A AGAR-DECOMPOSITION ACTIVITY AND METHOD OF PRODUCING AGAROOLIGOSACCHARIDES USING THE SAME}

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른, 분리된 SL-5 균주의 한천 분해능을 Marine broth 2216 아가 배지의 한천분해 양상으로 나타낸 사진이고,

도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른, 탈라소모나스 속 균주 SL-5의 16S rDNA의 염기서열이며,

도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른, 탈라소모나스 속 균주 SL-5의 16S rDNA의 염기서열을 기초로 한 다른 세균과의 계통발생론적 관계를 나타내는 표이고,

도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른, 한천의 농도와 배양 온도에 따른 탈라소모나스 속 균주 SL-5의 생육정도를 나타낸 그래프이며,

도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른, 한천의 농도와 배양 온도에 따른 탈라소모나스 속 균주 SL-5의 한천 분해능을 나타낸 그래프이고,

도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른, 한천의 농도가 0.2%인 조건에서 탈라소모나스 속 균주 SL-5의 생육정도 및 한천 분해능을 나타낸 그래프이며,

도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른, 탈라소모나스 속 균주 SL-5가 생산하는 생촉매의 온도에 따른 한천 분해능을 나타낸 그래프이고,

도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른, 탈라소모나스 속 균주 SL-5가 생산하는 생촉매를 70℃에 노출시킨 경우, 노출된 시간에 따른 한천 분해능을 나타낸 그래프이며,

도 9는 본 발명의 일 실시예에 따른, 탈라소모나스 속 균주 SL-5가 생산하는 생촉매의 pH에 따른 한천 분해능을 나타낸 그래프이며(●는 100 mM 아세트산 나트륨(sodium acetate) 완충용액의 분해능이고, ○는 20 mM 인산 나트륨(sodium phosphate) 완충용액의 분해능이며, ▲는 50 mM TAPS 완충용액의 분해능이다.),

도 10은 본 발명의 일 실시예에 따른, 탈라소모나스 속 균주 SL-5가 생산하는 생촉매에 의해 분해된 네오아가로헥사오스(neoagarohexaose)의 TLC 분석 결과를 나타낸 것이다.

[산업상 이용분야]

본 발명은 한천 분해능을 갖는 탈라소모나스 속(Thalassomonas sp.) 균주 및 상기 선별된 탈라소모나스 속 균주를 이용하여 한천올리고당을 제조하는 방법에 관한 것이다.

[종래기술]

한천(agar)은 홍조류의 세포벽 구성성분인 점질성의 난소화성 복합다당류로서, 일종의 식이섬유원이다. 보다 상세하게는 한천은 갈락토스(galactose)와 갈락 토피라노스(galactopyranose)의 중합체이며, 아가로스(agarose)와 아가로펙틴(agaroection)으로 구성되어 있는 복합다당류이다[Duckworth, M. and Yaphe, W. Structure of agar. I. Fractionation of a complex mixture of polysaccharides. Carbo. Res. 16, 189-197 (1971)]. 상기 아가로스와 아가로펙틴의 구성비와 관련하여, 한천은 아가로스 70%와 아가로펙틴 30%으로 구성되어 있는 것으로 보고되고 있다. 상기 아가로스는 중성 다당류로서, 알파-D-갈락토스 잔기와 3,6-안하이드로(anhydro)-알파-L-갈락토스 잔기로 구성되며, 이들 잔기가 상호반복하여 직쇄구조를 이루고 있다. 상기 아가로펙틴은 산성 다당류로서, 아가로스에 황산염, 글루콘 산(gluconic acid) 및 파이루베이트(pyruvate) 기가 결합된 형태이다. 이중 황산염과 글루콘 산 잔기의 결합위치는 불분명하나, 파이루베이트 잔기는 D-갈락토스 잔기의 4,6 위치에 결합하여 4,6,-o-(1-c-아르복시에틸리딘)-D-갈락토스의 구조를 형성하며, 홍조류에 따라서 아가로스 중의 D-갈락토스 잔기의 일부는 6-O-메틸화되어 있다.

한천은 소화 효소에 의해 분해되기 어려운 다당류이므로 영양원으로 제공되지는 아니하였으나, 오래전부터 제과분야와 관련하여 젤리 등의 원료로 사용되었으며, 건강에 대한 관심의 고조와 함께 다이어트 식품으로도 이용되고 있다[Do, J.-H. Extraction and purification of agar from Gelidium amansii. J. Korean Fish. Soc. 30, 423-427 (1997)]. 또한, 한천은 미생물 고체 배지와 실험실 시약 등 분자생물학 실험의 중요 재료로 이용되고 있으며, 제육가공에서는 안정제로, 화장품이나 음식물에서는 겔화제로 사용되며, 치과인상(dental impression) 재료, 사진에 멀젼의 콜로이드 방지제로 이용되고, 제약분야에도 사용되는 등 매우 다양한 산업분야에서 사용되고 있다.

