ES2210269T3 - Maltosa-fosforilasa, trehalosa-fosforilasa, cepa de plesiomonas y procedimiento de preparacion de trehalosa. - Google Patents
Maltosa-fosforilasa, trehalosa-fosforilasa, cepa de plesiomonas y procedimiento de preparacion de trehalosa.Info
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Abstract
SE PRESENTAN UN NUEVO MICROORGANISMO (FERM BP-5144) QUE PERTENECE AL GENERO PLESIOMONAS Y ES CAPAS DE PRODUCIR FOSFORILASA DE MALTOSA Y FOSFORILASA DE TREHALOSA REQUERIDAS PARA LA PRODUCCION ENZIMATICA DE TREHALOSA Y NUEVAS FOSFORILASA DE MALTOSA Y FOSFORILASA DE TREHALOSA QUE SE PUEDEN OBTENER A PARTIR DEL MICROORGANISMO ASI COMO UN PROCESO PARA LA PRODUCCION DE ENZIMAS. TAMBIEN SE PRESENTA UN NUEVO PROCESO PARA PRODUCIR ENZIMATICAMENTE TREHALOSA (O-{AL}-D-GLUCOPIRANOSIL-(1 --> 1)-DGLUCOPIRANOSIDO).
Description
Maltosa-fosforilasa,
trehalosa-fosforilasa, cepa de Plesiomonas y
procedimiento de preparación de trehalosa.
El presente invento se refiere a un nuevo
microorganismo, nuevas enzimas y un nuevo procedimiento para
producir las nuevas enzimas. Más específicamente, se refiere a un
nuevo microorganismo que pertenece al género Plesiomonas y tiene la
capacidad de producir maltosa-fosforilasa y
trehalosa-fosforilasa necesarias para la producción
enzimática de trehalosa y nuevas maltosa-fosforilasa
y trehalosa-fosforilasa, obtenibles a partir de los
microorganismos, además de un procedimiento para producir las
enzimas.
El presente invento se refiere además a un nuevo
procedimiento para producir enzimáticamente trehalosa
(O-\alpha-D-glucopiranosil-(1\rightarrow1)-D-glucopiranósido).
Más precisamente, el presente invento se refiere
a un procedimiento para producir trehalosa utilizando la nueva
maltosa-fosforilasa y la nueva
trehalosa-fosforilasa derivadas del nuevo
microorganismo perteneciente al género Plesiomonas.
La trehalosa es un material que espera usarse
para diversos usos tales como en productos farmacéuticos, cosméticos
y comestibles. Por lo tanto, se han hecho diversos intentos hasta
la fecha para producir trehalosa industrialmente. Esos intentos
pueden clasificarse aproximadamente en tres enfoques.
Uno de esos es extraer trehalosa de
microorganismos que tienen la capacidad de acumular trehalosa en sus
células (J. Am. Chem. Soc., 72, p2059 (1950); Patente Alemana núm.
266584; Publicación de Patente Japonesa no examinada (KOKAI,
referida en adelante como "JP-A")
3-130084;
JP-A-5-91890;
JP-A-5-184353; y
JP-A-5-292986). Este
método comprende las etapas de cultivar microorganismos, aislar los
microorganismos, extraer trehalosa de los microorganismos, purificar
y cristalizar la trehalosa extraída, y por lo tanto, las etapas del
procedimiento son muy complejas. Además, la productividad de
trehalosa es más baja que otros procedimientos y se queda una gran
cantidad de residuo de extracción microbiana como desecho. Por lo
tanto, este método no puede considerarse un procedimiento eficaz
económicamente.
Para otro enfoque, se han investigado
microorganismos que secretan trehalosa extracelularmente (en su
medio de cultivo), y se han desarrollado métodos de fermentación
donde microorganismos pertenecientes al género
Brevibacterium, el género Corynebacterium y
similares, se cultivan para producir trehalosa mediante su
secreción extracelular (en su medio de cultivo) de trehalosa
(JP-A-5-211882).
Sin embargo, también en este enfoque, el
rendimiento de producción, es decir, la cantidad de acumulación de
trehalosa en el medio de cultivo no es tan alto (aproximadamente 3%
(P/V)). Por lo tanto, para producir una gran cantidad de trehalosa
en una escala industrial por este enfoque, es necesario proporcionar
un tanque de fermentación de un gran volumen y un medio de
purificación suficiente para el volumen del tanque, y así este
método no es ventajoso económicamente. Además, este método también
requiere la separación de los microorganismos para obtener trehalosa
purificada y, además, requiere etapas complejas adicionales para
eliminar otras impurezas que la trehalosa, que se han producido por
los microorganismos, y los componentes del medio de cultivo.
Como un método para resolver todos los problemas
descritos anteriormente, se han desarrollado ya métodos enzimáticos.
Como dichos métodos, se ha difundido un procedimiento para producir
trehalosa donde se dejan actuar a la
maltosa-fosforilasa derivada de microorganismos
(Maltosa:ortofosfato-\beta-D-glucosiltransferasa)
y la trehalosa-fosforilasa derivada de algas
(\alpha,\alpha-trehalosa:ortofosfato-\beta-D-glucosiltransferasa)
en maltosa en presencia de fosfato (Patente Japonesa núm. 1513517;
Agri. Biol. Chem., 49, p2113 (1985)), y un procedimiento para
producir trehalosa donde se dejan actuar a la
sacarosa-fosforilasa derivada de bacterias
(Sacarosa:ortofosfato-\alpha-D-glucosiltransferasa)
y la trehalosa-fosforilasa derivada de
Basidiomicetes
(\alpha,\alpha-Trehalosa:ortofosfato-\alpha-D-glucosiltransferasa)
en sacarosa en presencia de fosfato (Abstracts of de Congress of the
Agricultural Chemical Society of Japan (1994), 3Ra14).
Se ha difundido que la trehalosa se produjo a
partir de maltosa o sacarosa con un alto rendimiento de 60 a 70%
por estos métodos. Además, ya que las materias primas usadas en
estos métodos son azúcares purificados con altas purezas, la
trehalosa producida enzimáticamente puede purificarse fácilmente, y
por lo tanto estos métodos se consideran ventajosos industrialmente
comparados con otros métodos. Sin embargo, también en este método,
las enzimas usadas para este método, en particular, la
trehalosa-fosforilasa, se derivan de algas o
Basidiomicetes tales como euglena y grifola, y por lo tanto la
preparación de las enzimas por estas fuentes no es sólo
desventajoso económicamente, sino también técnicamente difícil.
Además, como los valores óptimos de pH de la
trehalosa-fosforilasa,
sacarosa-fosforilasa y
maltosa-fosforilasa obtenidas usados junto con
ellos son bastante diferentes uno de otro, es muy difícil controlar
un valor de pH cuando se usan combinadas. Por otra parte, la
estabilidad térmica de estas enzimas es bastante pobre y la
producción de trehalosa puede llevarse a cabo sólo en un bajo
intervalo de temperatura, por ejemplo, 25 a 37ºC, y esto puede
conducir a contaminación microbiana durante la reacción enzimática
cuando la reacción se lleva a cabo en un tanque de reacción
abierto. Por lo tanto, este método requiere un estricto control de
contaminación para prevenir reacciones secundarias causadas por
contaminación y puede ser un inconveniente de este procedimiento.
