KR100368884B1

KR100368884B1 - 말토스포스포릴라제,트레할로스포스포릴라제및이들효소의생산능을가지는플레시오모나스속균주및트레할로스의제조방법

Info

Publication number: KR100368884B1
Application number: KR1019950030288A
Authority: KR
Inventors: 요시다마사히로; 나까무라노부유끼; 호리코시코키
Original assignee: 니혼 쇼꾸힌 카코 가부시키가이샤
Priority date: 1994-09-16
Filing date: 1995-09-15
Publication date: 2003-04-11
Also published as: US5807719A; EP0707062B1; US5705378A; DE69532106D1; DK0707062T3; CN1134980A; US5935827A; EP0707062A1; KR960010855A; DE69532106T2; ES2210269T3; CN1113094C

Abstract

본 발명은 새로운 미생물, 새로운 효소 및 새로운 효소의 제조방법에 관한 것이다. 더욱 상세하게는 트레할로스를 효소적으로 생산하는 경우에 필요한 말토스 포스포릴라제 및 트레할로스 포스포릴라제의 생산능을 가지는 플레시오모나스 (Plesiomonas)속에 속하는 새로운 미생물이며, 이 미생물에서 얻을 수 있는 새로운 말토스 포스포릴라제 및 트레할로스 포스포릴라제 및 이들 효소의 제조방법에 관한 것이다.

Description

말토스 포스포릴라제, 트레할로스 포스포릴라제 및 이들 효소의 생산능을 가지는 플레시오모나스속 균주 및 트레할로스의 제조방법.

또한, 본 발명은 효소법에 의한 트레할로스(O-α-D-glucpyranosyl-(1→1)-D-glucopyranoside)의 새로운 제조방법에 관한 것이다.

또한, 더욱 상세히는 플레시오모나스(Plesiomonas)속에 속하는 새로운 미생물 유래의 새로운 말토스 포스포릴라제 및 트레할로스 포스포릴라제를 이용한 트레할로스의 제조방법에 관한 것이다.

트레할로스는 의학, 화장품, 식품 등에 광범위하게 사용될 수 있는 물질이다. 따라서, 트레할로스를 공업적으로 생산하는 많은 시험이 이루어져 왔다. 이들의 기술은 크게 세가지로 분류할 수 있다.

그 하나는 트레할로스를 균체내에 축적하는 성질을 가지는 미생물에서 해당 물질을 추출정제하는 방법이다(Journal of American Chemical society 72권 2059페이지, 1950년, 독일특허 제 266584호, 특개평 3-130084호, 특개평 5-91890호, 특개평 5-184353호, 특개평 5-292986호). 이 방법은 미생물의 배양공정, 미생물의 분리공정, 미생물에서의 트레할로스의 추출공정, 추출된 트레할로스의 정제결정화공정으로 구성되어 있고, 제조공정이 대단히 번잡하다. 게다가, 트레할로스의 생산성도 다른 방법에 비해 적을 뿐만아니라, 다량의 미생물추출 잔사가 페기물로 발생되므로 경제적으로 효율이 우수한 방법이라고는할 수 없다.

또한, 다른 방법으로서는 트레할로스를 균체외(배지중)에서 생산하는 미생물, 브레비박테리움(Brevibaterium)속이나 코리네박테리움(Corynenacterinm)속 등의 미생물을 배양하여 트레할로스를 균체외(배지중)에서 생산하는 발효법이 개발되고 있다(특개평 5-211882호). 그러나 본 방법에 있어서도 트레할로스의 배지중에의 측적율은 약 3%(W/V)정도로 저수율이므로 공업적 규모로 트레할로스를 대량생산하기 위해서는 대용량의 발효조와 그것에 알맞는 정제설비가 필요하므로 경제적으로 문제가 있다. 게다가 본 방법으로 정제된 트레할로스를 얻기 위해서는 제균조작이 필요할 뿐만 아니라, 배양시에 사용균주가 생산하는 트레할로스 이외의 협잡물 또는 배지성분 등의 제거에 번잡한 공정을 필요로 하고 있다.

한편, 이들 발효법의 여러가지 문제점을 일거에 해결하는 방법으로서 효소법이 이미 개발되어 있다. 이것에는 미생물 유래의 말토스 포스포릴라제 (Maltose:orthophosphate β-D-glucosyltransferase)와 조류 유래의 트레할로스 포스포릴라제(α,α-Trehalose:orthophosphate β-D-glucosyltransferase)를 인산존재하에서 말토스에 작용시켜서 트레할로스를 생산하는 방법(특허 제1513517호, Agri.Biol.Chem., 49권, 2113페이지, 1985년) 및 세균 유래의 슈크로오스 포스포릴라제(Sucrose:orthophosphate α-D-glucosyltransferase)와 담자균 유래의 트레할로스 포스포릴라제(α,α-Trehalosep:orthophosphate α-D-glucosyltransferase)를 인산존재하에서 슈크로오스 작용시켜서 트레할로스를 얻는 방법(평성 6년도 일본농예화학회대회강연요지집, 3Ra14)이 보고되어 있다.

이들의 방법에 의하면 말토스 또는 슈크로오스에서 60~70%의 고수율로 트레할로스가 생선된다고 보고되어 있다. 또한 본 방법은 사용되는 원료가 정제된 고순도 당질지므로, 효소반응에 의해 얻을 수 있는 트레할로스의 정제도 용이하며, 다른 방법에 비해 공업적으로 유리한 방법이라 생각되어지고 있다. 그러나. 이들 방법에 있어서도 사용되는 효소, 특히 트레할로스 포스포릴라제의 공급원은 유글레나 또는 그리폴라(grifola)등과 같이 조류나 담자균이며, 이들에서 효소를 생산하기 위해서는 경제적인 문제만이 아니라 기술적으로도 곤란한 점이 있었다. 게다가 얻어진 트레할로스 포스포릴라제나 이것에 조합시켜서 이용되는 슈크로오스 포스포릴라제나 말토스 포스포릴라제 는 각각의 효소의 적정 pH영역이 크게 다르기 때문에 조합시켜서 사용할 때, pH관리가 대단히 곤란할 뿐만 아니라. 온도에 대한 안정성도 대단히 낮고, 트레할로스의 생산반응은 25∼37℃정도의 저온하에서 밖에 이행되지 않았다. 이것은 해방형의 반응조를 이용하여 이행되는 효소반응시에 잡균 오염이 일어나는 것을 암시하고 있고, 이것에 의한 부차적인 반응을 방지하기 위하여 엄밀한 위생관리가 필요로 하는 등의 결점을 가지고 있다. 또한, 이를 공지의 효소를 조합시켜서 이용하는 경우, 이들의 효소가 가지는 기질농도의존성때문에 고농도의 원료를 사용할 수 없었다. 이때문에 이 방법도 경제적으로 효율이 좋은 방법이라고는 할 수 없다.