또한, 한천의 분해산물은 생체에 다양한 기능성을 나타내는 고부가가치 재료로서의 활용 가능성이 높고, 신약개발에도 중요한 것으로 보고 되고 있다. 특히, 상기 한천의 분해산물 중 한천올리고당(agarooligosaccharides)은 항암제, 소염제, 빈혈제 및 노화방지제 등으로 활용 가능한 것으로 보고되고 있다[Araki, T., Lu, Z. and Morishita, T. Optimization of parameters for isolation of protoplasts from Gracilaria verrucosa (Rhodophyta). J. Marine Biotechnol. 6, 193-197 (1998); Kato, I. Antioxidative and antitumorigenic properties of agaro-oligosaccharide. Bio Industry 17, 13-19 (2000); Ohta, Y., Hatada, Miyazaki, M., Nogi, Y., Ito, S. and Horikoshi, K. Purification and characterization of a novel alpha-agarase from a Thalassomonas sp. Curr. Microiol. 50, 212-216 (2005); Yoshizawa, Y., Ametani, A., Tsunehiro, J., Nomura, K., Itoh, M., Fukui, F. and Kaminogawa, S. Macrophage stimulation activity of the polysaccharide fraction from a marine alga (Porphyra yezoensis): structurefunction relationships and improved solubility. Biosci. Biotechnol. Biochem. 59, 1933-1939 (1995)].

상기 한천올리고당은 2 내지 20개의 아가로스와 아가로펙틴 체인으로 이루어진 다당류로, 다양한 생리작용을 갖는 식품 소재로 연구되고 있다. 상기 한천올리고당의 구조와 관련하여, 하기 화학식 1의 아가로스에 갈락토스가 베타-1,4 결합으 로 이루어진 단위체를 아가로바이오스(agarobiose)라고 하며, 상기 단위체가 두개 붙어 있는 것을 아가로테트라오스(agarotetraose)라고 하고, 상기 단위체가 세 개 붙어 있는 것을 아가로헥사오스(agarohexaose)라 한다.

상기와 같은 기능성을 가진 한천올리고당을 생산하기 위한 한천의 분해 방법은 산가수분해법[Joo, D.-S., Kim, O.-S. Cho, S.-Y. and Cho, C.-H. Preparation condition of agar oligosaccharide with organic acids. J. Korean Fish. Soc. 36, 6-10 (2003)] 및 한천분해효소(agarase)를 이용한 효소가수분해법이 보고 되어 있다.

상기 산가수분해법은 온도에 영향을 받지 않고 한천올리고당을 대량 생산할 수 있으나, 올리고당의 갈변 문제, 식용가능한 식품 첨가물로서의 부적합성, 분해시 부산물이 다량 생성되는 단점 및 올리고당의 기능성 및 안정성과 관련된 문제가 있어, 산가수분해법에 비하여 효소적 방법이 유용한 것으로 인식되고 있다[Sugano, Y., Terada, I., Arita, M., Noma, M. and Matsumoto, T. Purification and characterization of a new agarase from a marine bacterium, Vibrio sp. strain JT0107. Appl. Environ. Microbiol. 59, 1549-1554 (1993)]. 따라서, 상기 효소가수분해법에 이용하기 위한 한천분해효소 생성균주를 찾기 위한 여러 연구가 진행되어 왔다[Allouch, J., Jam, M., Helbert, W., Barbeyron, T., Kloareg, B., Henrissat, B. and Czjzek, M. The three-dimensional structures of two β-agarases. J. Biol . Chem . 278, 47171-47180 (2003); Vera, J., Alvarez, R., Murano, E., Slebe, J. C. and Leon, O. Identification of a marine agarolytic Pseudoalteromonas isolate and characterization of its extracellular agarase. Appl. Environ. Microbiol. 64, 4378-4383 (1998); Zhong, Z., Toukdarian, A., Helinski, D., Knauf, V., Sykes, S., Wilkinson, J. E., O'Bryne, C., Shea, T., DeLoughery, C. and Caspi, R. Sequence analysis of a 101-kilobase plasmid required for agar degradation by a Microscilla isolate. Appl. Environ. Microbiol. 67, 5771-5779 (2001)].

상기 한천분해효소는 알파-아가라제와 베타-아가라제의 2종류가 있는데, 상기 화학식 1의 아가로스의 베타-1,4 결합은 베타-아가라제(agarase)에 의해 갈락토스로 분해되고, 상기 화학식 1의 아가로스의 알파-1,4 결합은 알파-아가라제에 의해 분해되는 것으로 알려져 있다. 상기 종류가 다른 효소의 확인은 동일한 기질에 대한 분해산물의 차이를 확인함으로써 수행할 수 있다. 예를 들어, 네오아가로헥사오스(neoagarohexaose)를 기질로 하여 반응을 시키는 경우, 베타-아가로스에 의해 생산되는 분해산물은 네오아가로테트라오스(neoagarotetraose)와 네오아가로바 이오스(neoagarobiose)인 반면에 알파-아가로스에 의해 생산되는 분해산물은 아가로펜토스(agaropentose)와 아가로트리오스(agarotriose)이다.

상기 베타-아가라제는 한천을 분해하여 네오아가로올리고사카라이드(neoagarooligosaccharide)를 생성하는데, 상기 네오아가로올리고사카라이드는 세균성장 억제, 전분노화 방지, 대식세포 활성화, 보습효과 그리고 미백효과 등 많은 유용한 기능을 나타내며 이들을 활용한 제품은 부가가치가 매우 높은 것으로 알려져 왔다[Araki, T., Lu, Z. and Morishita, T. Optimization of parameters for isolation of protoplasts from Gracilaria verrucosa (Rhodophyta). J. Marine Biotechnol. 6, 193-197 (1998); Yoshizawa, Y., Ametani, A., Tsunehiro, J., Nomura, K., Itoh, M., Fukui, F. and Kaminogawa, S. Macrophage stimulation activity of the polysaccharide fraction from a marine alga (Porphyra yezoensis): structurefunction relationships and improved solubility. Biosci. Biotechnol. Biochem. 59, 1933-1939 (1995)]. 또한 한천에서 알파-아가라제를 이용하여 생성된 한천올리고당 역시 항산화 효과와 항암활성 등을 가지는 것으로 알려져 있다[Ohta, Y., Hatada, Y., Miyazaki, M., Nogi, Y., Ito, S. and Horikoshi, K. Purification and characterization of a novel alpha-agarase from a Thalassomonas sp. Curr. Microiol. 50, 212-216 (2005)].

