CN1134980A - 邻单胞属新菌株及由其产生的酶和该酶的制法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及在用酶生产海藻糖时需要的，具有麦芽糖磷酸酶及海藻糖磷酸酶生产能力的邻单胞菌属的新微生物，从该微生物得到的新的麦芽糖磷酸酶及海藻糖磷酸酶以及这些酶的制造方法。本发明还涉及使用酶法的生产海藻糖的新的制造方法。

Description

邻单胞属新菌株及由其产生的酶和该酶的制法与应用
本发明涉及新的微生物、新的酶以及新酶的制造方法。更详细地说是涉及在用酶生产海藻糖时需要的，具有麦芽糖磷酸酶及海藻糖磷酸酶生产能力的邻单胞菌属(plesiomonas)属的新微生物、从该微生物得到新的麦芽糖磷酸酶及海藻糖磷酸酶以及这些酶的制造方法。
进而，本发明涉及使用酶法的生产海藻糖(O-α-D吡喃葡萄糖基-(1→1)-D-吡喃葡萄糖苷的新的制造方法。
进而，更详细地说是涉及是使用来自属于邻单胞菌属(plesiomonas)的新微生物的新麦芽糖磷酸酶及海藻糖磷酸酶而制造海藻糖的方法。
海藻糖是在医药、化妆品、食品等方面有着广泛前途的物质。因此，对于海藻糖和工业生产性进行了很多的试验。这些的技术大致分为三类。
其一是从具有将海藻糖积蓄到菌体内性质的微生物中提取精制该物质的方法[Journal of American.Chemical.society(72卷，2059页、1950年、德国专利第266584号、特开平3-130084号、特开平5-91890号、特开平5-184353号、特开平5-292986号]。这些方法是由微生物的培养工序、微生物的分离工序、从微生物提取海藻糖的工序、提取的海藻糖的精制结晶化工序构成的，其制造工程非常烦杂。而且海藻糖的生产率与其他方法比较不仅少，并且有多量的微生物提取残渣作为废物而存留下来，所以不能说是经济的高效率方法。
此外，作为其他的方法，发现了在菌体外(培养基中)生产海藻糖的微生物，开发出了培养短颈细菌(Brevibacterium)属和棒状杆菌(Corynebacterium)属等的微生物，在菌体外(培养基中)生产海藻糖的发酵法[特开平5-211882号]。可是本方法中，由于海藻糖向培养基中的积蓄率约为3％(w/v)程度的低收率，所以存在着工业规模上要大量生产海藻糖而需要大容量的发酵槽和与此相配套的精制设备而带来的经济问题。而且在本方法中，为了得到精制的海藻糖不仅需要除菌操作，而且在培养使用菌株时，需要除去生产海藻糖以外的夹杂物或者除去培养基成分等的烦杂工序。
另一方面，为了一次性地解决这些发酵法中的种种问题，已经开发出了酶法。其中已经公开的有使用来自微生物的麦芽糖磷酸酶(MaHose：Orthophosphateβ-D-glucosyltrans-ferase)和来自藻类的海藻糖磷酸酶(α，α-Trehalose：orthophosphate β-D-glucosyltransferrase)，在磷酸存在下与麦芽糖作用而生产海藻糖的方法(特许第1513517号、Agri.Biol.Chem.，49卷，2113页，1958年)、以及使来自细菌的蔗糖磷酸酶(Sucrose：orthophosphateα-D-glucosy-ltransferase)和来自担子菌的海藻糖磷酸酶(α，α-Trehalosep：orthophosphateaα-D-glncosyltranferase)在磷酸存在下与蔗糖作用得到海藻糖的方法(平成6年度日本农艺化学会大会讲演要旨集、3Ra14)。