이상으로 부터, 제조 및 정제가 용이하고, 높은 열안정성을 가지며, 기질농도 의존성이 없는 새로운 말토스 포스포릴라제 및 트레할로스 포스포릴라제를 발견하는 것이 가능하면, 용이하게 동시에 대량으로 입수할 수 있는 말토스를 원료로서 고수율로 게다가 용이하며 동시에 효율좋게 트레할로스를 제조할 수 있다.

따라서, 본 발명의 제 1 목적은 상기의 각종 조건을 만족하는 새로운 효소, 말토스 포스포릴라제 및 트레할로스 포스포릴라제를 높은 생산효율로 생성할 수 있는 새로운 미생물을 제공하는 것이다.

본 발명의 제 2 목적은 제조 및 정제가 용이하고, 높은 열안정성을 가지며, 기질농도 의존성이 없는 새로운 말토스 포스포릴라제 및 트레할로스 포스포릴라제를 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 제 3의 목적은 상기 미생물을 이용하여, 상기 2종류의 효소를 간단하고 동시에 고수율로 얻을 수 있는 제조방법을 제공 하는 것이다.

또한, 본 발명의 제 4의 목적은 상기 각종 조건을 만족하는 새로운 말토스 포스포릴라제 및 트레할로스 포스포릴라제를 이용하고, 또한 기질로서 말토스를 이용하여, 비교적 높은 온도 및 비교적 높은 기질농도에서의 효소반응이 가능하고, 동시에 pH에 조절이 용이한 트레할로스의 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명자들은 공업적으로 사용하기 위한 말토스 포스포릴라제 및 트레할로스 포스포릴라제를 구비하고, 이들 모든 성질을 가지는 효소를 생산하는 능력을 가지는 미생물을 얻기위하여 넓게 자연계를 검색하였다. 그 결과, 플레시오모나스속에 속하는 미생물이 상기 요건을 구비한 양 효소를 현저히 생산하는 것을 발견하여, 본 발명을 완성하였다. 또한, 플레시오모나스속에 속하는 새로운 미생물에서 새로운 말토스 포스포릴라제 및 트레할로스 포스포릴라제를 얻고, 이 말토스 포스포릴라제 및 트레할로스 포스포릴라제를 이용하므로서, 상기 목적을 달성시킬 수 있음을 발견하여 본 발명을 완성하였다.

즉, 본 밭명은 말토스 포스포릴라제 및 트레할로스 포스포릴라제 생산능을 가지며, 플레시오모나스(Plesiomonas)속에 속하는 미생물(생명공학공업기술연구소 FERM BP-5144, 1994년 8월 9일)에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 이하에 나타낸 이화학적 성질을 가지는 말토스 포스포릴라제에 관한 것이다.

(가) 작용:

말토스중의 α-1,4-글루코피라노사이드결합을 인산존재하에서 가역적으로 가인산분해하고, 글루코스 및 β-D-글루코스 1-인산을 생성한다.

(나) 기질특이성(분해반응):

말토스에 작용하고, 다른 2당류에 작용하지 않는다.

(다) 적정 pH 및 안정 pH범위:

분해반응의 적정 pH는 7.0∼7.5이고, 합성반응의 적정 pH는 6.0이다. 50℃, 10분간의 가열조건하에서는 pH 5.5∼7.0의 범위내에서 안정하다.

(라) 온도에 대한 안정성:

pH 6.0, 15분간의 가열조건하에서는 45℃까지 안정하다.

(마) 작용적온의 범위:

50℃근방에 분해반응의 적정작용온도를 가지며, 합성반응의 작용적온은 50∼55℃이다.

(바) 실활조건:

50℃, 10분간의 가열조건하에서는 pH 5.0 및 8.0에서 완전히 실활한다. 또한, pH 6.0, 15분간의 처리에서는 55℃에서 완전히 실활한다.

(사) 저해:

동, 수은, 카드뮴, 아연, N-브로모석시니이미드, p-클로로머큐리벤조에이트, 도데실벤젠설폰산나트륨에서 저해된다.

(아) 등전점전기이동에 의한 등전점:

3.8

(자) SDS플리아크릴아미드 전기영동법에 의한 분자량:

약 92,000(겔여과법에 의한 분자량은 약 200,000이고, 2개의 서브유니트로 구성되어 있다).

또한, 본 발명은 이하에 나타낸 이화학적 성질을 가지는 트레할로스 포스포릴라제에 관한 것이다.

(가) 작용:

트레할로스중의 α-1,1-글루코피라노사이드결합을 인산존재하에서 가역적으로 가인산분해하고, 글루코스 및 β-D-글루코스 1-인산을 생성한다.

(나) 기질특이성(분해반응):

트레할로스에 작용하고, 다른 2당류에 작용하지 않는다.

(다) 적정 pH 및 안정 pH범위:

분해 및 합성반응의 적정 pH는 7.0이다. 50℃, 10분간의 가열조건하에서 pH 6.0∼9.0의 범위내이다.

(라) 온도에 대한 안정성:

pH 7.0, 15분간의 가열조건하에서 50℃까지 안정하다.

(마) 작용적온의 범위:

분해반응 및 합성반응의 작용적온은 50∼55℃이다.

(바) 실활조건:

50℃, 10분간의 가열조건하에서는 pH 5.0 및 9.5에서 완전히 실활한다. 또한, pH 7.0, 15분간의 처리에서는 55℃에서 완전히 실활한다.

(사) 저해:

동, 수은, 카드뮴, 아연, N-프로모석시니이미드, p-클로로머큐리벤조에이트에서 저해된다.

(아) 등전점전기이동에 의한 등전점:

4.5

(자) SDS폴리아크릴아미드 전기영동법에 의한 분자량:

약 88,000(겔여과법에 의한 분자량은 약 200,000이고, 2개의 서브 유니트로 구성되어 있다).

또한, 본 발명은 상기 플레시오모나스(Plesiomonas)속에 속하는 본 발명의미생물을 배양하고, 상기 본 발명의 말토스 포스포릴라제 및 상기 본 발명의 트레할로스 포스포릴라제의 적어도 하나를 생성·축적시키고, 이것을 채취하는 것을 특징으로 하는 말토스 포스포릴라제 및 트레할로스 포스포릴라제의 제조방법에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 상기 본 발명의 말토스 포스포릴라제 및 트레할로스 포즈포릴라제를 인산의 존재하에서 말토스에 작용시키는 것을 특징으로 하는 트레할로스의 제조방법에 관한 것이다.

이하, 본 발명에 관하여 설명한다.

본 발명의 새로운 균주는 본 발명자 등에 의해 시즈오까현 후지시전자포(田子浦) 해안의 오니속에서 새로이 단리된 것이다. 이 균주는 버기스 매뉴얼 오브 디터미네이티브 박테올러지(Bergey's Mannual of Determinative Bacteriolgy), 제8판, 제 1권에 따라서 동정하면, 단리된 균주의 균학적 모든 성질을 이하의 표 1에 기재된 바와 같이 플레시오모나스(Plesiomonas)속에 속하고, P.shigelloides의 유연균으로 동정된다.