국내에서 한천은 제주도 및 남해안 일대에서 대량 생산되고 있으며 품질도 우수한 것으로 알려져 있으나, 생산된 대부분의 한천을 1차 가공품 형태의 저부가가치 제품형태로 수출하고 있는 실정이다. 따라서 품질이 우수한 국내에서 생산되 는 한천의 고부가가치화는 수산 경제 발전을 위해 필수적이라 할 것이다.

한천의 고부가가치화를 위해서 한천 분해능을 갖는 미생물, 특히 국내의 남해안에서 생육하는 한천 분해능을 갖는 미생물의 제공이 요구되고 있다.

상기 종래기술의 요구를 해결하기 위하여, 본 발명은 한천 분해능이 있는 신규한 미생물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한 본 발명은 한천 분해능을 갖는 생촉매(biocatalyst)를 이용한 한천올리고당의 제조방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 한천 분해능을 갖는 탈라소모나스 속 균주 SL-5(Thalassomonas sp. SL-5)를 제공한다.

또한 본 발명은 상기 탈라소모나스 속 균주 SL-5(Thalassomonas sp. SL-5), 상기 균주의 배양액 및 상기 배양액의 농축액으로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 한천 분해능을 갖는 생촉매(biocatalyst)를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 한천 분해능을 갖는 생촉매를 한천과 반응시키는 단계를 포함하는 한천올리고당의 제조방법을 제공한다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명자들은 경북 포항 연안의 해수로부터 분리한 신규한 탈라소모나스 속 균주인 탈라소모나스 속 균주 SL-5(Thalassomonas sp. SL-5)가 우수한 한천 분해능을 갖는 것을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 일예에서, 본 발명에 따른 한천 분해능을 갖는 균주 탐색은 2단계로 진행되었다. 상세하게는, 상기 균주 탐색은 1차로 대한민국 남해안 연안 해역에서 얻은 시료로부터 한천 분해능이 있는 균주를 분리하고, 2차로 1차적으로 선별된 균주의 한천분해능을 검토하여 가장 분해능이 우수한 균주를 선별하는 방법으로 수행하였다.

상기의 탐색과정을 통하여, 선별된 균주는 동정결과 탈라소모나스 속인 것으로 확인되었다. 상세하게는 상기 선별된 균주의 16S rDNA 염기서열 분석결과, 본 발명의 선별된 균주인 SL-5은 탈라소모나스 아가리보란스(Thalassomonas agarivorans)와 가장 높은 상동성(96%)을 나타내는 것으로 확인되어 탈라소모나스 속 균주 SL-5(Thalassomonas sp. SL-5)로 명명하였다.

본 발명에 따른 한천 분해능을 갖는 생촉매는 탈라소모나스 속 균주에 관한 것이다. 본 발명의 균주는 탈라소모나스 속 균주 SL-5(Thalassomonas sp. SL-5)로 명명하였다. 상기 탈라소모나스 속 균주 SL-5를 대한민국 서울특별시 서대문구 홍제1동에 위치한 한국미생물보존센터에 2006년 10월 26일자로 기탁하여 기탁번호 KCCM 10790P를 부여받았다.

상기 탈라소모나스 속 균주 SL-5 KCCM 10790P는 탄소원 및 에너지원으로 한천을 이용할 수 있는 한천분해효소 생성균주이며, 생육최적온도는 20 내지 40℃이고, 그람음성의 간균이며 균주의 성장에 NaCl을 필요로 하는 해양성 균주이다.

상기 탈라소모나스 속 균주 SL-5 KCCM 10790P는 통상의 해양 배지, Marine LB 배지 또는 무기염 한천배지에서 배양할 수 있으며, 바람직하게는 무기염 한천배 지에서 배양할 수 있다. 또한, 한천이 첨가되지 않은 배지에서도 배양할 수 있으나, 바람직하게는 한천이 첨가된 배지에서 배양할 수 있다.

상기 탈라소모나스 속 균주 SL-5 KCCM 10790P의 한천분해효소는 성장의존성산물(growth-related product)이다. 도 7에 나타난 바와 같이, 상기 한천분해효소의 최적반응온도는 40℃이며, 상기 한천분해효소는 40℃에서의 한천 분해능을 100%로 하였을 때, 20℃ 및 60℃에서도 80%가 넘는 분해능을 나타내었고, 80℃에서도 최대 분해능의 66%가 유지되는 호열성 효소이나, 도 8에 나타난 바와 같이, 70℃에서 노출된 시간이 길어짐에 따라 분해능이 감소하여 상기 한천분해효소는 내열성 효소는 아니다. 또한, 상기 한천분해효소는 도 9에 나타난 바와 같이, 중성과 약산성 범위에서 높은 활성을 나타내며, 상기 한천분해효소의 최적반응 pH는 pH 7.0이다.

또한, 상기 탈라소모나스 속 균주 SL-5 KCCM 10790P의 한천분해효소는 도 10에 나타난 바와 같이, 베타-아가라제이다.