按照这些方法可以从麦芽糖或蔗糖中以60-70％的高收率生产海藻糖。此外，本方法使用的原料由于是精制了的高纯度糖质，所以可以认为由酶反应得到的海藻糖的精制也很容易，与其他方法相比更利于工业生产的方法。可是，这些方法中使用酶，特别是海藻糖磷酸化酶的供给源是裸藻属或奇果菌属类的藻类和担子菌，要从这些物质生产酶，不仅在经济上存在问题，而且在技术上也存在着困难。而且，得到的海藻糖磷酸酶和与其组合使用的蔗糖磷酸酶以及麦芽糖磷酸酶，每个酶的最佳pH领域有很大的不同，所以不仅组合使用时的pH管理非常困难，而且对于温度的稳定性也非常低，海藻糖的生成反应只能在25-37℃的低温下进行。这样在使用开放型的反应槽进行酶反应时，会引起杂菌污染，为了防止由此发生的付反应就需要严密的卫生管理。进而组合使用这些公知的酶时，由于存在着与这些酶的基质浓度的依赖性，所以不能使用高浓度的原料。为此，这种方法也不能说是经济且效率高的方法。
从以上事实可以看出，如果能发现制造及精制容易、而且且高的热稳定性、不依赖基质浓度的新麦芽糖磷酸酶以及海藻糖磷酸酶的话，就可以以容易且大量能得到以麦芽糖为原料，高收率地、容易地、且高效率地制造海藻糖。
因此，本发明的第1个目的在于提供能满足上述各种条件的新酶、可以高生产效率生成麦芽糖磷酸酶及海藻糖磷酸酶的新微生物。
本发明的第2个目的在于提供制造及精制容易、而且具高的热稳定性、不依赖于基质浓度的新麦芽糖磷酸酶及海藻糖磷酸酶。
进而，本发明的第3个目的在于提供使用上述微生物，可以简单且高收率地得到上述2种酶的制造方法。
另外，本发明的第4个目的在于使用满足上述各种条件的新麦芽糖磷酸酶及海藻糖磷酸酶，而且使用麦芽糖作为基质，提供能够在比较高的温度及比较高的基质浓度下进行酶反应、且pH的调节容易的海藻糖的制造方法。
本发明者们为了得到工业上使用的麦芽糖磷酸酶及海藻糖磷酸酶，并且生产具有这些各种性质酶能力的微生物，广泛地检索了自然界。其结果，发现属于邻单胞菌属的微生物可以较大量地生产具备上述条件的两种酶，从而完成了本发明。进而，发现了从属于邻单胞菌属的新微生物得到新的麦芽糖磷酸酶及海藻糖磷酸酶，并通过使用此麦芽糖磷酸酶及海藻糖磷酸酶可以达到上述目的，从而完成了本发明。
即，本发明涉及具有麦芽糖磷酸酶及海藻糖磷酸酶生产能的。属于邻单胞菌属(Plesiomonas)的微生物(生命工学工业技术研究所FERM BP-5144)。
进而，本发明涉及具有以下理化性质的麦芽糖磷酸酶。
(1)作用：
在磷酸存在下可逆地加磷酸分解麦芽糖中的α-1，4-呋喃葡萄糖苷键可生成葡萄糖及β-D-葡萄糖1-磷酸。
(2)基质特异性(分解反应)：
与麦芽糖作用，不与其他二糖类作用。
(3)最佳pH及稳定pH值范围
分解反应的最佳pH是7.0～7.5，合成反应的最佳pH是6.0。在50℃加热10分钟条件下pH5.5～7.0的范围内是稳定的。
(4)对温度的稳定性：
pH6.0下加热15分钟时在45℃之前是稳定的。
(5)作用适当温度的范围：
在50℃附近有分解反应的最佳作用温度，合成反应的作用适当温度是50℃-55℃。
(6)失活条件：
50℃下加热10分钟时，pH5.0及8.0下完全失活，另外pH6.0下处理15分钟，在55℃下完全失活。
(7)抑制：
可被铜、水银、镉、锌、N-溴代丁二酰亚胺、对氯苯甲酸汞、十二烷基苯磺酸钠抑制。
(8)用等电聚焦法的等电离点：
3.8
(9)用SDS聚丙烯酸酰胺电泳法测定的分子量：
约92000(用凝胶过滤法的分子量约是200000、是由两个亚单位构成的)。
进而，本发明涉及具有以下理化性质的海藻糖磷酸酶。
(1)作用：
在磷酸存在下可逆地加磷酸分解海藻糖中的α-1，4-呋喃葡萄糖苷键可生成葡萄糖及β-D-葡萄糖1-磷酸。
(2)基质特异性(分解反应)：
与海藻糖作用，不与其他二糖类作用。
(3)最佳pH及稳定pH值范围
分解及合成反应的最佳pH是7.0，在50℃加热10分钟条件下pH6.0～9.0的范围内是稳定的。
(4)对温度的稳定性：
pH7.0下加热15分钟时在50℃之前是稳定的。
(5)作用适当温度的范围：
分解反应及合成反应的作用适当温度是50℃-55℃。
(6)失活条件：
50℃下加热10分钟时，pH5.0及9.5下完全失活，另外pH7.0下处理15分钟，在55℃下完全失活。
(7)抑制：
可被铜、水银、镉、锌、N-溴代丁二酰亚胺、对氯苯甲酸汞抑制。