그러나, VP 테스트 및 우레아제 테스트가 양성인 것 및 D-만노스, D-갈락토스, L-아라비노스, D-프락토스를 자화할 수 있는 것 및 pH 9의 알카리성 조건하에서도 생육할 수 있는 점에 있어서 기재내용과 상위하며, 게다가 트레할로스 포스포릴라제와 말토스 포스포릴라제 의 양 효소를 균체내 및 배지중(균체외)에서 생성·축적하는 점에서 이미 알려진 균체와는 대단히 다르다.

또한, 상기 균주 플레시오모나스 SH-35는 공업기술원 생명공학공업 기술연구소에 FERM BP-5144로서 기탁되어 있다.

[표 1]

본 발명의 신균주는 다음과 같이 하여 스크리닝하였다. 우선, 채취한 해안오니를 정리식염수에 현탁하고, 상기 현탁액 한 방울을 이하의 조성의 한천배지에 도달하였다. 사용된 한천평판배지는 한천 2%(W/V), 트레할로스 또는 말토스 1%, 폴리펩톤 0.5%, 효모엑기스 0.5%, 인산이칼륨 0.1%, 황산마그네슘·칠수염 0.02%를 함유한다. 이와 같이하여 한천평판을 37℃에서 호기적으로 배양하고, 평판상에 나타난 각 콜로니를 얻어, 각각의 콜로니를 한천을 제외한 상기 조성의 액체배지중에서 37℃에서 24∼72시간, 180 r. p. m.에서 진탕배양하였다. 다음으로 각 배양액을 12,000×g으로 10분간, 4℃에서 원심분리하여 균체와 상징액으로 분리하였다. 이와 같이 하여 얻어진 균체는 소량의 0.1M 인산완충액(7.0)으로 균체를 현탁시키고, 이하에 서술한 방법으로 활성을 측정하였다. 그 결과, 상기와 같은 균학적 모든 특성을 가지는 균주를 분리할 수 있다.

본 발명의 새로운 미생물은 새로운 말토스 포스포릴라제 및 트레할로스 포스포릴라제를 생산하는 균이다. 다음으로, 이들의 효소의 제조방법에 관하여 설명한다.

본 발명의 미생물(FERM BP-5144)를 적당한 배지에 접종하여 배양한다. 배양은 해당 균체의 생육온도의 관점에서 25∼42℃의 온도범위로 하고, 8∼70시간 호기적으로 배양하는 것이 바람직하다. 본 발명의 미생물을 배양함으로서 본 발명의 트레할로스 포스포릴라제 및/또는 말토스 포스포릴라제 가 생성된다. 생성된 효소의 대부분은 균체내에 축적되고, 일부분은 균체외(배지중)에 축적된다. 따라서, 균체내 또는 균체외(배지중)에서 생성축적된 말토스 포즈포릴라제 및/또는 트레할로스포스포릴라제를 채취한다. 또한, 상기 배양은 배치식, 연속식의 어느 것에 의하여도 실시할 수 있다.

상기 배양에 이용되는 배지에 관하여 설명한다. 탄소원으로서는 트레할로스나 말토스 및 이들을 함유하는 당질을 이용하는 것이 가능하다. 질소원으로는 각종 유기 및 무기의 질소화합물을 이용하고, 또한 배지는 각종의 무기염을 더욱 함유할 수 있다.

탄소원으로서 트레할로스 또는 상기 물질을 함유하는 당질을 이용하면, 본 발명의 미생물은 트레할로스 포스포릴라제를 우선적으로 생산한다. 또한, 말토스 또는 상기 물질을 함유하는 당질을 탄소원으로서 이용하면, 본 발명의 미생물은 말토스 포스포릴라제 및 트레할로스 포스포릴라제를 동시에 생산한다. 단, 이 경우, 트레할로스 포스포릴라제의 생산형은 탄소원으로서 트레할로스를 이용한 경우에 비하면, 적어지는 경향이 있다. 또한, 탄소원으로서 트레할로스와 말토스의 양자 또는 이들의 물질을 함유하는 당질을 이용하면, 트레할로스 포스포릴라제와 말토스 포스포릴라제 를 동시에 생산시키는 것이 가능하고, 트레할로스와 말토스의 양을 제어함으로서 트레할로스 포스포릴라제와 말토스 포스포릴라제 의 생성비율을 조절할 수 있다.

또한, 질소원으로는 콘스팁리쿼(corn steep liquor), 대두박 또는 각종 펩톤류 등의 유기질소원, 그리고 황산암모늄, 초산암모늄, 인산암모늄, 요소 등의 무기질소원 등의 일반적으로 미생물의 배양에 이용되고 있는 싼 가격의 화합물을 사용할 수 있다. 또한, 요소나 유기질소원은 탄소원이 되는 것은 말할 필요도 없다.

본 발명의 방법에 있어서 사용에 적합한 배지로서는 예를 들면, 트레할로스 포스포릴라제를 우선적으로 생산하고 싶은 경우에는 트레할로스 1∼2%(W/V), 효모엑기스 2%, 인산암모늄 0.15%, 요소 0.15%, 식염 1%, 인산이칼륨 0.1%, 황산마그네슘·칠수염 0.02% 및 탄산칼슘 0.2%를 함유하는 pH 7.0∼7.5의 액체배지를 이용하는 것이 바람직하다. 또한, 말토스 포스포릴라제 와 트레할로스 포스포릴라제를 동시에 생산하고 싶은 경우에는 말토스 1∼2%(W/V), 폴리펩톤S(일본제약제) 2∼3%, 인산암모늄 0.15%, 요소 0.15%, 식염 1%, 인산이칼륨 0.1%, 황산마그네슘·칠수염 0.02% 및 탄산칼슘 0.2%를 함유하는 액체배지를 이용하는 것이 바람직하다.

또한, 상기와 같이 말토스를 탄소원으로서 이용하면 말토스 포스포릴라제 뿐만 아니라, 트레할로스 포스포릴라제도 어느 정도 생산된다. 따라서, 트레할로스 생산용의 조효소(말토스 포스포릴라제 와 트레할로스 포스포릴라제와의 혼합물)을 얻을 때에는 말토스를 탄소원으로서 이용하는 것이 편리하며, 경제적이다.

배양균체내 또는 배양상청중에 축적된 각 효소는 통상의 방법에 따라 단리하는 것이 가능하다. 우선, 균체내의 효소는 균체마다 조효소로서 이용하는 것이 가능하다. 또한, 균체에서 효소를 추출함으로서 조효소를 회수하는 것도 가능하다. 또한, 균체외의 배양상청중에도 효소는 포함되어 있고, 균체를 분리한 나머지의 배양액을 조효소 함유액으로서 이용하는 것도 가능하다.