또한, 본 발명은 상기 탈라소모나스 속 균주 SL-5 KCCM 10790P, 상기 균주의 배양액 및 상기 배양액의 농축액으로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 한천 분해능을 갖는 생촉매(biocatalyst)에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 생촉매(biocatalyst)란 여러 가지 화학반응 또는 생화학반응에서 촉매의 역할을 하는 미생물 또는 미생물이 분비하는 물질을 의미하며, 바람직하게는 화학반응 또는 생화학반응을 촉매하는 단백질인 효소(enzyme)일 수 있다.

상기 균주의 배양액이란 탈라소모나스 속 균주 SL-5 KCCM 10790P를 배양하여 얻어진 배양액을 의미하며, 상기 균주가 포함되어 있는 배양액 또는 상기 균제를 제거한(cell-free) 무세포 배양액일 수 있다. 상기 배양액이란 미생물이나 동식물의 조직을 배양하기 위하여 배양체가 필요로 하는 영양물질을 주성분으로 하고, 다시 특수한 목적을 위한 물질을 넣어 혼합한 것을 의미한다. 상기 배양액은 미생물이나 동식물의 조직을 배양하기 위한 통상의 배지일 수 있으며, 바람직하게는 무기염 한천배지일 수 있다.

상기 배양액의 농축액이란 상기 탈라소모나스 속 균주 SL-5 KCCM 10790P의 배양액을 통상적인 방법으로 하여 농축한 것을 의미한다.

또한, 본 발명은 상기 한천 분해능을 갖는 생촉매를 한천과 반응시키는 단계를 포함하는 한천올리고당의 제조방법에 관한 것으로, 상기 한천올리고당은 통상의 한천올리고당일 수 있으며, 바람직하게는 네오아가로헥사오스, 네오아가로테트라오스 및 네오아가로바이오스로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상일 수 있고, 더욱 바람직하게는 네오아가로바이오스일 수 있다.

상기 제조방법은 20 내지 80℃에서 수행할 수 있고, 바람직하게는 40℃ 이하의 온도에서는 겔상으로 존재하는 한천의 특성과 상기 탈라소모나스 속 균주 SL-5 KCCM 10790P의 한천분해효소의 특성으로 인하여, 30 내지 50℃에서 수행할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 40 내지 50℃에서 수행할 수 있다. 또한, 상기 제조방법은 pH 4.0 내지 pH 7.8에서 수행할 수 있으며, 상기 탈라소모나스 속 균주 SL-5 KCCM 10790P의 한천분해효소의 특성으로 인하여 바람직하게는 pH 5.0 내지 pH 7.0에서 수행할 수 있고, 더욱 바람직하게는 pH 6.0 내지 pH 7.0에서 수행할 수 있다.

본 발명의 균주는 한천이 졸 상으로 존재하는 온도인 40℃ 이상에서 최대 활성을 보이고, 알파-아가라제에 비하여 유용한 분해산물을 생산할 수 있는 베타-아가라제로 확인된 한천분해효소를 생산하여 새로운 생촉매로서 유용하게 사용되어질 것으로 예상되고, 특히 의약품 및 기능성 식품과 관련된 산업에 크게 기여할 수 있을 것으로 예상된다.

이하 본 발명의 실시예를 기재한다. 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

[실시예]

<실시예 1> 한천 분해능을 갖는 해양 미생물의 탐색 및 분리

경북 포항의 호미곶 연안 해수를 한천 분해능을 갖는 미생물을 분리하기 위한 시료액으로 사용하였다. 한천 분해능을 갖는 해양 미생물의 탐색 및 분리는 2단계로 진행되었다.

상세하게는, 상기 미생물의 탐색 및 분리는 1차로 상기 시료액을 2% NaCl이 첨가된 멸균희석수를 이용하여 연속적으로 희석하였고 원액과 희석수 100 ㎕ 씩을 평판배지위에 도말하여 한천 분해능을 확인하는 것으로 수행하였다. 상기 평판배지는 한천을 유일한 탄소원 및 에너지원으로 한 무기염 한천배지(Park, G.-T., Lee, D.-G., Kim, N. Y., Lee, E.-J., Jung, J.-G., Lee, J.-H., Heo M.-S. and S.-H. Lee. Isolation and characterization of a marine bacterium producing thermotolerant agarase. J. Life Sci. 15, 884-888 (2005))와 일반적인 해양세균 분리 및 증균용 배지로 사용되는 marine broth 2216(Difco, Detroit, USA)에 한천(agar)을 1.5% 첨가하여 제조한 배지를 이용하였다. 상기 marine broth 2216의 조성은 하기 표 1과 같다.

성분	함량
Bacto peptone	5.00 g
Bacto yeast extract	1.00 g
Fe(Ⅲ) citrate	0.10 g
NaCl	19.45 g
MgCl₂(dried)	5.90 g
NaSO₄	3.24 g
CaCl₂	1.80 g
KCl	0.55 g
Na₂CO₃	0.16 g
KBr	0.08 g
SrCl₂	34.00 mg
H₃BO₃	22.00 mg
Na-silicate	4.00 mg
NaF	2.40 mg
(NH₄₎NO₃	1.60 mg
NaHPO₄	8.00 mg
멸균 증류수	1,000 ㎖

상기 배지에 시료액을 도말한 후 25℃에서 배양한 후에, 무기염 한천배지를 함몰시키는 균주를 찾는 방법으로 한천을 분해할 수 있는 한천분해 균주 3,200개를 분리하였다. 상기 총 3,200개의 한천분해 균주 중에서 한천 분해능이 높은 균주 10개를 육안으로 선별하였다. 상기 선별된 10개의 균주가 배양된 배지의 함몰이 일어난 부위의 균을 백금이를 이용하여 채취한 후에, 상기 무기염 한천배지와 동일한 조성의 배지에 도말하는 것을 수차례 반복하여 상기 균주들을 순수 분리하였다.