(8)用等电聚焦法的等电离点：
4.5
(9)用SDS聚丙烯酸酰胺电泳法测定的分子量：
约88000(用凝胶过滤法的分子量约是200000、是由两个亚单位构成的)。
另外，本发明涉及麦芽糖磷酸酶及海藻糖磷酸酶的制造方法，其特征是培养属于上述邻单胞菌属(Plesiomonas)的本发明微生物，生成、蓄积上述本发明的麦芽糖磷酸酶及上述本发明的海藻糖磷酸酶中至少一种，将其进行采集。
进而，本发明涉及海藻糖的制造方法，其特征是在磷酸存在下，使上述本发明的麦芽糖磷酸酶及海藻糖磷酸酶与麦芽糖进行作用。
以下，对本发明加以说明。
本发明的新菌株是本发明者们，从静冈县富士市田子的浦海岸的污泥中新分离出的。该菌株若按贝格的鉴定手册中Bacteriolgy(Bergey′s Mannual of DeterminativeBacteriolgy)、第8版、第1卷鉴定时，其分离的菌株的菌学各种性质如表1所示，是属于邻单胞菌属(Pleseiomonas)，被鉴定为P.shige-lloides类绿菌。
可是，VP试验及脲酶是阳性，以及可以同化D-甘露糖、D-半乳糖、L-阿拉伯糖、D-果糖、并且在pH9的碱性条件下，也可以生长，从这一点看，与上述记载内容不同，而且在菌体内及培养基中(菌体外)生成、蓄积海藻糖磷酸酶及麦芽糖磷酸酶的这一点上，与已知菌株有很大差异。
另外，上述菌株邻单胞菌属SH-35以寄存于FERM BP-5144寄存在工业技术院生命工学工业技术研究所中。
[表1]
麦芽糖磷酸酶及海藻糖磷酸酶生产菌株的菌学的性质
1.形态学的性质形状大小(μm)运动性胞子 杆菌(0.6～0.7)×3有(极鞭毛)不制作
2.在各种培养基中的生长肉汁液体培养肉汁琼脂平板培养肉汁琼脂斜面培养肉汁明胶穿刺培养石蕊牛奶肉汁液体培养(5％NaCl)(7％NaCl) 无菌环、白浊周边不规则、扁平状、颜色白浊扩布状不液化明胶不生成酸、不凝固生长不生长
3.生长的pH和温度生长pH生长温度(℃) 6.0～9.015～45
 4.生物化学的性质硝酸盐的还原脱氮反应VP试验MR试验吲哚的生成硫化氢的生成淀粉的加水分解柠檬酸的利用明胶的液化酪蛋白的分解无机氮源的利用色素的生成脲酶试验过氧化氢酶试验氧化酶的试验DNaseNTPascOF试验对氧的要求GC含量 -++-±-----+-+++--发酵需氧的(厌氧条件下也生长)49.1摩尔％
5.糖的同化性 同化D-葡萄糖、D-半乳糖、D-甘露糖、L-阿拉伯糖、L-山梨糖、D-果糖、D-核糖、D-木糖、麦芽糖、海藻糖。另外，通过L-阿拉伯糖、L-山梨糖、D-果糖、D-核糖、D-木糖可生成酸，而不生成气体。
本发明的新菌株进行如下的筛选。首先，将采集海岸污泥悬浮在调理食盐水中，将1滴该悬浮液涂抹在下述组成的琼脂培养基上。使用的琼脂平板培养基含有琼脂2％(w/v)、海藻糖或麦芽糖1％、多胨0.5％、酵母提取物0.5％、磷酸氢二钾0.1％、硫酸镁·7水合盐0.02％。这样，在37℃下需氧地培养琼脂平板，得到平板上显现的各菌落，在除去琼脂的上述组成的液体培养基中，在37℃下，以180r.p.m振荡培养各各菌落24-72小时。接着，在12,000×g、4℃下离心分离各培养液10分钟，分离成菌体和上清液。将这样得到的菌体悬浮在少量的0.1M磷酸缓冲液(7.0)中，用下述方法测定活性。其结果，可分离具有上述菌学的各种特性的菌株。
本发明的新微生物是生产新麦芽糖磷酸酶及海藻糖磷酸酶的细菌。下面，对于这些酶的制造方法加以说明。
将本发明的微生物(FERM-5144)接种到适当的培养基上，并进行培养。培养是从该菌体生长温度观点看，取25～42℃的温度范围，需氧地培养8～70小时是适当的。通过培养本发明的微生物，可生成本发明的海藻糖磷酸酶和/或麦芽糖磷酸酶。生成酶的大部分蓄积在菌体内，一部分蓄积在菌体外(培养基中)。因此，采集生成蓄积在菌体内或菌体外(培养基中)的麦芽糖磷酸酶和/或海藻糖磷酸酶。另外，上述培养也可通过间歇式、连续式中的任何一种来进行。