또한, 이들의 조효소는 에탄올, 아세톤, 이소프로판올 등에 의한 용매침전법, 황산암모늄분화법, 이온교환크로마토그래피, 겔여과크로마토그래피 등의 통상의 방법을 이용하여 정제하는 것이 가능하다. 또한, 말토스 포스포릴라제 와 트레할로스 포스포릴라제와의 분리는 양자의 동전점이 다르므로 음이온교환 크로마토그래피에 의해 수행하는 것이 가능하다.

이와 같이하여 얻어진 본 발명의 효소는 하기 실시예에 있어서, 상세히 설명하는 바와 같이 상기의 이화학적 성질을 가지는 말토스 포스포릴라제 및 트레할로스 포스포릴라제이다.

이들 효소의 활성측정은 본 발명의 플레시오모나스 SH-35주기 말토스나 트레할로스를 가수분해하는 α-글루코시다제(말타제), 글루코아밀라제, 트레할라제 등을 생산하지 않으므로 가인산분해반응의 측정에는 각각 말토스 또는 트레할로스를 기질로 하고, 인산염 존재하에서 효소 반응시켜 생성되는 글루코스를 클루코스옥시다제법으로 측정하는 간단한 방법의 적용이 가능하다. 또한, 합성반응은 β-D-글루코스 일인산과 글루코스의 혼합물을 기질로 하여, 효소반응에 의해 생성되는 무기 인산을 통상의 방법에 따라 측정하는 것이 가능하다.

효소활성측정법

(1) 분해반응

50mM의 인산완충액(pH 7)에 용해시킨 20mM의 말토스 또는 트레할로스 용액 0.5ml에 효소액 0.01ml를 첨가하여, 50℃에서 15분간 반응시킨 후, 비등수용중에서 3분간 가열하여 효소반응을 정지시킨다. 다음으로 유수중에서 냉각시킨 후, 생성된 글루코스를 글루코스옥시다제법(화광순약공업(주)제, 글루코스C-Ⅱ테스트·와코)로 측정한다. 그리고, 1단위의 효소활성은 동조건하에서 1분간 μmole (마이크로몰)의 글루코스를 생성하는 효소량으로 한다.

(2) 합성반응

70mM의 헤페스(HEPES) 완충액(pH 7.0)에 용해시킨 27mM의 β-D-글리코스 일인산나트륨염과 같은 농도로 글루코스와의 혼합용액 0.15ml에 0.05ml의 효소액을 첨가하고, 50℃에서 15분간 반응시킨후, 비등수용중에서 2분간 가열하여 효소활성을 정지시킨다. 다음으로 생성된 무기인산을 화광순약공업(주)제 p-테스트 와코 (p-TEST WAKO)를 이용하여 측정한다. 그리고, 1단위의 효소활성은 상기와 같은 조건하에서 1분간에 1마이크로몰(μmole)의 무기인산을 생성하는 효소량이 된다.

본 발명의 새로운 효소인 말토스 포스포릴라제 및 트레할로스 포스포릴라제는 각각 조효소 또는 정제효소로서 이용하는 것이 가능하다. 또한, 양 효소의 활성을 가지는 균체 및 해당 균체를 적당한 담체에 포괄, 흡착 또는 화학적으로 결합시킨 고정화 균체 등을 예를 들면, 트레할로스의 제조에 사용하는 것도 가능하다. 또한 본 발명의 효소는 각 효소를 공지의 방법으로 고정화시킨 고정화 효소로서 사용하는 것도 가능하다.

본 발명의 트레할로스의 제조방법은 상기 2종의 효소를 인산의 존재하에서 말토스에 작용시키는 것이다. 인산은 말토스가 가인산분해 되기 때문에 필요하며, 반응액중 0.1∼500미리몰/리터, 바람직하게는 5∼10미리몰/리터의 농도범위로 하는 것이 적당하다. 인산으로서는 예를 들면, 오르쏘인산, 인산나트륨, 인산칼륨, 인산이수소나트륨, 인산이수소칼륨 등의 무기인산 및 그 염등을 이용하는 것이 가능하다. 또한, 기질로서는 말토스를 이용한다. 단, 말토스는 정제품이어도 또는 말토스를 함유하는 당질이어도 좋다. 말토스 농도는 조작하기 쉬운 점도의 용액 및 주입1회당의 수량 즉 경제성이라고 하는 관점에서 10∼600g/리터, 바람직하게는 200∼400g/리터의 범위로 하는 것이 바람직하다.

효소의 농도는 트레할로스의 생성율이나 반응시간 등을 고려하여 적절히 결정하는 것이 가능하다. 단, 통상 0.1∼50단위/g-기질로 하는 것이 바람직하다. 반응온도는 효소의 적정온도 및 반응시간 등을 고려하여 적절히 결정되지만, 잡균오염의 방지 등을 고려하면 30∼65℃, 바람직하게는 45∼55℃의 범위한 것이 적당하다. 또한, 반응 pH는 효소의 적정 pH를 고려하면, 5.0∼9.0, 바람직하게는 6.0∼7.0의 범위인 것이 적당하다. 반응시간을 트레할로스의 생성율, 효소의 첨가랑, 반응용기의 용량 등에 의해 적절히 결정된다. 단, 일반적으로 공업적 규모에서는 약 50∼80시간의 범위인 것이 바람직하다.

말토스 포스포릴라제 및 트레할로스 포스포릴라제는 각각 조효소 또는 정제효소로서 이용할 수 있다. 또한, 양 효소의 활성을 가지는 균체 및 해당 균체를 적당한 담체에 포괄, 흡착 또는 화학적으로 결합시킨 고정화 균체를 사용하는 것도 가능하다. 또한, 각 효소를 공지의 방법으로 고정화시킨 고정화 효소로서 사용하는 것도 가능하다. 예를 들면, 균체를 알간산이나 κ-칼라기난으로 고정하거나 또는 추출효소를 음이온 교환수지에 흡착시킨 것을 이용하는 것이 가능하다.

상기 반응에 의해 생성된 트레할로스는 전분당의 정제법과 같이 규조토여과, 이온교환수지에 의한 탈염, 이온교환크로마토그래피에 의한 분화, 농축, 결정화에 의한 분리정제하는 것이 가능하다.

[실시예]

이하 본 발명에 관하여 실시예에 따라 상세히 설명한다.

실시예 1

균체내 및 균체외 말토스 포스포릴라제 의 제조 및 정제

플레시오모나스 SH-35주(FERM BP-5144)를 말토스 1%(W/V), 폴리펩톤S(일본제약제) 2%, 인산암모늄 0.15%, 요소 0.15%, 식염 1%, 인산이칼륨0.1%, 황산마그네슘·칠수염 0.02% 및 탄산칼슘 0.2%를 함유하는 pH 7.0의 액채배지에 식균하였다. 다음으로 이 액체배지를 37℃에서 24시간 호기적으로 배양하였다. 얻어진 배양액을 4℃에서 12,000×g으로 15분간 원심분리하여 균체와 상청액으로 분리하였다. 얻어진 균체는 소량의 20mM 인산완충액(pH 7.0)에 현탁시킨 후, 초음파균체파쇄기로 균체를 파괴하였다. 다음으로 해당 파쇄균체 현탁액에 황산암모늄를 첨가하고, 30% 포화하여 4℃에서 하루밤 방치하였다. 다음으로 원심분리를 하여 침전물을 제거하여 얻어진 상청액에 황산암모늄을 더 첨가하여 70% 포화시켰다. 4℃에서 하루밤 방치하여 생성된 침전물을 원심분리하여 모아두고, 20mM 인산완충액(pH 7)에 용해시킨 후, 상기와 같은 완충액에서 충분히 투석하였다.