Además, estas enzimas conocidas no permiten el uso de una alta
concentración de materias primas cuando se usan combinadas por su
dependencia de concentración de sustrato. Por lo tanto, este método
tampoco es un método eficaz económicamente.
Con el fundamento descrito anteriormente, puede
decirse que, si las nuevas maltosa-fosforilasa y
trehalosa-fosforilasa que son fáciles de producir y
purificar y tienen alta estabilidad térmica y no se ha encontrado
dependencia de concentración de sustrato y llega a estar
disponible, es posible producir trehalosa con alta rendimiento y
alta eficacia de la maltosa, que está disponible fácilmente en gran
cantidad.
Por lo tanto, el primer objeto del presente
invento es proporcionar un nuevo microorganismo capaz de producir
nuevas enzimas que satisfagan los diversos requisitos descritos
anteriormente, es decir, nueva maltosa-fosforilasa y
nueva trehalosa-fosforilasa, con una alta eficacia
de producción.
El segundo objeto del presente invento es
proporcionar nueva maltosa-fosforilasa y nueva
trehalosa-fosforilasa que sean fáciles de producir y
purificar y tengan altas estabilidades térmicas y ninguna
dependencia de concentración de sustrato.
El tercer objeto del presente invento es
proporcionar un procedimiento para producir fácilmente los dos tipos
de enzimas descritas anteriormente con un alto rendimiento
utilizando el microorganismo mencionado anteriormente.
Además, el cuarto objeto del presente invento es
proporcionar un procedimiento para producir trehalosa utilizando la
nueva maltosa-fosforilasa y la nueva
trehalosa-fosforilasa mencionadas anteriormente y
usando maltosa como un sustrato, en donde las reacciones
enzimáticas son posibles a una temperatura relativamente alta y a
concentración de sustrato relativamente alta, y el valor de pH se
ajuste fácilmente.
Para obtener microorganismos capaces de producir
maltosa-fosforilasa y
trehalosa-fosforilasa que satisfagan las propiedades
descritas anteriormente requeridas por esas enzimas para uso
industrial, los presentes inventores han investigado diversas
fuentes naturales. Como resultado, los presentes inventores han
encontrado que un microorganismo perteneciente al género
Plesiomonas puede producir una cantidad significativa de ambas
enzimas, satisfaciendo los requisitos descritos anteriormente y
completado así el presente invento. Además, los presentes inventores
han encontrado que los objetos mencionados anteriormente pueden
alcanzarse aislando las nuevas maltosa-fosforilasa y
trehalosa-fosforilasa del nuevo microorganismo y
utilizando la maltosa-fosforilasa y la
trehalosa-fosforilasa y completado el presente
invento.
Por lo tanto, el presente invento se refiere a un
microorganismo (National Institute of Bioscience and Human
Technology, FERM BP-5144) que tiene la capacidad de
producir maltosa-fosforilasa y
trehalosa-fosforilasa y pertenece al género
Plesiomonas.
El presente invento se refiere además a
maltosa-fosforilasa que tiene las siguientes
propiedades fisicoquímicas;
La maltosa-fosforilasa cataliza
la escisión de enlaces
\alpha-1,4-glucopiranósido en
maltosa por fosforólisis en presencia de fosfato para producir
glucosa y
\beta-D-glucosa-1-fosfato
y viceversa.
Actúa en maltosa, pero no en otros
disacáridos.
Su pH óptimo para la reacción fosforolítica es
7,0 a 7,5, el pH óptimo para la reacción sintética es 6,0; y es
estable dentro de un intervalo de pH de 5,5 a 7,0 bajo
calentamiento a 50ºC durante 10 minutos.
Es estable hasta 45ºC bajo calentamiento a pH 6,0
durante 15 minutos.
Su temperatura óptima para la reacción
fosforolítica es alrededor de 50ºC, y su temperatura óptima para la
reacción sintética es 50 a 55ºC.
Se inactiva completamente a pH 5,0 y 8,0 por
calentamiento a 50ºC durante 10 minutos y también se inactiva
completamente a 55ºC por calentamiento a pH 6,0 durante 15
minutos.
Se inhibe por cobre, mercurio, cadmio, zinc,
N-bromosuccinimida,
p-cloromercuribenzoato o dodecilbencenosulfonato
sódico.
El punto isoeléctrico es pH 3,8 por
isoelectroenfoque.
El peso molecular medido por electroforesis con
gel de SDS poliacrilamida es aproximadamente 92.000 daltons (peso
molecular medido por filtración en gel es aproximadamente 200.000
daltons, y por lo tanto la enzima está constituida por dos
subunidades).
El presente invento también se refiere a
trehalosa-fosforilasa que tiene las siguientes
propiedades fisicoquímicas:
La trehalosa-fosforilasa cataliza
la escisión de enlaces
\alpha-1,1-glucopiranósido en
trehalosa por fosforólisis en presencia de fosfato para producir
glucosa y
\beta-D-glucosa-1-fosfato
y viceversa.
Actúa en la trehalosa, pero no en otros
disacáridos.
Su pH óptimo para la reacción fosforolítica y la
reacción sintética es 7,0, y es estable dentro de un intervalo de pH
de 6,0 a 9,0 bajo calentamiento a 50ºC durante 10 minutos.
Es estable hasta 50ºC bajo calentamiento a pH 7,0
durante 15 minutos.
Su intervalo óptimo de temperatura para la
reacción fosforolítica y sintética es 50 a 55ºC.
Se inactiva completamente a pH 5,0 y 9,5
calentando a 50ºC durante 10 minutos y también se inactiva
completamente a 55ºC calentando a pH 7,0 durante 15 minutos.
Se inhibe por cobre, mercurio, cadmio, zinc,
N-bromosuccinimida,
p-cloromercuribenzoato o dodecilbencenosulfonato
sódico.
El punto isoeléctrico es pH 4,5 por
isoelectroenfoque.
El peso molecular medido por electroforesis con
gel de SDS poliacrilamida es aproximadamente 88.000 daltons (peso
molecular medido por filtración en gel es aproximadamente 200.000
daltons, y por lo tanto la enzima está constituida por dos
subunidades).
Además, el presente invento se refiere a un
procedimiento para producir maltosa-fosforilasa y
trehalosa-fosforilasa que comprende cultivar el
microorganismo del presente invento que pertenece al género
Plesiomonas, dejar al microorganismo producir y acumular al menos
uno de la maltosa-fosforilasa y la
trehalosa-fosforilasa del invento mencionado
anteriormente, y recuperar la(s) enzima(s).
Además, el presente invento se refiere a un
procedimiento para producir trehalosa que comprende dejar a la
maltosa-fosforilasa y la
trehalosa-fosforilasa del presente invento actuar
sobre la maltosa en presencia de fosfato.
La Fig. 1 muestra curvas de pH óptimo de reacción
para maltosa-fosforilasa y
trehalosa-fosforilasa producido por la cepa
SH-35 de Plesiomonas (reacción fosforolítica
(\bigcirc), reacción sintética (\medbullet)).