상기 미생물의 2차 탐색 및 분리는 상기 분리된 한천 분해능이 높은 균주들을 0.2%(w/v)의 한천을 포함한 상기 Marine broth 2216(Difco, Detroit, USA) 배지에서 25℃, 250 rpm에서 60시간 진탕 배양하여 한천분해능을 비교하는 방법으로 수행하였다. 상기 한천분해능의 비교는 상기 균주들을 배양한 배양액의 환원당값을 측정하는 방법으로 수행하였다. 상기 한천분해능의 비교 결과, 가장 분해능이 우수한 균주인 SL-5를 최종적으로 선정하였다. 상기 선정된 SL-5 균주가 나타내는 한천분해 양상을 도 1에 나타내었다.

도 1에 나타낸 바와 같이, 상기 SL-5 균주는 상기 marine broth 2216 한천 배지를 함몰시켜 한천 분해능이 있는 것으로 확인되었다. 또한, 상기 분리한 SL-5 균주는 균주의 성장에 NaCl을 필요로 하여 해양성 균주임이 확인되었다.

<실시예 2> 한천 분해능을 갖는 해양 미생물 SL-5의 동정

상기 2차 측정에서 가장 우수한 분해능을 나타내어 최종 선정된 SL-5 균주는 그람염색(Gram stain kit, BD CO., USA) 및 16S rDNA 염기서열분성을 통하여 동정하였다. 16S rDNA 염기서열 분석은 상기 SL-5 균주의 genomic DNA를 추출하여 PCR을 수행하고, 16S rDNA 유전자의 염기서열을 분석하여 수행하였다. 상기 추출한 genomic DNA로부터 16S rDNA 염기서열 분석을 위해 사용한 프라이머 쌍에 대하여 표 2에서 각각 포워드 프라이머(Forward Primer, 27F)와 리버스 프라이머(Reverse Primer, 1492R)로 나타내었다. PCR은 GeneAmp PCR System 2400(PerkinElmer Inc., Melsungen, Germany)을 사용하여 수행하였다.

Primers	서열 (5'→3')	서열번호
27F	5'-AGA GTT TGA TCM[M=C:A] TGG CTC AG-3'	1
1492R	5'-TAC GGY[Y=C:T] TAC CTT GTT ACG ACT T-3'	2

PCR 산물의 염기서열을 분석하고자 BigDye terminator cycle sequencing kit과 ABI PRISM 3100 Genetic Analyzer를 사용하였다. 정열간극(alignment gap)및 염기 위치는 계산에 고려하지 않았다. 16S rDNA 염기서열분석과 관련하여 총 1,422bp 염기서열을 결정하였고, 그 결과로 얻은 염기서열(서열번호 3)을 도 2에 타나내었다.

결정된 SL-5 균주의 16S rDNA의 서열분석은 GenBank에 등록된 정보를 대상으로 Blast program(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/Blast.cgi)에 의해 상동성 검색을 실시하였으며, Clustal 프로그램(Clustal X ver. 1.8)을 이용하여 다중염기배열(multiple alignment)을 수행한 후, neighbor-joining method와 bootstrap method(n=1,000)로 분석하여 계통분류학적 위치를 파악하여 그 결과를 계통 발생도(Phylogenetic tree)로 작성하고 도 3에 나타내었다.

도 3에 나타낸 바와 같이, 분리균주 SL-5는 감마-프로테오박테리아(Gamma-proteobacteria)에 속하고 알파-아가라제를 생산하는 것으로 보고된 탈라소모나스 아가리보란스(Thalassomonas agarivorans, DQ 212914)와 가장 높은 상동성(96%)을 나타내었고, 감마-프로테오박테리아에 속하면서 알파-아가라제를 생산하는 탈라소모나스 속 세균(Thalassomonas sp.)과 콜웰리아 속 세균(Colwellia sp.)과 높은 상동성을 나타내어, SL-5는 탈라소모나스 속 균주(Thalassomonas sp.)로 최종 동정되었으며 탈라소모나스 속 균주 SL-5로 명명하였다.

<실시예 3> 탈라소모나스 속 균주 SL-5의 생육특성 및 한천 분해능 확인

3-1. 탈라소모나스 속 균주 SL-5의 온도 및 한천 함량에 따른 생육특성

탈라소모나스 속 균주 SL-5의 생육특성을 확인하기 위하여, Marine broth 2216 배지 5 ml가 들어있는 50 ml 용량의 실험관에 상기 탈라소모나스 속 균주 SL-5를 접종한 후, shaking incubator를 이용하여 250 rpm에서 3일간 진탕 배양하였다. 상기 균주의 배양은 배지의 온도(27℃ 및 37℃) 및 한천의 농도(0.0% (w/v), 0.1% (w/v), 0.2% (w/v) 및 0.3% (w/v))를 변화시키면서 수행하였다. 상기 균주의 생육특성을 경시적으로 관찰하여 그 결과를 도 4에 나타내었다.

도 4에 나타낸 바와 같이, 배지에 한천을 첨가하지 않아도 세균의 성장이 관찰되었지만, 배지에 한천을 첨가한 것에 비하여 그 성장속도가 매우 느렸다. 한천의 농도가 증가함에 따라 세균의 성장 속도가 증가하였지만, 한천의 농도가 0.2% (w/v)인 경우가 가장 효율적인 것으로 확인되었다.