다음으로 상기와 같은 완충액에서 평형화된 DEAE-프락토겔(Fractogel)(매르크사제)컬럼에 통액하여 효소를 흡착시켰다. 흡착된 효소를 상기와 같은 완충액에 함유되는 0 M에서 0.6 M의 식염의 농도구 배법으로 용출시킨 후, UF막(아마콘사제, YM-30)으로 농출하였다. 농축효소는 0.2 M식염을 함유하는 상기와 같은 완충액에서 평형화된 세파크릴(SEPHACRYL)S-300(팔마시아사제)컬럼을 이용하여 겔여과 크로마토그래피로 정제하였다. 얻어진 활성화분을 모아서, 1.5 M의 황산암모늄을 함유하는 상기와 같은 완충액에서 충분히 투석한 후, 1.5 M의 황산암모늄을 포함하는 상기와 같은 완충액에서 평형화된 페닐·토요팔(TOYOPAL)(토소사제)컬럼에 통액하여 효소를 흡착시켰다. 흡착된 효소를 상기와 같은 완충액에 함유되는 1.5 M에서 0 M의 황산암모늄의 농도 구배법으로 용출시킨 후, 얻어진 얻어진 활성화분을 모아서 0.2 M 식염을 포함하는 상기와 같은 완충액에서 충분히 투석하였다. 상기의 UF 막을 이용하여 농축한 후, 0.2 M의 식염을 함유하는 상기와 같은 완충액에서 평형화 한 스파덱스 200(팔마시아사제)로 다시 겔여과 크로마토그래피를 이행하여, 얻어진 활성화분을 상술한 방법으로 농축하여 폴리아크릴아미드겔디스크전기영동법(PAGE) 및 SDS-PAGE으로 균일한 균체내 말토스 포스포릴라제 정제효소(5ml, 약 2,800단위, 활성수율 약 28%)를 얻을 수 있었다.

또한, 균체외 효소에 관하여도 배양상청을 출발원료로 하고, 상기 방법과 같은 방법으로 정제농축하여, 활성수율 약 25%(5ml, 약 425단위)로 말토스 포스포릴라제 의 정제효소를 얻었다.

실시예2

균체내 및 균체외 트레할로스 포스포릴라제의 제조 및 정제

플레시오모나스 SH-35주(FERM BP-5144)를 트레할로스 1%(W/V), 효모엑기스 2 %, 인산암모늄 0.15%, 요소 0.15%, 식염 1%, 인산이칼륨 0.1%, 황산마그네슘·칠수염 0.02% 및 탄산칼슘 0.2%를 함유하는 pH 7.0의 액체배지에 식균하였다. 이 액체배지를 실시예 1과 같이 배양하고, 후처리하여 균체파쇄액과 상청액을 얻었다. 얻어진 균체파쇄액과 상청액에 관하여 각각 실시예 1과 같은 방법으로 정제하였다.PAGE법 및 SDS-PAGE법에 있어서 균일한 균체내 트레할로스 포스포릴라제 및 균체외 트레할로스 포스포릴라제를 각각 활성수율 약 35%(5ml, 약 7,880단위) 및 약 32%(5ml, 약 2,400단위)로 얻었다.

실시예 3

플레시오모나스 SH-35주가 생산하는 말토스 포스포릴라제 및 트레할로스 포스포릴라제의 효소 화학적 모든 성질

다음에 본 발명의 플레시오모나스 SH-35주(FERM BP-5144)가 생산하는 새로운 말토스 포스포릴라제 및 트레할로스 포스포릴라제의 일반적인 효소 화학적 특성에 관하여, 실시예 1 및 2와 같은 방법으로 정제하여 얻은 정제효소를 이용하여 검토한 결과를 하기에 나타내었다. 또한, 예비실험의 결과, 균체내 및 균체외의 양 효소모두 거의 같은 이화학적인 모든 성질을 나타내었으므로 따라서 균체내 효소의 모든 성질을 나타내고 있다.

(가) 작용

10mM 인산완충액(pH 7.0)에 용해시킨 l%(W/V)의 말토스 및 트레할로스 용액에 말토스 포스포릴라제 및 트레할로스 포스포릴라제를 기질 1g에 대하여 각각 5단위(분해반응)첨가하고, 50℃에서 5시간 반응시킨 후, 비등수용중에서 3시간 가열하여 효소를 실활시켜서 얻어진 당화액 중의 당을 고속액체 크로마토그래피법으로 측정한 결과, 글루코스 및 글루코스 일인산이 각각 검출되었다. 또한, 10mM의 트리스(Tris) 염산완충액(pH 7.0)에 용해시킨 1%(W/V)의 글루코스 및 β-D-글루코스 일인산나트륨염 또는 α-D-글루코스 일인산나트륨염의 혼합용액을 기질로 하여말토스 포스포릴라제 및 트레할로스 포스포릴라제를 기질 1g에 대하여 각각 5단위 첨가하고, 50℃에서 5시간 반응시킨후, 상기와 같이 처리하여 당조성을 측정한 결과, 글루코스와 β-D-글루코스 일인산에서는 말토스 및 트레할로스가 각각 검출되었지만, 글루코스와 α-D-글루코스 일인산에서의 이당류의 합성반응은 검출되지 않았다.

생성당의 분석은 하기의 방법으로 수행되었다. 즉, 가열실활시켜서 얻어진 당화액중의 불용물을 0.45㎛의 멤브레인필터로 여별하여 얻어진 여액을 공시당액으로 하여, YMC-Pack, ODS-AQ(AQ-304, YMC사제)컬럼을 이용하는 고속액체 크로마토그래피법으로 측정하였다. 또한, 이 동상에는 물을 이용하며, 컬럼온도를 30℃로 하고, 검출에는 시차굴절계를 이용하였다.

(나) 기질특이성(분해반응)

앞에 상술한 활성측정법(분해반응)에 나타낸 기질(말토스 또는 트레할로스)에 대신하여 각종 당류를 기질로 한 경우의 활성을 상대활성으로 하여 나타내었다. 결과를 표2에 나타내었다.