La Fig. 2 muestra las estabilidades de pH de
maltosa-fosforilasa y
trehalosa-fosforilasa producidas por la cepa
SH-35 de Plesiomonas
(maltosa-fosforilasa (\bigcirc),
trehalosa-fosforilasa (\medbullet)).
La Fig. 3 muestra curvas de temperatura óptima de
reacción para maltosa-fosforilasa y
trehalosa-fosforilasa producidas por la cepa
SH-35 de Plesiomonas (reacción fosforolítica
(\bigcirc), reacción sintética (\medbullet)).
La Fig. 4 muestra las estabilidades térmicas de
maltosa-fosforilasa y
trehalosa-fosforilasa producidas por la cepa
SH-35 de Plesiomonas
(maltosa-fosforilasa (\bigcirc),
trehalosa-fosforilasa (\medbullet)).
La Fig. 5 muestra los puntos isoeléctricos de
maltosa-fosforilasa y
trehalosa-fosforilasa producidas por la cepa
SH-35 de Plesiomonas.
La Fig. 6 muestra los pesos moleculares de
maltosa-fosforilasa y
trehalosa-fosforilasa producidas por la cepa
SH-35 de Plesiomonas.
El presente invento se explicará adicionalmente
en detalle en adelante.
La nueva cepa del presente invento se aisló
originalmente a partir de fango de la orilla del mar de Tagonoura,
ciudad de Fuji, prefectura de Shizuoka, Japón. Según el Bergey's
Manual of Determinative Bacteriology, 8ª edición, volumen 1, la cepa
aislada se identificó por pertenecer al género Plesiomonas y por ser
una cepa análoga de P. Shigelloides como se sugiere por las
propiedades bacteriológicas de la cepa mostradas en la Tabla 1
posterior.
Sin embargo, las propiedades de la cepa no se
ajustan a las descripciones del Bergey's Manual respecto a que la
cepa muestra resultados positivos en la prueba VP y la prueba de
ureasa, que puede metabolizar D-manosa,
D-galactosa, L-arabinosa y
D-fructosa, y que puede crecer incluso bajo
condición alcalina de pH 9,0 y además, la cepa es bastante
diferente de cepas conocidas en que se produce y acumula ambas
enzimas, trehalosa-fosforilasa y
maltosa-fosforilasa, dentro de sus células y en su
medio de cultivo (fuera de las células).
La cepa SH-35 de Plesiomonas se
depositó en el Instituto Nacional de Biociencia y Tecnología Humana
como FERM BP-51444.
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siguiente)
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Propiedades bacteriológicas de la cepa
productora de maltosa-fosforilasa y
trehalosa-fosforilasa
La nueva cepa del invento se aisló como sigue.
Primero, se suspendió fango tomado de la orilla del mar en suero
salino fisiológico y se extendió una gota de la suspensión en un
medio de agar que tenía la composición descrita posteriormente. El
medio usado contenía 2% (p/v) de agar, 1% de trehalosa o maltosa,
0,5% de polipeptona, 0,5% de extracto de levadura, 0,1% de fosfato
ácido de dipotasio y 0,02% de sulfato de magnesio heptahidratado.
El plato de agar se incubó a 37ºC bajo condiciones aeróbicas y las
colonias crecidas en el plato se recuperaron y cultivaron en un
caldo que tenía la composición descrita anteriormente excepto por
el agar a 37ºC durante 24 a 72 horas agitando a 180 rpm. Luego, el
caldo de cultivo se sometió a centrifugación a 12.000 x g a 4ºC
durante 10 minutos para separar las células del sobrenadante. Las
células obtenidas se suspendieron en tampón fosfato 0,1 M (pH 7,0),
y las actividades se determinaron como se describe posteriormente.
Como resultado, se separaron las células que tenían las
características taxonómicas descritas posteriormente.
El nuevo microorganismo del presente invento es
una bacteria que produce nueva maltosa-fosforilasa y
trehalosa-fosforilasa. El procedimiento para
producir estas enzimas que explicará en adelante.
El microorganismo del presente invento
(FERM-5144) se inoculó en un medio apropiado y se
cultivó. El cultivo se lleva a cabo preferiblemente en un intervalo
de temperatura de 25 a 42ºC durante 8 a 70 horas bajo condiciones
aeróbicas. Durante el cultivo del microorganismo del presente
invento, se producen trehalosa-fosforilasa y/o
maltosa fosforilasa del presente invento. Las enzimas producidas se
acumulan principalmente dentro de las células y se acumulan
parcialmente extracelularmente (en el medio). Luego, se recuperan
la maltosa-fosforilasa y/o la
trehalosa-fosforilasa producidas y acumuladas en las
células o fuera de las células (en el medio). El cultivo se lleva a
cabo discontinua o continuamente.
Se explicará el medio usado para el cultivo
descrito anteriormente. La trehalosa, maltosa y materiales de
azúcar que contienen estos disacáridos pueden usarse como una
fuente de carbono. Como una fuente de nitrógeno, pueden usarse
diversos compuestos orgánicos e inorgánicos de nitrógeno y, además,
el medio puede contener diversas sales inorgánicas.
Cuando se usa trehalosa o un material de azúcar
que contiene este sacárido, el microorganismo del presente invento
produce preferentemente trehalosa-fosforilasa.
Cuando se usa maltosa o un material de azúcar que contiene este
sacárido, el microorganismo del presente invento produce
maltosa-fosforilasa y
trehalosa-fosforilasa simultáneamente. En este caso,
sin embargo, la cantidad de la trehalosa-fosforilasa
producida tiende a reducirse comparado con el caso donde se usa
trehalosa como una fuente de carbono. La
trehalosa-fosforilasa y la
maltosa-fosforilasa pueden producirse
simultáneamente usando tanto trehalosa como maltosa o un material de
azúcar que contiene estos sacáridos como una fuente de carbono, y la
relación de producción de trehalosa-fosforilasa y
maltosa-fosforilasa puede controlarse controlando
las cantidades de trehalosa y maltosa.
Como fuente de nitrógeno, materiales o compuestos
baratos usados generalmente para cultivar microorganismos, por
ejemplo, fuentes orgánicas de nitrógeno tales como licor de maíz
remojado, harina de soja y diversas peptonas, y fuentes inorgánicas
de nitrógeno tales como sulfato amónico, nitrato amónico, fosfato
amónico y urea. Por supuesto, la urea y las fuentes orgánicas de
nitrógeno también pueden servir como la fuente de carbono.
Los medios preferidos usados para el
procedimiento del presente invento son, por ejemplo, cuando se desea
la producción preferencial de trehalosa-fosforilasa,
medio de caldo de cultivo que comprende 1 a 2% (p/v) de trehalosa,
2% de extracto de levadura, 0,15% de fosfato amónico, 0,15% de
urea, 1% de cloruro sódico, 0,1% de fosfato ácido de dipotasio,
0,02% de sulfato de magnesio heptahidratado y 0,2% de carbonato
cálcico a un pH de 7,0 a 7,5. Cuando se desea la producción
simultánea de trehalosa-fosforilasa y
maltosa-fosforilasa, puede usarse adecuadamente el
medio de caldo de cultivo que comprende 1 a 2% (p/v) de maltosa, 2
a 3% de POLYPEPTON-S (Nippon Seiyaku Co., Ltd.),
0,15% de fosfato amónico, 0,15% de urea, 1% de cloruro sódico, 0,1%
de fosfato ácido de dipotasio, 0,02% de sulfato de magnesio
heptahidratado y 0,2% de carbonato cálcico.