3-2. 탈라소모나스 속 균주 SL-5의 온도 및 한천 함량에 따른 한천 분해능

상기 실시예 3-1과 동일한 방법으로 배양하면서, 상기 균주의 한천 분해능을 경시적으로 관찰하여 그 결과를 도 5에 나타내었다.

도 5에 나타낸 바와 같이, 한천을 첨가하지 않아도 한천분해효소의 활성이 관찰되기는 하였으나, 한천의 농도가 증가함에 따라 한천 분해능도 증가하는 것이 확인되었다. 한편, 온도에 따른 한천 분해능의 경우 27℃에서 37℃에 비하여 더 높은 것으로 확인되었다.

3-3. 탈라소모나스 속 균주 SL-5의 생육양상에 따른 한천 분해능

탈라소모나스 속 균주 SL-5의 생육양상에 따른 한천 분해능을 확인하기 위하여, 세포농도와 한천 분해능의 관계를 나타내는 한천분해활성/세포농도(unit/1/OD₆₀₀)를 이용하였다. 상기 한천분해활성/세포농도를 얻기 위하여, 0.2% (w/v)의 한천이 첨가된 Marine broth 2216 배지 50 ml가 들어있는 250 ml 용량의 플라스크에 상기 탈라소모나스 속 균주 SL-5를 접종한 후, shaking incubator를 이용하여 27℃ 및 250 rpm에서 진탕 배양하면서 세포농도와 한천 분해능을 경시적으로 측정하였다. 상기 측정된 결과를 도 6에 나타내었다. 도 6에 나타난 바와 같이, 한천 분해능은 세포의 성장기에는 세포 농도에 비례하는 것으로 나타났으며, 또한 세균의 성장 속도가 감소되는 경우에는 한천 분해능이 감소될 수 있음이 확인되었다. 다만, 도 6에 나타난 결과는 실시예 3-2의 경우와 달리 배양 2일째까지 뚜렷한 변화가 나타나지 않았고 이후에도 실시예 3-2의 경우와 차이를 보였으나 이는 배양환경의 차이에 의한 결과로 평가되었다.

따라서 탈라소모나스 속 균주 SL-5이 생산하는 한천분해효소는 성장의존성산물(growth-related product)로 확인되었다.

<실시예 4> 탈라소모나스 속 균주 SL-5가 생산하는 한천분해효소의 특성

4-1. 탈라소모나스 속 균주 SL-5 배양액으로부터의 생촉매액 제조

탈라소모나스 속 균주 SL-5가 생산하는 한천분해효소의 효소활성을 확인하기 위하여, 상기 탈라소모나스 속 균주 SL-5의 배양액으로부터 생촉매액을 제조하였다. 상기 생촉매액은 Marine broth 2216 배지 50 ml가 들어있는 250 ml 삼각플라스크에 순수분리한 탈라소모나스 속 균주 SL-5을 접종한 후, shaking incubator를 이용하여 27℃, 250 rpm에서 3일 동안 진탕 배양하고, 상기 진탕 배양한 배양액을 원심분리기를 이용하여 4 및 12000 X g에서 10분간 원심분리한 후, 상층액을 얻는 방법으로 상기 배양액으로부터 균체를 제거하여 얻었다.

4-2. 탈라소모나스 속 균주 SL-5가 생산하는 한천분해효소의 온도에 따른 한천 분해능 측정

상기 실시예 4-1의 생촉매액을 이용하여, 탈라소모나스 속 균주 SL-5가 생산하는 한천분해효소의 온도에 따른 한천 분해능을 측정하였다. 상기 한천 분해능의 측정은 한천분해효소의 반응산물인 갈락토스(galactose)의 농도 변화를 측정하여 수행하였다.

상기 한천 분해능을 측정하기 위한 표준 기질용액으로는 한천이 0.2% (w/v) 포함되어 있는 20mM 인산완충용액(pH 7.0)을 이용하였다. 상기 온도에 따른 한천 분해능의 측정은 표준 기질용액을 중탕가열한 후, 10℃ 간격으로 80℃에서 20℃까지 냉각하고, 상기 냉각한 각 온도별 표준 기질용액 1.0 ml에 상기 실시예 4-1의 생촉매액 0.5 ml를 첨가하여 30분간 반응시킨 후 한천 분해능을 측정하여 수행하였다.

상기 갈락토스의 농도 변화는 상기 생촉매액으로 반응시킨 기질용액들을 원심분리기를 이용하여 12000rpm 및 4℃에서 10분간 원심분리하여 상등액을 수득하고, 상기 수득한 상등액에 대하여 디니트로살리실릭산(dinitrosalicylic acid, DNS) 방법을 수행하여 측정하였다(Bhat, M. K. and S. Bhat. Celluluso degrading enzymes and their potential industrial application. Biotechnnol. Adv. 15, 583-620(1997)). 상기 DNS 방법은 갈락토스가 디니트로살리실릭산(dinitrosalicylic acid, DNS) 용액에 반응하여 노란색으로 발색된다는 사실을 이용한 것으로, 상세하게는 상기 원심분리하여 수득한 상등액 1ml에 DNS 용액 3 ml를 첨가하고, 항온조를 이용하여 100℃에서 10분 동안 반응시키고, 상기 DNS 용액으로 반응시킨 상등액을 흐르는 물에서 20℃로 냉각시킨 후, 550nm에서 상기 냉각시킨 상등액의 흡광도(UV)를 측정하여 수행하였다. 상기 측정한 흡광도를 정량된 갈락토스의 흡광도를 나타낸 표준 곡선에 대입하여 갈락토스의 농도를 구하였으며, 온도에 따른 한천 분해능은 1분당 1μmole의 갈락토스를 생산해 내는 효소의 양을 1 unit으로 정의하여 상대적인 활성으로 표시하여 그 결과를 도 7에 나타내었다.