[표 2]

(다) 적정 pH 및 안정 pH범위

정제효소를 이용하여 분해 및 합성반응의 최적 pH를 측정하였다. 그 결과,제 1도의 (가)에 도시한 바와 같이 말토스 포스포릴라제 의 분해반응(흰 점으로 나타낸다)의 최적 pH는 7.0∼7.5이고, 합성반응(검은 점으로 나타낸다)은 6.0이 최적이었다. 또한, 제 1도의 (나)에 도시한 바와 같이 트레할로스 포스포릴라제는 분해반응(흰 점) 및 합성반응(검은 점)과 같이 7.0이 최적이었다. 또한, pH분해반응의 경우는 20mM의 인산완충액을 합성반응의 경우에는 MES(pH 5.5∼6.5), MOPS(pH 값 6.5∼7.0), HEPES(pH 7.0∼8.0), 트리스염산(pH 7.5∼9.0)의 각 완충액를 이용하여 조정하였다.

또한, 정제한 양효소를 각 완충액에서 10분간, 50℃에서 처리하고, 이들의 잔존효소활성을 분해반응으로 측정한 결과, 제 2도에 도시한 바와 같이 말토스 포스포릴라제 (흰 점)는 pH 5.5∼6.5의 범위이고, 또한 트레할로스 포스포릴라제(검은 점)는 pH 6.0∼9.0까지 안정하였다. 또한, pH는 초산(pH 5.0∼5.5), 인산(pH 6.0∼8.0), 탄산(pH 8.9)의 각 완충액을 이용하여 조정하였다.

(라) 작용적온

양효소의 분해반응 및 합성반응의 작용적온을 측정한 결과, 제 3도에 도시한 바와 같이 말토스 포스포릴라제 (A, 흰 점: 분해반응, 검은 점: 합성반응), 트레할로스 포스포릴라제(B, 흰 점: 분해반응, 검은 점: 합성반응) 모두 분해반응은 50℃이고, 합성반응은 50∼55℃의 범위이었다.

(마) 온도에 따른 실활의 조건

말토스 포스포릴라제 및 트레할로스 포스포릴라제의 각각의 안정 pH인 pH 6.0 및 7.0의 조건하에서 15분간 처리하여, 잔존하는 실활을 무처리와 비교하여 통상의 방법에 따라 측정하였다. 그 결과, 제 4도에 도시한 바와 같이 말토스 포스포릴라제 (흰 점)는 55℃에서 또한, 트레할로스 포스포릴라제(검은 점)는 60℃에서 안정하게 실활하였다.

(바) 저해제

양효소의 합성반응에 있어서의 활성을 각종 저해제 존재하에서 측정하여, 무첨가시의 활성을 100%로 하는 상대활성으로 나타낸 결과를 표3에 나타내었다.

[표 3]

EDTA(Ethylenediamine tetraacetate),

IAA(Monoiodoacetate),

NBS(N-Bromosuccinimide),

pCMB(p-Chloromercurybenzoate),

pMSF(p-Metylsulfonylfluoride),

SDS(Sodium dodecylsulfate)

(사) 등전점

이소겔(FMC BioProducto사제)를 이용하는 등전점전기이동법에 의해 양효소의 등전점을 측정한 결과, 제 5도에 도시한 바와 같이 말토스 포스포릴라제는 3.8, 트레할로스 포스포릴라제는 4.5이었다.

(아) 분자량

양 정제효소의 분자량을 SDS-PAGE법 및 세파크릴(SEPHACRYL)S-200을 이용하는 겔여과법에 의해 측정하였다. 그결과, 제 6도에 도시한 바와 같이 겔여과법에서는 양효소의 분자량은 약 200,000이었지만, SDS-PAGE법에서는 말토스 포스포릴라제 가 약 92,000 그리고 트레할로스 포스포릴라제가 약 88,000이었으므로, 이들 효소는 각각 2개의 서브유니트로 구성되어 있는 것으로 예상된다.

상기 이화학적 모든 성질을 이미 알려진 말토스 포스포릴라제 및 트레할로스 포스포릴라제와 비교하여 표 4 및 표 5로 정리하였다.

[표 4]

[표 5]

실시예 4

균체내 및 균체외 트레할로스 포스포릴라제의 제조방법

트레할로스 1%(W/V), 효모엑기스(Difco사제) 2%, 인산암모늄 0.15%, 요소 0.15%, 식염 1%, 인산이칼륨 0.1%, 황산마그네슘·칠수염 0.02% 및 탄산칼슘 0.2%를 함유하는 pH 7.5의 액체배지 20리터에 미리 상기와 같은 배지에서 하루밤 배양하여 얻은 플레시오모나스 SH-35주종균(FERM BP-5144) 1리터를 무균적으로 첨가하고, 37℃, 300rpm, 통기량 1v. v. m의 조건하에서 24시간 통기 교반배양을 하였다. 본 배양액의 트레할로스 포스포릴라제 활성을 측정한 결과, 배양액 1ml당 1.5단위이었다. 또한, 이와 같은 말토스 포스포릴라제 활성도 측정하였지만, 활성은 미량이었다.

다음으로 12,000×g, 4℃에서 10분간 원심분리하고, 약 160g의 균체(습윤시) 및 19.5리터의 상청액을 얻어서, 로미콘(Romicon)사제 UF막(YM-30)으로 능축하여, 약 1리터(약 6,400단위)의 균체외 농축조효소를 얻을 수 있었다. 상청액중의 효소활성을 측정한 결과, 전활성(약 30×10³단위)의 약 25%(7.5×10³단위)의 활성이 있었다.

또한, 균체부분에 관하여는 10mM의 인산완충액(pH 7)으로 충분히 세정하여 500ml의 상기와 같은 완충액으로 현탁시킨 후, 초음파균체파쇄기로 균체를 파쇄하고, 통상적인 방법에 따라 트레할로스 포스포릴라제를 측정한 결과, 전활성의 약 75%(22.5×10³단위)가 균체내에 포함되어 있다.

실시예 5

(말토스 포스포릴라제 및 트레할로스 포스포릴라제 함유균체 및 균체외 효소의 제조)

실시예 1에서 이용한 배지성분중의 트레할로스를 말토스로, 효모엑기스를 폴리펩톤 FC(일본제약(주)제) 5%(W/V)로 각각 대신하고, 다른 것은 같은 방법으로 SH-35주(FERM BP-5144)를 배양하였다. 본 배양액의 말토스 포스포릴라제 활성 및 트레할로스 포스포릴라제 활성을 측정한 결과, 배양액1ml당 0.5단위의 말토스 포스포릴라제 활성과 0.45단위의 트레할로스 포스포릴라제가 함유되어 있다. 다음으로 이와같이 원심분리하여 약 150g의 균체(습윤시) 및 19.6리터의 상청액을 얻었다. 다음으로 균체 및 상청중의 말토스 포스포릴라제 활성을 측정한 결과, 말토스 포스포릴라제 의 전활성의 약 78%(약 10,000단위)가 균체내에 그리고 약 22%가 균체외(배양상청)에 함유되어 있었다. 또한, 트레할로스 포스포릴라제의 전활성의 약 82%(약 9,000단위)가 균체내에 그리고, 약 18%가 균체외(배양상청)에 함유되어 있다. 배양상청은 실시예 1과 같은 방법으로 농축하고, 약 1리터의 농축효소를 얻을 수 있으며, 해당 농축효소중에는 약 1,700단위의 말토스 포스포릴라제 와 1,430단위의 트레할로스 포스포릴라제가 함유되어 있다.