Como se describe anteriormente, cuando se usa
maltosa como fuente de carbono, se produce no sólo
maltosa-fosforilasa, sino también una cierta
cantidad de trehalosa-fosforilasa. Por lo tanto,
para obtener enzimas en bruto (mezclas de la
maltosa-fosforilasa y la
trehalosa-fosforilasa) para la producción de
trehalosa, es conveniente y ventajoso económicamente usar maltosa
como la fuente de carbono.
Las enzimas acumuladas en las células cultivadas
y en el sobrenadante del medio de cultivo pueden aislarse de una
manera convencional. Las células que contienen ambas enzimas pueden
usarse también como una fuente enzimática para producir trehalosa.
Además, las enzimas en bruto pueden obtenerse extrayendo estas
enzimas de las células. El sobrenadante del cultivo contiene también
estas enzimas y por lo tanto el medio de cultivo después de separar
las células puede usarse como una fuente enzimática para producir
trehalosa.
Estas enzimas en bruto pueden purificarse por
técnicas convencionales tal como precipitación en disolvente con
etanol, acetona, isopropanol o similares, fraccionamiento con
sulfato amónico, cromatografía de intercambio de iones y
cromatografía de filtración en gel. La
maltosa-fosforilasa y la
trehalosa-fosforilasa pueden separarse una de la
otra por cromatografía de intercambio de aniones basada en la
diferencia entre sus puntos isoeléctricos.
Las enzimas del presente invento obtenidas como
anteriormente, como se explicará en detalle en los Ejemplos
posteriores, la maltosa-fosforilasa y la
trehalosa-fosforilasa tienen las propiedades
fisicoquímicas mencionadas anteriormente.
Porque la cepa SH-35 de
Plesiomonas no produce \alpha-glucosidasa
(maltasa), glucoamilasa, trehalosa y similares, que hidrolizan
maltosa y trehalosa, las actividades de las enzimas pueden medirse
por un método sencillo donde, para la medida de actividad
fosforolítica, la reacción enzimática se lleva a cabo usando maltosa
o trehalosa como un sustrato en presencia de fosfato y la glucosa
producida se mide por el método de la
glucosa-oxidasa. La actividad para la reacción
sintética puede medirse llevando a cabo la reacción con una mezcla
de sustratos que contiene
\beta-D-glucosa-1-fosfato
y glucosa y midiendo la cantidad de fosfato inorgánico producido por
la reacción enzimática.
A 0,5 ml de disolución de maltosa o trehalosa 20
mM en tampón fosfato 50 mM (pH 7,0), se añaden 0,01 ml de la muestra
de enzima para causar la reacción durante 15 minutos a 50ºC. La
reacción enzimática se para calentando en un baño de agua hirviendo
durante 3 minutos. Después de enfriamiento, la mezcla de reacción,
la glucosa formada se mide por el método de
glucosa-oxidasa (GLUCOSE C-II TEST
WAKO, Wako Junyaku Kogyo Co., Ltd.). Una cantidad de la enzima que
produce 1 micromol de glucosa durante 1 minuto bajo las condiciones
descritas anteriormente, se considera una unidad de actividad de
enzima. Una unidad de la actividad enzimática se define como la
cantidad de enzima que forma 1 \mumol de glucosa por minuto bajo
las condiciones descritas anteriormente.
A 0,15 ml de disolución de
\beta-D-glucosa-1-fosfato
(sal disódica) 27 mM y glucosa de la misma concentración en tampón
HEPES 70 mM (pH 7,0), se añaden 0,05 ml de la muestra de enzima para
causar la reacción durante 15 minutos a 50ºC. La reacción enzimática
se para calentando en un baño de agua hirviendo durante 2 minutos.
Luego, el fosfato inorgánico liberado se mide por
P-TEST WAKO (Wako Junyaku Kogyo., Ltd.). Una unidad
de la actividad enzimática se define como la cantidad de enzima que
forma 1 \mumol de fosfato inorgánico por minuto bajo las
condiciones descritas anteriormente.
Las nuevas enzimas del presente invento, la
maltosa-fosforilasa y la
trehalosa-fosforilasa, pueden utilizarse como
enzimas en bruto o enzimas purificadas. Además, las células
microbianas que tienen actividades de ambas enzimas y células
inmovilizadas que comprenden las células microbianas incluidas en o
adsorbidas a o enlazadas químicamente a vehículos apropiados, pueden
usarse para, por ejemplo, la producción de trehalosa.
Alternativamente, las enzimas del presente invento pueden usarse
como enzimas inmovilizadas preparadas de una manera conocida.
En el procedimiento para la producción de
trehalosa según el presente invento, los dos tipos de enzimas
mencionados anteriormente se dejan actuar sobre maltosa en
presencia de fosfato. Los fosfatos se necesitan para la
descomposición de maltosa por fosforólisis, y su cantidad adecuada
presente en la mezcla de reacción es 0,1 a 500 mmol/litro,
preferiblemente 5 a 10 mmol/litro. Como los fosfatos, puede usarse
ácido fosfórico inorgánico y sales del mismo tal como ácido
ortofosfórico, fosfato sódico, fosfato potásico, fosfato diácido
sódico y fosfato diácido potásico. La maltosa se usa como el
sustrato. El sacárido que contiene maltosa puede usarse también como
una materia prima inicial. La maltosa se usa adecuadamente en una
concentración de 10 a 600 g/litro, preferiblemente 200 a 400
g/litro, ya que dicha concentración da por resultado una viscosidad
fácil de manejarse y un buen rendimiento por lote, es decir, buena
eficacia económica.
La concentración de las enzimas puede
seleccionarse adecuadamente considerando el rendimiento de
producción de trehalosa, tiempo de reacción y similares. Sin
embargo, la concentración adecuada es normalmente 0,1 a 50
unidades/g (sustrato). La temperatura de reacción puede
seleccionarse adecuadamente considerando las temperaturas óptimas de
las enzimas, tiempo de reacción y similares, y es preferiblemente 30
a 65ºC, particularmente 45 a 55ºC desde el punto de vista de la
prevención de contaminación microbiana. El pH de reacción puede
seleccionarse adecuadamente a partir de un intervalo de 5,0 a 9,0,
preferiblemente 6,0 a 7,0 considerando el pH óptimo de las enzimas.
El tiempo de reacción también puede seleccionarse adecuadamente
considerando el rendimiento de producción de trehalosa, cantidad de
las enzimas, volumen del recipiente de reacción y similares. Sin
embargo, el tiempo de reacción adecuado es generalmente
aproximadamente 50 a 80 horas en producción industrial.
La maltosa-fosforilasa y la
trehalosa-fosforilasa pueden usarse como enzimas en
bruto o enzimas purificadas. Además, pueden usarse células
microbianas que tienen actividades de ambas enzimas y células
inmovilizadas que comprenden las células microbianas incluidas en o
adsorbidas a o enlazadas químicamente a vehículos apropiados.