도 7에 나타난 바와 같이, 상기 생촉매액의 한천 분해능은 40℃에서 363 units/L로 최고치를 나타냈으며 30℃에서도 유사한 한천 분해능을 나타내었다. 또한 40℃의 반응온도에서 나타난 한천 분해능을 100%로 하였을 때, 50℃에서 91%의 한천 분해능을 나타내었으며, 60℃에서 82%, 70℃에서 78%의 한천 분해능을 나타내었고, 80℃까지 66%의 한천 분해능을 나타내었다.

따라서 상기와 같은 결과를 고려할 때, 탈라소모나스 속 균주 SL-5가 생산하는 한천분해효소는 호열성 효소인 것으로 확인되었다.

4-3. 탈라소모나스 속 균주 SL-5가 생산하는 한천분해효소의 내열성 여부에 대한 확인

상기 실시예 4-1의 생촉매액을 이용하여, 탈라소모나스 속 균주 SL-5가 생산하는 한천분해효소가 내열성인지 여부를 확인하였다.

상기 탈라소모나스 속 균주 SL-5가 생산하는 한천분해효소가 내열성인지 여부의 확인은 상기 실시예 4-1의 생촉매액을 70℃에 시간별로 노출시킨 후, 상기 실시예 4-2의 40℃로 냉각된 표준 기질용액 1.0 ml에 상기 70℃에 시간별로 노출시킨 생촉매액 0.5 ml를 첨가하여 30분간 반응시킨 후 한천 분해능을 측정하여 수행하였다.

상기 한천 분해능의 측정은 한천분해효소의 반응산물인 갈락토스(galactose)의 농도 변화를 측정하여 수행하였으며, 상기 갈락토스의 농도 변화는 상기 실시예4-2의 DNS 방법에 의해 수행하였다. 상기 DNS 방법에 의해 측정한 흡광도를 정량된 갈락토스의 흡광도를 나타낸 표준 곡선에 대입하여 갈락토스의 농도를 구하였으며, 70℃에서 노출하지 않은 생촉매액의 한천 분해능을 100%로 하였을 때 70℃에 노출된 시간별 한천 분해능을 도 8에 나타내었다.

도 8에 나타난 바와 같이, 70℃에 15분간 노출한 경우는 76%의 한천 분해능을 나타내었고, 30분간 노출한 경우는 54%의 한천 분해능을 나타내어 70℃에 노출되는 시간이 증가함에 따라 한천 분해능이 급격하게 떨어지는 것이 확인되었다.

따라서 상기와 같은 결과를 고려할 때, 탈라소모나스 속 균주 SL-5가 생산하는 한천분해효소는 내열성은 가지지는 않는 것으로 확인되었다.

4-4. 탈라소모나스 속 균주 SL-5가 생산하는 한천분해효소의 pH에 따른 한천 분해능 측정

상기 탈라소모나스 속 균주 SL-5가 생산하는 한천분해효소의 최적 pH 및 pH에 따른 한천 분해능을 확인하기 위하여, 실시예 4-1의 생촉매액을 이용하여 탈라소모나스 속 균주 SL-5가 생산하는 한천분해효소의 pH에 따른 한천 분해능을 측정하였다.

상기 한천 분해능을 측정하기 위한 기질용액으로는 100 mM 아세트산 나트륨(sodium acetate) 완충용액, 20 mM 인산 나트륨(sodium phosphate) 완충용액 및 50 mM TAPS 완충용액을 이용하였다. 상기 100 mM 아세트산 나트륨(sodium acetate) 완충용액의 pH 범위는 pH 3.1 내지 4.9이었고, 상기 20 mM 인산 나트륨(sodium phosphate) 완충용액의 pH 범위는 pH 4.4 내지 7.8이었으며, 상기 50 mM TAPS 완충용액의 pH 범위는 pH 7.8 내지 9.0이었다. 상기 한천 분해능의 측정은 상세하게는 한천이 0.2% (w/v) 포함되어 있는 상기 각각의 완충용액을 중탕가열한 후, 40℃까지 냉각하고, 상기 완충용액별로 상기 완충용액 1.0 ml에 상기 실시예 4-1의 생촉매액 0.5 ml를 첨가하여 반응수조를 이용하여 40℃를 유지하면서 30분간 반응시킨 후 한천 분해능을 측정하여 수행하였다.

상기 한천 분해능의 측정은 한천분해효소의 반응산물인 갈락토스(galactose)의 농도 변화를 측정하여 수행하였으며, 상기 갈락토스의 농도 변화는 상기 실시예4-2의 DNS 방법에 의해 수행하였다. 상기 DNS 방법에 의해 측정한 흡광도를 정량된 갈락토스의 흡광도를 나타낸 표준 곡선에 대입하여 갈락토스의 농도를 구하였으며, 사용한 완충용액과 pH 중 최고의 활성을 나타낸 pH 7.0의 20 mM 인산나트륨 완충용액의 한천 분해능을 100%로 하였을 때 각 pH 별 한천 분해능을 도 9에 나타내었다.