실시예 6

10ml의 10mM 인산완충액(pH 6)에 용해시킨 10, 20, 30 및 40%(W/V)의 각 말토스용액에 실시예 2 및 실시예 1과 같은 방법으로 조제한 균체내 정제 트레할로스 포스포릴라제 및 균체내 정제 말토스 포스포릴라제 를 각각 기질중량 1g당 5단위(분해활성)첨가하고, 55℃에서 70시간 반응시켰다. 반응종료후, 반응액을 100℃에서 5분간 가열하여 효소를 실활시켜서 얻어진 당화액중의 트레할로스 함유량을 측정하였다. 그 결과, 기질중량에 대하여 각각 58.2, 58.1, 58.6, 57.9%의 트레할로스가 생성되었다.

또한, 트레할로스의 정량은 이하의 방법으로 이행하였다.

즉, 가열실활시킨 당화액에 물을 첨가하여, 약 1%(W/V)로 한 후, 해당 당화에 0.5ml에 글루코아밀라제(생화학공업제, 퓨아그레이드 30U/mg)를 0.01단위 첨가하고, 50℃, pH 5.0에서 1시간 반응시켜, 미반응의 말토스를 글루코스로 완전히 분해시켰다. 다음으로 100℃의 비등수용중에서 5분간 가열하여 글루코아밀라제를 실활시킨 후, 생성된 불용성 단백질을 0.45㎛의 멤브레인필터로 제거하여 얻어진 여액중의 트레할로스 함유량을 YMC-Pack ODS-AQ(AQ-304, YMC사제)컬럼을 이용하는 액체 크로마토그래피법(HPLC법)으로 측정하였다. 또한, 측정은 이동상에 물을 이용하여, 컬럼온도를 30℃로 하고, 검출에는 시차굴절계를 이용하였다.

실시예 7

10ml의 5mM 인산완충액(pH 6)에 용해시킨 20%(W/V)의 하이말토스시럽(일본식품화공제, 상품명 MC-95, 당조성: 글루코스 2.5%, 말토스 95.2%, 말토트리오스 0.8%, 말토테트라오스 1.5%)에 실시예 2 및 실시예 1과 같은 방법으로 조제된 균대외 정제 트레할로스 포스포릴라제 및 균체외 정제 말토스 포스포릴라제 를 기질중량 1g당 각각 5단위 첨가하고, 이하 실시예 6과 같이 반응시켰다. 생성된 트레할로스를 HPLC법으로 측정한 결과, 사용된 기질중량에 대하여 54.3%이었다.

실시예 8

실시예 7과 같은 방법으로 조제하여 트레할로스 포스포릴라제 및 말토스 포스포릴라제를 함유하는 균체 약 1kg(습윤시)를 얻었다. 통상의 방법에 따라 효소활성(분해활성)을 측정한 결과, 상기 균체에는 55단위/g(습윤시)의 트레할로스 포스포릴라제 및 68단위/g(습윤시)의 말토스 포스포릴라제 의 활성을 가지고 있다. 제조된 균체 1kg을 10mM의 인산완충액(pH 6.5)에 함유되는 30%(W/V)의 말토스용액 250리터 중에 첨가하여, 50℃에서 80시간 반응시킨 후, 균체를 원심분리하여 제거하였다. 얻어진 상청액의 일부를 글루코아밀라제로 처리하고, 그 당조성을 HPLC법으로 측정하였다. 그 결과, 트레할로스 58.1%, 글루코스 39.6%, 글루코스 일인산 2.3%이었다.

다음으로 얻어진 당화상청액 약 240리터(고형물 72kg)에 고형물 중량에 대하여 0.1%의 공업용 조글루코아밀라제(신일본화학사제, 상품명 스미팀 #3,000)을 첨가하여, pH 5.5, 55℃에서 20시간 재당화하여 잔존하는 말토스를 글루코스로 거의 완전하게 가수분해하였다. 다음으로 통상의 방범에 따라 활성탄탈색, 이온교환수지에 따른 탈염 등으로 정제하여, 감압하에서 농축하여 농도 약 75%(W/V)의 정제당화액(고형물 약 65kg)를 얻었다.

제 1도는 플레시오모나스 SH-35주가 생산하는 말토스 포스포릴라제 및 트레할로스 포스포릴라제의 반응적곡선(심볼: 분해방응(○), 합성반응(●))이고,

제 2도를 플레시오모나스 SH-35주가 생산하는 말토스 포스포릴라제 및 트레할로스 포스포릴라제의 pH안정성(심볼: 말토스 포스포릴라제 (○), 트레할로스 포즈포릴라제(●))를 나타낸 곡선이며,

제 3도는 플레시오모나스 SH-35주가 생산하는 말토스 포스포릴라제 및 트레할로스 포스포릴라제의 작용적온(심볼: 분해반응(○), 합성반응(●))을 나타낸 곡선이고,

제 4도는 플레시오모나스 SH-35주가 생산하는 말토스 포스포릴라제 및 트레할로스 포스포릴라제의 온도안정성(심볼: 말토스 포스포릴라제 (○), 트레할로스 포스포릴라제 (●))을 나타낸 곡선이며,

제 5도는 플레시오모나스 SH-35주가 생산하는 말토스 포스포릴라제 및 트레할로스 포스포릴라제의 등전점을 나타낸 곡선이고,

제 6도는 플레시오모나스 SH-35주가 생산하는 말토스 포스포릴라제 및 트레할로스 포스포릴라제의 분자량을 나타낸 곡선이다.

본 발명에 따르면, 트레할로스를 효소적으로 제조할 때에 필요한 말토스 포스포릴라제 및 트레할로스 ㅍ스포릴라제를 균체내 및 균체외(배지중)에 생산할 수 있는 새로운 미생물이 제공된다.

본 발명의 미생물은 세균이므로 종래 트레할로스 포스포릴라제의 급원으로서 알려져 있는 연조니 담자균에 비교하여 효소의 취득방법이 용이할 뿐만아니라, 배양시간도 대폭으로 단축할 수 있으므로 경제적이다. 또한, 본 발명의 미생물은 일종의 세균이 트레할로스의 효소적 생산에 필요한 2종의 효소를 동시에 생산할 수 있다고 하는 이점도 가지고 있다.