Alternativamente, las enzimas del presente invento pueden usarse
como enzimas inmovilizadas preparadas de una manera conocida. Por
ejemplo, pueden usarse células microbianas inmovilizadas con ácido
algínico, \kappa-carragenina o similares, o
enzimas extraídas absorbidas en resinas de intercambio de
aniones.
La trehalosa producida por la reacción descrita
anteriormente puede separarse y refinarse, como la purificación de
azúcares de almidón, por filtración para separar los materiales
insolubles con arcilla de tierras diatomáceas como una ayuda a la
filtración, desionización con resinas de intercambio de iones,
fraccionamiento cromatográfico con resinas de intercambio de iones,
concentración, cristalización o similares.
El presente invento se explicará adicionalmente
en referencia a los siguientes ejemplos.
La cepa SH-35 de Plesiomonas
(FERM BP-5144) se inoculó en un medio de cultivo que
contenía 1% (p/v) de maltosa, 2% de POLYPEPTON-S
(Nippon Seiyaku Co., Ltd.), 0,15% de fosfato amónico, 0,15% de urea,
1% de cloruro sódico, 0,1% de fosfato ácido de dipotasio, 0,02% de
sulfato de magnesio heptahidratado y 0,2% de carbonato cálcico (pH
7,0) y se cultivó aeróbicamente durante 24 horas a 37ºC. El caldo de
cultivo obtenido se centrifugó a 12.000 x g durante 15 minutos a 4ºC
para separar en células y sobrenadante. Las células obtenidas se
suspendieron en una pequeña cantidad de tampón fosfato 20 mM (pH
7,0) mediante un ultrasonicador. Luego, se añadió sulfato amónico a
la suspensión de células rotas a una concentración del 30% de
saturación, y la suspensión se dejó toda la noche a 4ºC. Luego, la
suspensión se centrifugó para separar precipitados y se añadió
sulfato amónico al sobrenadante resultante a una concentración del
70% de saturación. La disolución se dejó toda la noche a 4ºC y los
precipitados producidos se recogieron y disolvieron en tampón
fosfato 20 mM (pH 7,0) y luego se dializó suficientemente frente al
mismo tampón.
La enzima obtenida se cargó en una columna
DEAE-Fractogel (Merck) equilibrada con el mismo
tampón, así que la enzima se adsorbió a la resina. La enzima
adsorbida se eluyó con un gradiente de cloruro sódico de 0 a 0,6 M
en el mismo tampón y se concentró con una membrana UF
(YM-30, Amicon). La enzima concentrada se purificó
por cromatografía de filtración en gel usando una columna SEPHACRYL
S-300 (Pharmacia) equilibrada con el mismo tampón
que contenía cloruro sódico 0,2 M. Las fracciones activas obtenidas
se combinaron, dializaron frente al mismo tampón que contenía
sulfato amónico 1,5 M y cargaron en una columna PHENYL TOYOPAL
(Toso) equilibrada con el mismo tampón que contenía sulfato amónico
1,5 M, así que la enzima se adsorbió a la resina. La enzima
adsorbida se eluyó con un gradiente de sulfato amónico de 1,5 a 0 M
en el mismo tampón, y las fracciones activas obtenidas se combinaron
y dializaron suficientemente frente al mismo tampón que contenía
cloruro sódico 0,2 M. La enzima se concentró con la misma membrana
UF como la mencionada anteriormente, y se sometió a cromatografía de
filtración en gel de nuevo usando una columna SUPERDEX 200
(Pharmacia) equilibrada con el mismo tampón que contenía cloruro
sódico 0,2 M. Las fracciones activas obtenidas se concentraron como
se describe anteriormente (5 ml, aproximadamente 2.800 unidades,
rendimiento de actividad; aproximadamente 28%). La
maltosa-fosforilasa purificada intracelular se
homogeneizó por PAGE y SDS-PAGE.
Usando el sobrenadante del cultivo como un
material inicial, también se obtuvo
maltosa-fosforilasa extracelular purificada con un
rendimiento de actividad de aproximadamente 25% (5 ml,
aproximadamente 425 unidades) a través de la purificación y
concentración de la misma manera que la descrita anteriormente.
La cepa SH-35 de Plesiomonas
(FERM BP-5144) se inoculó en un medio de cultivo que
contenía 1% (p/v) de trehalosa, 2% de extracto de levadura, 0,15% de
fosfato amónico, 0,15% de urea, 1% de cloruro sódico, 0,1% de
fosfato ácido de dipotasio, 0,02% de sulfato de magnesio
heptahidratado y 0,2% de carbonato cálcico (pH 7,0). El cultivo y
los tratamientos se llevaron a cabo de la misma manera que en el
Ejemplo 1 para dar una suspensión de células rotas y un
sobrenadante. La suspensión de células rotas y el sobrenadante
obtenidos se purificaron de la misma manera que en el Ejemplo 1.
Las trehalosa-fosforilasas intracelulares y
extracelulares purificadas, que se homogeneizaron
electroforéticamente por PAGE y SDS-PAGE, se
obtuvieron con rendimientos de actividad de aproximadamente 35% (5
ml, aproximadamente 7.880 unidades) y aproximadamente 32% (5 ml,
aproximadamente 2.400 unidades), respectivamente.
Las propiedades enzimológicas de la nueva
maltosa-fosforilasa y la nueva
trehalosa-fosforilasa producidas por la cepa
SH-35 de Plesiomonas (FERM BP-5144)
se determinaron usando enzimas purificadas obtenidas de la misma
manera que en los Ejemplos 1 y 2 y se muestran debajo. Porque las
trehalosa-fosforilasas intracelulares y
extracelulares mostraron propiedades enzimológicas similares en los
experimentos preliminares, se muestran las propiedades de la enzima
intracelular debajo.
A una disolución de maltosa y trehalosa al 1%
(P/V) en tampón fosfato 10 mM (pH 7,0), se añadieron 5 unidades
(reacción fosforolítica) por 1 g de cada sustrato de la
maltosa-fosforilasa o la
trehalosa-fosforilasa, y se dejó reaccionar durante
5 horas a 50ºC. Luego, la enzima se inactivó por calentamiento en
un bañó de agua hirviendo durante 3 minutos. Los sacáridos excepto
los sustratos en la reacción de digestión, se identificaron como
glucosa y glucosa-1-fosfato por
cromatografía líquida de alta resolución. Además, se añadieron 5
unidades (reacción sintética) por 1 g de cada sustrato de la
maltosa-fosforilasa o la
trehalosa-fosforilasa a una disolución mezclada de
sustratos al 1% (P/V), glucosa y
\beta-D-glucosa-1-fosfato
(sal disódica) o
\alpha-D-glucosa-1-fosfato
(sal disódica), en tampón Tris/HCl 10 mM (pH 7,0), y se dejó
reaccionar durante 5 horas a 50ºC. Luego, la mezcla de reacción se
trató y la composición de azúcar se determinó como se describe
anteriormente. Como resultado, se detectaron maltosa y trehalosa en
la mezcla de reacción que había contenido glucosa y
\beta-D-glucosa-1-fosfato,
mientras no se detectó disacárido en la mezcla de reacción que
había contenido glucosa y
\alpha-D-glucosa-1-fosfato.