도 9에 나타난 바와 같이, 상기 완충용액 및 pH에 따른 한천 분해능은 pH 7.0의 20 mM 인산나트륨 완충용액에서 최고치를 나타내어 상기 탈라소모나스 속 균주 SL-5가 생산하는 한천분해효소의 최적 pH는 7.0인 것으로 확인되었다. 상기 확인된 결과에 의할 때, 탈라소모나스 속 균주 SL-5가 생산하는 한천분해효소의 최적 pH는 바실러스 속 균주 MK03(Bacillus sp. MK03)이 생산하는 한천분해효소의 최적 pH인 pH 6.1 보다는 높고 비브리오 속 균주 JT0107(Vibrio sp. JT0107)의 최적 pH인 pH 8.0, 바실러스 세레우스 ASK 202(Bacillus cereus ASK 202)의 최적 pH인 pH 7.8 및 슈도모나스 속 균주 PT-5(Pseudomonas sp. PT-5)의 최적 pH인 pH 8.5 보다는 낮은 것이었다.

또한 pH 7.0에서 나타난 한천 분해능을 100%로 하였을 때, pH 6.0에서 90%의 한천 분해능을 나타내었고, pH 5.0에서 80%의 한천 분해능을 나타낸 반면, pH 7.8에서는 60% 정도의 한천 분해능을 나타내었다.

따라서 상기와 같은 결과를 고려할 때, 탈라소모나스 속 균주 SL-5가 생산하는 한천분해효소는 중성과 약산성 범위에서 높은 한천 분해능을 나타내는 것으로 확인되었다.

<실시예 5> 탈라소모나스 속 균주 SL-5가 생산하는 효소 종류의 확인

상기 탈라소모나스 속 균주 SL-5가 생산하는 한천분해효소의 종류를 확인하기 위하여, 실시예 4-1의 생촉매액 및 네오아가로헥사오스(neoagarohexaose)를 이용하여 한천분해효소의 분해산물을 TLC 분석을 통해 확인하였다.

상기한 바와 같이, 상기 한천분해효소의 종류를 확인하기 위한 실시예의 기질은 네오아가로헥사오스(Sigma, St. Louis, USA)를 이용하였다. 상기 분해산물의 분석은 상세하게는 네오아가로헥사오스가 0.3mg 포함되어 있는 20mM 인산완충용액(pH 7.0)에 상기 실시예 4-1의 생촉매액 17U(60μl)을 첨가하여 40℃에서 48시간 반응시킨 후에, 상기 반응물을 silica gel 60 TLC plate(Merck, Germany)을 이용하여 분석하는 방법으로 수행하였다(Duckworth M and Yaphe, W. Thin-layer chromatographic analysis of enzymic hydrolysate of agar. J. Chromatogr. 49, 482-487 (1970).); Groleau D and Yaphe, W. Enzymatic hydrolysis of agar: purification and characterization of β-neoagarotetraose hydrolase from Peudomonas atlantica. Can. J. Microbiol. 23, 672-679 (1977)). 상기 TLC 분석에 의한 결과를 도 10에 나타내었다.

도 10에 나타난 바와 같이, 네오아가로헥사오스를 기질로 하여 상기 실시예 4-1의 생촉매액을 반응시켜 얻은 분해 산물의 TLC 분석 결과, 네오아가로테트라오스(neoagarotetraose)와 네오아가로바이오스(neoagarobiose)를 생산하는 것으로 확인되었다.

따라서 상기와 같은 결과를 고려할 때, 탈라소모나스 속 균주 SL-5가 생산하는 한천분해효소는 베타-아가라제인 것으로 확인되었다.

상기와 같은 결과에 의할 때, 본 발명인 탈라소모나스 속 균주 SL-5가 생산하는 한천분해효소는 호열성 베타-아가라제로 한천을 분해하여 기능성 한천올리고당을 산업적으로 생산 가능할 수 있어, 특히 의약품 및 기능성 식품과 관련된 산업분야에 기여할 것으로 기대된다.

이상 살펴본 바와 같이, 본 발명에 따른 탈라소모나스 속 균주 SL-5 KCCM 10790P 는 한천이 졸상으로 존재하는 40℃에서 가장 높은 분해능을 가지고, 70??에서도 최대 분해능의 78%의 분해능을 나타내므로 한천을 원료로 하여 고부가가치 상품인 다양한 한천올리고당을 제조할 수 있어, 의약품 및 기능석 식품과 관련된 산업에 크게 기여할 것으로 예상되고, 상기 탈라소모나스 속 균주 SL-5 KCCM 10790P 를 이용하여 한천올리고당을 제조하는 방법은 그 산업적 이용가치가 매우 크다고 할 수 있다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims

한천 분해능을 갖는 탈라소모나스 속 균주 SL-5(Thalassomonas sp. SL-5) KCCM 10790P .
제1항의 균주, 상기 균주의 배양액 및 상기 배양액의 농축액으로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상을 포함하는 한천 분해능을 갖는 생촉매(biocatalyst).
제2항의 한천 분해능을 갖는 생촉매를 한천과 반응시키는 단계를 포함하는 한천올리고당의 제조방법.
제3항에 있어서, 상기 한천올리고당은 네오아가로바이오스, 네오아가로테트라오스 및 네오아가로헥사오스로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는 한천올리고당의 제조방법.
제3항에 있어서, 상기 제조방법은 상기 한천과 반응시키는 단계를 20 내지 80℃ 및 pH 5.0 내지 pH 7.0의 조건에서 수행하는 것을 특징으로 하는 한천올리고당의 제조방법.