또한, 본 발명의 2개의 효소는 트레할로스를 효소적으로 생산할 때에 요구되는 모든 조건을 모두 만족하므로, 얻어진 트레할로스의 유효 이용을 대단히 용이하게 하며, 경제적으로도 대폭 개선을 보정할 수 있는 것이다. 즉, 본 발명의 말토스 포스포릴라제 및 트레할로스 포스포릴라제는 고온안정성을 가지며, 고온에서의 효소반응이 가능하므로 반응중의 잡균오염을 피할 수 있다. 또한, 양방의 효소가 거의 동일한 최적 pH범위를 가지고 있으므로, 반응중의 번잡한 pH관리가 불필요한 이점도 가지고 있다.

또한, 본 발명에 의하면 새로운 말토스 포스포릴라제 및 트레할로스 포스포릴라제를 이용하여, 트레할로스를 효소적으로 제조하는 것이 가능하다.

또한, 본 발명의 트레할로의 제조방법은 pH의 조정이 가능하며, 높은 기질(말토스) 농도에서도 고수율로 트레할로스를 얻을 수 있다. 또한 반응온도도 높게하는것이 가능하고, 보다 높은 반응온도를 선택하므로서 고수율로 트레할로스를 얻을 수 있다. 또한, 고온에서의 효소반응이 가능하므로 반응중의 잡균오염을 피할 수 있다.

Claims

말토스 포스포릴라제 및 트레할로스 포스포릴라제 생산능을 가지며, 플레시오모나스(Plesiomonas)속에 속하는 미생물(FERM BP-5144).
하기와 같은 이화학적 성질을 가지는 말토스 포스포릴라제.

(가) 작용:

말토스중의 α-1, 4-글루코피라노사이드결합을 인산존재하에서 가역적으로 가인산분해하고, 글루코스 및 β-D-글루코스일인산을 생성한다.

(나) 기질특이성(분해반응)

말토스에 적용하고, 다른 이당류에 적용하지 않는다.

(다) 적정 pH 및 안정 pH의 범위:

분해반응의 적정 pH 7.0∼7.5이고, 합성반응의 적정 pH는 6.0이다. 50℃, 10분간의 가열조건하에서는 pH 5.5∼7.0의 범위내에서 안정한다.

(라) 온도에 대한 안정성:

pH 6.0, 15분간의 가열조건하에서는 45℃까지 안정하다.

(마) 작용적온의 범위:

50℃근방에 분해반응의 적정 작용온도를 가지고, 합성반응의 작용적온은 50∼55℃이다.

(바) 실활조건:

50℃, 10분간의 가열조건하에서는 pH 5.0 및 8.0에서 완전히 실활한다. 또한, pH 6.0, 15분간의 처리에서는 55℃에서 완전히 실활한다.

(사) 저해:

동, 수은, 카드뮴, 아연, M-브로모썩시니미드, p-클로로머큐리벤조에이트, 도데실벤젠설폰산나트륨에서 저해된다.

(아) 등전점전기이동법에 의한 등전점:

3.8

(자) SDS폴리아크릴아미드전기영동법에 의한 분자량:

약 92,000(겔여과법에 의한 분자량은 약 200,000이고, 2개의 서브유니트로 구성되어 있다).
하기와 같은 이화학적 성질을 가지는 트레할로스 포스포릴라제.

(가) 작용:

트레할로스중의 α-1, 1-글루코피라노사이드결합을 인산존재하에서 가역적으로 가인산분해하고, 글루코스 및 β-D-글루코스 1-인산을 생성한다.

(나) 기질특이성(분해반응):

트레할로스에 작용하고, 다른 이당류에 작용하지 않는다.

(다) 적정 pH 및 안정 pH의 범위:

분해 및 합성반응의 적정 pH는 7.0이다. 50℃, 10분간의 가열조건하에서는 pH 6.0∼9.0의 범위내이다.

(라) 온도에 대한 안정성:

pH 7.0, 15분간의 가열조건하에서는 50℃까지 안정하다.

(마) 작용적온의 범위:

분해반응 및 합성반응의 작용적온은 50∼55℃이다.

(바) 실활조건:

50℃, 10분간의 가열조건하에서는 pH 5.0 및 9.5에서 완전히 실활한다. 또한, pH 7.0, 15분간의 처리에서는 55℃에서 완전히 실활한다.

(사) 저해:

동, 수은, 카드뮴, 아연, N-브로모썩시니미드, p-클로로머큐리벤조에이트에서 저해된다.

(아) 등전점전기이동법에 의한 등전점:

4.5

(자) SDS폴리아크릴아미드전기영동법에 의한 분자량:

약 88,000(겔여과법에 의한 분자량은 약 200,000이고, 2개의 서뷰유니트로 구성되어 있다).
제 1항의 미생물을 배양하고, 제 2항의 말토스 포스포릴라제 및 제 3항의 트레할로스 포스포릴라제의 적어도 하나를 생성·축적시켜, 이것을 채취하는 것을 특징으로 하는 말토스 포스포릴라제 및 트레할로스 포스포릴라제의 제조방법.
제 4항에 있어서, 상기 배양을 탄소원으로서 말토스의 존재하에서 수행하고, 말토스 포스포릴라제 및 트레할로스 포스포릴라제를 생성·축적시키는 것을 특징으로 하는 말토스 포스포릴라제 및 트레할로스 포스포릴라제의 제조방법.
제 4항에 있에서, 상기 배양을 탄소원으로서 트레할로스의 존재하에서 수행하고, 트레할로스 포스포릴라제를 우선적으로 생성·축적시키는 것을 특징으로 하는 말토스 포스포릴라제 및 트레할로스 포스포릴라제의 제조방법.
제 4항에 있어서, 배양후의 배양액에서 균체를 분리하고, 분리된 균체를 그대로 말토스 포스포릴라제 및/또는 트레할로스 포스포릴라제의 조효소로 하는 것을 특징으로 하는 말토스 포스포릴라제 및 트레할로스 포스포릴라제의 제조방법.
제 4항에 있어서, 배양후의 배양액에서 균체를 분리하고, 분리된 균체에서 말토스 포스포릴라제 및/또는 트레할로스 포스포릴라제의 조효소를 추출하는 것을 특징으로 하는 말토스 포스포릴라제 및 트레할로스 포스포릴라제의 제조방법.
제 4항에 있어서, 배양후의 배양액에서 균체를 분리하고, 얻어진 배양상청액을 말토스 포스포릴라제 및/또는 트레할로스 포스포릴라제의 조효소 함유액으로 하는 것을 특징으로 하는 말토스 포스포릴라제 및 트레할로스 포스포릴라제의 제조방법.
제 2항의 말토스 포스포릴라제 및 제 3항의 트레할로스 포스포릴라제를 인산 존재하에서 말토스에 작용시키는 것을 특징으로 하는 트레할로스의 제조방법.
제 10항에 있어서, 말토스 포스포릴라제 및 트레할로스 포스포릴라제가 제 1 항의 미생물을 배양하여 얻어진 균체내 효소 또는 균체외 효소인 것을 특징으로 하는 트레할로스의 제조방법.
제 10항 또는 제 11항에 있어서, 효소반응을 30∼65℃의 온도범위에서 수행하는 것을 특징으로 하는 트레할로스의 제조방법.