La composición de disacárido en la mezcla de
reacción se determinó como sigue. La reacción de digestión obtenida
después de la inactivación por calor se pasó a través de un filtro
de membrana (0,45 \mum) para separar los materiales insolubles. El
filtrado obtenido se usó como una muestra y se analizó la
composición de azúcar por cromatografía líquida de alta resolución
usando una columna YMC-Pack ODS-AQ
(AQ-304, YMC) y una fase móvil de agua a una
temperatura de columna de 30ºC. La detección se realizó mediante un
refractómetro diferencial.
Las actividades de ambas enzimas se determinaron
usando diversos sacáridos en vez de los sustratos usados en la
medida de actividad (reacción fosforolítica) descrita anteriormente
(maltosa y trehalosa), y se representaron como actividades
relativas. Los resultados se muestran en la Tabla 2.
Los valores óptimos de pH para las reacciones
fosforolítica y sintética se determinaron usando las enzimas
purificadas. Como resultado, se encontró que, como se muestra en la
Fig. 1A, la maltosa-fosforilasa muestra pH óptimo en
un intervalo de pH 7,0 a 7,5 para la reacción fosforolítica
(\bigcirc), y a 6,0 para la reacción sintética (\medbullet).
Además, como se muestra en la Fig. 1B, se encontró que el pH óptimo
de la trehalosa-fosforilasa fue pH 7,0 tanto para
la reacción fosforolítica (\bigcirc) como para la reacción
sintética (\medbullet). El valor de pH se ajustó usando tampón
fosfato 20 mM en la reacción fosforolítica, y usando tampones MES
(pH 5,5 a 6,5), MOPS (pH 6,5 a 7,0), HEPES (pH 7,0 a 8,0) y Tris/HCl
(pH 7,5 a 9,0) en la reacción sintética.
Además, después de tratar ambas enzimas en cada
uno de los tampones durante 10 minutos a 50ºC, las actividades
restantes de las enzimas se determinaron con respecto a la reacción
fosforolítica. Como resultado, como se muestra en la Fig. 2, se
encontró que la maltosa-fosforilasa (\bigcirc) es
estable en un intervalo de pH de 5,5 a 6,5, y la
trehalosa-fosforilasa (\medbullet) es estable en
un intervalo de pH de 6,0 a 9,0. En este caso, el valor de pH se
ajustó usando tampones acetato (pH 5,0 a 5,5), fosfato (pH 6,0 a
8,0) y carbonato (pH 8,9).
Las temperaturas óptimas de ambas enzimas se
determinaron para la reacción fosforolítica y la reacción sintética.
Como resultado, como se muestra en la Fig. 3, tanto la
maltosa-fosforilasa (A, \bigcirc; reacción
fosforolítica, \medbullet; reacción sintética) como la
trehalosa-fosforilasa (B, \bigcirc; reacción
fosforolítica, \medbullet; reacción sintética) mostraron
temperaturas óptimas de 50ºC para la reacción fosforolítica y 50 a
55ºC para la reacción sintética.
Después de tratar la
maltosa-fosforilasa y la
trehalosa-fosforilasa a sus valores estables de pH
(pH 6,0 y 7,0, respectivamente) y diversas temperaturas durante 15
minutos, las actividades restantes de ambas enzimas se determinaron
de una manera convencional comparando con las de enzimas no
tratadas que se almacenaron en un baño de hielo. Como resultado,
como se muestra en la Fig. 4, la
maltosa-fosforilasa (\bigcirc) se inactivó
completamente a 55ºC, y la trehalosa-fosforilasa
(\medbullet) se inactivó completamente a 60ºC.
Las actividades de ambas enzimas se determinaron
en presencia de diversas sales y productos químicos metálicos, y los
resultados se muestran en la Tabla 3 como actividades relativas
basadas en las actividades en ausencia de inhibidor que se considera
como 100%.
mM;
concentración
EDTA; etilendiaminatetraacetato, IAA;
monoyodoacetato, NBS; N-bromosuccinimida,
PCMB; p-cloromercuribenzoato,
PMSF; fluoruro de p-metilsulfonilo, SDS;
dodecilbencenosulfonato sódico.
Los puntos isoeléctricos de ambas enzimas se
determinaron por isoelectroenfoque usando ISOGEL (MFC BioProducto).
Como resultado, la maltosa-fosforilasa tiene un
punto isoeléctrico de 3,8 y la trehalosa-fosforilasa
tiene aquél de 4,5 como se muestra en la Fig. 5.
Los pesos moleculares de ambas enzimas se
determinaron por SDS-PAGE y filtración en gel
usando SEPHACRYL S-200. Como resultado, como se
muestra en la Fig. 6, los pesos moleculares de ambas enzimas se
determinaron como aproximadamente 200.000 daltons por filtración en
gel, mientras SDS-PAGE mostró que la
maltosa-fosforilasa tiene un peso molecular de
aproximadamente 92.000 daltons y la
trehalosa-fosforilasa tiene aquél de 88.000
daltons. Por lo tanto, se espera que cada una de estas enzimas esté
constituida por dos subunidades.
Las propiedades fisicoquímicas mencionadas
anteriormente se muestran en las Tablas 4 y 5 junto con aquellas de
maltosa-fosforilasas y
trehalosa-fosforilasas conocidas.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
A 20 litros de un medio de cultivo que contiene
1% (p/v) de trehalosa, 2% de extracto de levadura (Difco), 0,15% de
fosfato amónico, 0,15% de urea, 1% de cloruro sódico, 0,1% de
fosfato ácido de dipotasio, 0,02% de sulfato de magnesio
heptahidratado y 0,2% de carbonato cálcico (pH 7,5), se añadió 1
litro del cultivo de germen de cepa SH-35 de
Plesiomonas (FERM BP-5144) obtenido cultivando
preliminarmente la cepa en el mismo medio toda la noche, bajo
condición estéril y se cultivó bajo condiciones aeróbicas de 300
rpm de agitación y una grado de aireación de 1 v.v.m. durante 24
horas a 37ºC. El caldo de cultivo obtenido se ensayó para la
actividad de trehalosa-fosforilasa y se encontró
que tenía la actividad de 1,5 unidades por ml. La actividad de
maltosa-fosforilasa se ensayó también, pero fue de
actividad débil.
Entonces, se centrifugó el caldo de cultivo a
12.000 x g durante 10 minutos a 4ºC para obtener aproximadamente
160 g de células (peso húmedo) y 19,5 litros de sobrenadante. El
sobrenadante se concentró con una membrana UF
(YM-30, Romicon) para dar aproximadamente un litro
(aproximadamente 6.400 unidades) de la enzima extracelular
concentrada. La actividad de trehalosa-fosforilasa
en el sobrenadante se midió y se encontró que era aproximadamente
25% (aproximadamente 7,5 x 10^{3} unidades) de la actividad total
(aproximadamente 30 x 10^{3} unidades).
Las células se lavaron suficientemente con tampón
fosfato 10 mM (pH 7,0), se suspendieron en 500 ml del mismo tampón y
se rompieron mediante un ultrasonicador. La actividad fosforolítica
de la trehalosa-fosforilasa se midió de la misma
manera como se describió anteriormente y se encontró que
aproximadamente el 75% (22,5 x 10^{3} unidades) de la actividad
total se contenía en las células.
La cepa SH-35 (FERM
BP-5144) se cultivó de la misma manera que en el
Ejemplo 1 excepto en que, entre los componentes del medio de
cultivo, la trehalosa y el extracto de levadura se reemplazaron con
maltosa y 5% de POLYPEPTON-FC (Nippon Seiyaku Co.,
Ltd.), respectivamente. Se midió la actividad de la
maltosa-fosforilasa y la actividad de la
trehalosa-fosforilasa en el caldo de cultivo y se
encontró que el caldo tenía 0,5 unidades de actividad de
maltosa-fosforilasa y 0,45 unidades de actividad de
trehalosa-fosforilasa por ml, respectivamente.
Luego, el medio de cultivo se centrifugó similarmente para dar
aproximadamente 150 g de células (peso húmedo) y 19,6 litros del
sobrenadante. La actividad de maltosa-fosforilasa
en las células y el sobrenadante se midió y se encontró que, basado
en la actividad total, las células contenían aproximadamente el 78%
de la actividad (aproximadamente 10.000 unidades) y aproximadamente
el 22% de la actividad se contenía en el exterior de las células
(en el sobrenadante del cultivo). Además, aproximadamente el 82% de
la actividad de trehalosa-fosforilasa
(aproximadamente 9.000 unidades) basado en la actividad total, se
contenía en las células y aproximadamente el 18% de la actividad se
contenía en el exterior de las células (en el sobrenadante del
cultivo). El sobrenadante del cultivo se concentró de una manera
similar a la del Ejemplo 1 para dar aproximadamente 1 litro de
enzimas concentradas, y las enzimas concentradas contenían
aproximadamente 1.700 unidades de la
maltosa-fosforilasa y 1.430 unidades de la
trehalosa-fosforilasa.
Se añadieron
trehalosa-fosforilasa intracelular purificada y
maltosa-fosforilasa intracelular purificada
producidas de las mismas maneras que en los Ejemplos 2 y 1 a 10 ml,
de disoluciones de maltosa al 10, 20, 30 y 40% (P/V) en tampón
fosfato 10 mM (pH 6,0) en una cantidad de 5 unidades (actividad
fosforolítica) por 1 g del sustrato, y se dejó reaccionar durante
70 horas a 55ºC. Después que la reacción se completó, las enzimas se
inactivaron calentando las mezclas de reacción a 100ºC durante 5
minutos y se determinaron los contenidos de trehalosa en las mezclas
sacarificadas resultantes. Como resultado, se encontró que se
produjeron 58,2, 58,1, 58,6 y 57,9% de trehalosa basado en el peso
del sustrato.
En lo anterior, la determinación cuantitativa de
trehalosa se realizó como sigue.
Después de diluir una mezcla de reacción
sacarificada, que se inactivó por calentamiento, con agua a 1%
(P/V), se añadieron 0,01 unidades de glucoamilasa (grado puro 30
U/mg, Seikagaku Kogyo Co., Ltd.) a 0,5 ml de la mezcla y se dejó
reaccionar a pH 5,0 durante 1 hora a 50ºC para descomponer
completamente la maltosa no reaccionada en glucosa. Luego, la mezcla
de reacción se calentó en un baño de agua hirviendo a 100ºC durante
5 minutos para inactivar la glucoamilasa. Después de separar los
materiales insolubles con un filtro de membrana UF (0,45 \mum), el
contenido de trehalosa del filtrado resultante se midió por el
método HPLC usando una columna YMC-Pack
ODS-AQ (AQ-304, YMC) y agua como una
fase móvil a una temperatura de columna de 30ºC. La detección se
realizó mediante refractómetro diferencial.
Cinco unidades, cada una por 1 g de los sustratos
de trehalosa-fosforilasa extracelular purificada y
maltosa-fosforilasa extracelular purificada
producidas de las mismas maneras que en los Ejemplos 2 y 1, se
añadieron a 10 ml de disolución al 20% (P/V) de sirope de maltosa
superior (marca registrada; MC-95, Nihon Shokuhin
Kako Co., Ltd, composición en azúcar; 2,5% de glucosa, 95,2% de
maltosa, 0,8% de maltotriosa y 1,5% de maltotetraosa) que contenía
tampón fosfato 5 mM (pH 6,0) y se dejó reaccionar como en el
Ejemplo 6. La trehalosa formada se midió por el método HPLC descrito
anteriormente, y se encontró que correspondía a 54,3% del peso de
los sustratos usados.
De la misma manera que en el Ejemplo 7, se
obtuvieron 1 kg de las células (peso húmedo) que contenían la
trehalosa-fosforilasa y la
maltosa-fosforilasa. Las actividades enzimáticas
fosforolíticas de ambas enzimas se midieron de una manera
convencional y se encontró que las células tenían 55 unidades/g
(peso húmedo) de actividad de trehalosa-fosforilasa
y 68 unidades/g (peso húmedo) de actividad de
maltosa-fosforilasa. A 250 litros de una disolución
de maltosa al 30% (P/V) en tampón fosfato 10 mM (pH 6,5), se añadió
1 kg de las células producidas y se dejó reaccionar durante 80 horas
a 50ºC. Después de separar las células por centrifugado, una parte
del sobrenadante resultante se trató con glucoamilasa y su
composición de azúcar de ensayó por HPLC. Como resultado, se
encontró que la composición fue 58,1% de trehalosa, 39,6% de
glucosa y 2,3% de
glucosa-1-fosfato.
A 240 litros del sobrenadante sacarificado
obtenido (contenido sólido; 72 kg), se añadió 0,1% de glucoamilasa
en bruto (marca registrada; SUMIZYME #3000,
Shin-Nippon Kagaku Co., Ltd.) basada en el contenido
sólido y se permitió la sacarificación de nuevo a pH 5,5 durante 20
horas a 55ºC para hidrolizar sustancialmente toda la maltosa
restante en glucosa. Luego, se purificó por técnicas convencionales
incluyendo decoloración por carbón activo y desionización con
resinas de intercambio de iones y concentración a presión reducida
para dar una mezcla sacarificada purificada (contenido sólido;
aproximadamente 65 kg) de una concentración de aproximadamente 75%
(P/V).
Según el presente invento, se proporciona un
nuevo microorganismo capaz de producir
maltosa-fosforilasa y
trehalosa-fosforilasa, que se requieren para la
producción enzimática de trehalosa, intracelular y
extracelularmente. Como el microorganismo del presente invento es
una bacteria, las enzimas pueden obtenerse a partir de sus células
más fácilmente que a partir de algas verdes, Basidiomicetes y
similares que se han conocido como fuentes de
trehalosa-fosforilasa y, además, el periodo de
cultivo puede acortarse marcadamente y por lo tanto, el
microorganismo es ventajoso económicamente. Además, el
microorganismo del presente invento también es ventajoso con
respecto al hecho de que el único tipo de la bacteria puede producir
simultáneamente dos tipos de las enzimas requeridas para la
producción enzimática de trehalosa.
Además, como ambas enzimas del presente invento
satisfacen las propiedades requeridas para la producción enzimática
de trehalosa, hacen muy fácil utilizar eficazmente la trehalosa
producida y aseguran la mejora extraordinaria de la eficacia
económica. Por ejemplo, como la maltosa-fosforilasa
y la trehalosa-fosforilasa del presente invento
muestran alta estabilidad térmica y por lo tanto son capaces de
catalizar las reacciones a alta temperatura, la contaminación
microbiana durante las reacciones puede evitarse eficazmente.
Además, como ambas enzimas tienen intervalos óptimos de pH
similares para sus acciones, pueden eliminar ventajosamente la
necesidad del molesto control de pH durante la reacción.
Además, según el presente invento, la trehalosa
puede producirse enzimáticamente usando las nuevas
maltosa-fosforilasa y
trehalosa-fosforilasa.
Por lo tanto, en el procedimiento para producir
trehalosa según el presente invento, el control de pH es muy fácil
y es posible obtener un alto rendimiento de trehalosa incluso con
una alta concentración de sustrato (maltosa). Además, es posible
usar una alta temperatura de reacción y, seleccionando una alta
temperatura de reacción, puede obtenerse trehalosa con un alto
rendimiento. Además, como la reacción enzimática es posible a una
alta temperatura, la contaminación microbiana puede eliminarse
durante la reacción.
Claims (12)
1. Un microorganismo (FERM
BP-5144) que tiene una capacidad para producir
maltosa-fosforilasa y
trehalosa-fosforilasa y que pertenece al género
Plesiomonas.
2. Maltosa-fosforilasa obtenible
a partir del microorganismo FERM BP-5144, que tiene
las siguientes propiedades fisicoquímicas;
(a) Acción:
Escinde enlaces
\alpha-1,4-glucopiranosídicos en
maltosa por fosforólisis en presencia de fosfato para producir
glucosa y
\beta-D-glucosa-1-fosfato
y viceversa,
(b) Especificidad de sustrato (reacción
fosforolítica):
Actúa sobre maltosa, no sobre otros
disacáridos,
(c) pH óptimo e intervalo estable de pH:
pH óptimo para la reacción fosforolítica de 7,0 a
7,5 y pH óptimo para la reacción sintética de 6,0; y estable dentro
de un intervalo de pH de 5,5 a 7,0 bajo calentamiento a 50ºC
durante 10 minutos,
(d) Estabilidad térmica:
Estable hasta 45ºC bajo calentamiento a pH 6,0
durante 15 minutos,
(e) Intervalo óptimo de temperatura para la
acción:
Temperatura óptima para la reacción fosforolítica
de alrededor de 50ºC y temperatura óptima para la reacción sintética
de 50 a 55ºC,
(f) Inactivación:
Se inactiva completamente a pH 5,0 y 8,0
calentando a 50ºC durante 10 minutos y también se inactiva
completamente a 55ºC calentando a pH 6,0 durante 15 minutos,
(g) Inhibición:
Es inhibida por cobre, mercurio, cadmio, zinc,
N-bromosuccinimida,
p-cloromercuribenzoato o dodecilbencenosulfonato
sódico,
(h) Punto isoeléctrico determinado por
isoelectroenfoque:
3,8, y
(i) Peso molecular medido por electroforesis en
gel de SDS poliacrilamida:
Aproximadamente 92.000 daltons (peso molecular
medido por filtración en gel es aproximadamente 200.000 daltons y la
enzima está constituida por dos subunidades).
3. Trehalosa-fosforilasa
obtenible a partir de microorganismo FERM BP-5144,
que tiene las siguientes propiedades fisicoquímicas;
(a) Acción:
Escinde enlaces
\alpha-1,1-glucopiranosídicos en
trehalosa por fosforólisis en presencia de fosfato para producir
glucosa y
\beta-D-glucosa-1-fosfato
y viceversa,
(b) Especificidad de sustrato (reacción
fosforolítica):
Actúa sobre trehalosa, no sobre otros
disacáridos,
(c) pH óptimo e intervalo estable de pH:
pH óptimo para la reacción fosforolítica y la
reacción sintética de 7,0; y estable dentro del intervalo de pH de
6,0 a 9,0 bajo calentamiento a 50ºC durante 10 minutos,
(d) Estabilidad térmica:
Estable hasta 50ºC bajo calentamiento a pH 7,0
durante 15 minutos,
(e) Intervalo óptimo de temperatura para la
acción:
Temperatura óptima para la reacción fosforolítica
y la reacción sintética es 50 a 55ºC,
(f) Inactivación:
Se inactiva completamente a pH 5,0 a 9,5
calentando a 50ºC durante 10 minutos y también se inactiva
completamente a 55ºC calentando a pH 7,0 durante 15 minutos,
(g) Inhibición:
Se inhibe por cobre, mercurio, cadmio, zinc,
N-bromosuccinimida o
p-cloromercuribenzoato,
(h) Punto isoeléctrico determinado por
isoelectroenfoque:
4,5, y
(i) Peso molecular medido por electroforesis en
gel de SDS poliacrilamida:
Aproximadamente 88.000 daltons (peso molecular
medido por filtración en gel es aproximadamente 200.000 daltons y la
enzima está constituida por dos subunidades).
4. Un procedimiento para producir
maltosa-fosforilasa y
trehalosa-fosforilasa que comprende cultivar el
microorganismo según la reivindicación 1, dejar al microorganismo
producir y acumular al menos una de las
maltosa-fosforilasas según la reivindicación 2 y la
trehalosa-fosforilasa según la reivindicación 3, y
recuperar la(s) enzima(s).
5. Un procedimiento según la reivindicación 4, en
donde el microorganismo se cultiva en presencia de maltosa como una
fuente de carbono y se deja producir y acumular la
maltosa-fosforilasa y la
trehalosa-fosforilasa.
6. Un procedimiento según la reivindicación 4, en
donde el microorganismo se cultiva en presencia de trehalosa como
una fuente de carbono y se deja producir preferencialmente y
acumular la trehalosa-fosforilasa.
7. Un procedimiento según la reivindicación 4, en
donde las células microbianas cultivadas se separan del medio de
cultivo y se usan como enzimas en bruto de la
maltosa-fosforilasa y/o la
trehalosa-fosforilasa como son.
8. Un procedimiento según la reivindicación 4, en
donde las células microbianas cultivadas se separan del medio de
cultivo y las enzimas en bruto de la
maltosa-fosforilasa y/o la
trehalosa-fosforilasa se extraen de las células
separadas.
9. Un procedimiento según la reivindicación 4, en
donde las células microbianas cultivadas se separan del medio de
cultivo y el sobrenadante de cultivo resultante se usa como enzimas
en bruto de la maltosa-fosforilasa y/o la
trehalosa-fosforilasa.
10. Un procedimiento para la producción de
trehalosa, en donde la maltosa-fosforilasa según la
reivindicación 2 y la trehalosa-fosforilasa según la
reivindicación 3 se dejan actuar sobre la maltosa en presencia de
fosfato.
11. Un procedimiento según la reivindicación 10,
en donde la maltosa-fosforilasa y la
trehalosa-fosforilasa son enzimas intracelulares o
enzimas extracelulares obtenidas cultivando los microorganismos
según la reivindicación 1.
12. Un procedimiento según la reivindicación 10 u
11, en donde las reacciones enzimáticas se llevan a cabo en un
intervalo de temperatura de 30 a 65ºC.
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