对于上述培养所用的培养基加以说明。作为碳源，可以使用有海藻糖及麦芽糖及含有它们的糖质。作为氮源，使用各种有机及无机的氮化物，进而，培养基可以含有各种无机盐。
若作为碳源，使用海藻糖或含有该物质的糖质时，本发明的微生物可优先地生产海藻糖磷酸酶。另外，若以麦芽糖或含有该物质的糖质作为碳源时，本发明的微生物可同时生产麦芽糖磷酸酶及海藻糖磷酸酶。但是，此时，海藻糖磷酸酶的生产量，与使用海藻糖作为碳源时相比较，有变少的趋势。进而，若同时使用海藻糖及麦芽糖两者或含有这些物质的糖质作为碳源时，则可同时生产海藻糖磷酸酶及麦芽糖磷酸酶，用控制海藻糖及麦芽糖的量，可控制海藻糖磷酸酶及麦芽糖磷酸酶的生成比例。
另外，作为氮源可以使用玉米淀粉(コ-ンスチ-プリカ-、)大豆渣、或各种胨类等有机氮源，也可使用硫酸铵、硝酸铵、磷酸铵、尿素等的无机氮源等的一般用于微生物培养的廉价化合物。另外，也可用尿素及有机氮源作为碳源。
作为适合于本发明方法中使用的培养基，例如想优先生产海藻糖磷酸酶时，使用含有海藻糖1～2％(w/v)、酵母提取物2％、磷酸铵0.15％、尿素0.15％、食盐1％、磷酸氢二钾0.1％、硫酸镁·7水合盐0.02％及碳酸钙0.2％的pH7.0～7.5的液体培养基是适当的。另外，若想同时生产麦芽糖磷酸酶及海藻糖磷酸酶时，使用含有麦芽糖1～2％(w/v)，多胨S(日本制药制)2～3％、磷酸胺0.15％、尿素0.15％、食盐1％、磷酸氢二钾0.1％、硫酸镁·7水合盐0.02％及碳酸钙0.2％的液体培养基是适当的。
另外，如上所述，若以麦芽糖作为碳源使用，不仅能生产麦芽糖磷酸酶，而且也生产一定量的海藻糖磷酸酶。因此，为了得到海藻糖生产用的粗酶(麦芽糖磷酸酶及海藻糖磷酸酶的混合物)，以麦芽糖作为碳源来使用是方便且经济的。
培养菌体内或培养上清液中蓄积的各种酶可以用常法进行分离。首先，菌体内的酶可以以每个菌体作为粗酶来使用。进而，从菌体萃取酶，也可以回收粗酶。另外，菌体外的培养上清液中也含有酶，也可将分离了菌体的残余培养液作为粗酶含有液加以利用。
进而，这些粗酶，可使用通过乙醇、丙酮、异丙醇等的溶剂沉淀法、硫酸铵分级法、离子交换色谱分析法、凝胶过滤色谱分析法等通常的方法，进行精制。进而，麦芽糖磷酸酶及海藻糖磷酸酶的分离，由于两者的等电离点不同，所以可通过阴离子交换色谱法进行。
这样得到的本发明的酶，如下述实施例中详细说明的那样，是具有上述理化性质的麦芽糖磷酸酶及海藻磷酸酶。
这些酶的活性测定，由于本发明的邻单胞菌属SH-35株不生产加水分解的麦芽糖及海藻糖的α-葡糖苷酶(麦芽糖酶)、葡萄糖淀粉酶，海藻糖酶等，所以在用加磷酸分解反应进行测定时，可以适用分别以麦芽糖或海藻糖作为基质，在磷酸盐存在下，使其进行酶反应，用葡糖氧化酶法测定生成的葡萄糖的简便方法。另外，合成反应，以β-D-葡萄糖-1-磷酸和葡萄糖的混合液作为基质，并能够用常法测定通过酶反应生成的无机磷酸。
酶活性测定方法
(1)分解反应：
在50mM的磷酸缓冲液(pH7)中溶解了20mM的麦芽糖或海藻糖的溶液0.5ml中，添加酶液0.01ml，在50℃下使其反应15分钟后，在沸腾水浴中加热3分钟后，终止酶反应。接着，在流水中冷却后，用葡糖氧化酶法(和光纯药工业(株)制、葡萄糖C-II试验·和光)测定生成的葡萄糖。在此，1单位的酶活性是将在相同条件下，在1分钟内，以1μmole(微摩尔)的葡萄糖作为生成的酶量。
(2)合成反应：
在70mM的HEPES缓冲液(pH7.0)中溶解了的27mM的β-D-葡萄糖-1-磷酸钠盐和同浓度的葡萄糖的混合溶液0.15mM中，添加0.05ml的酶液，在50℃下使其反应15分钟后，在沸腾水浴中加热2分钟后终止酶活性。接着，用和光纯药工业(株)制P-试验和光测定生成的无机磷酸。在此，1单位的酶活性是，在同上条件下，1分钟内，以1摩尔(μmole)的无机磷酸作为生成的酶量。
作为本发明的新酶的麦芽糖磷酸酶及海藻糖磷酸酶；可分别作为粗酶或精制酶来利用。进而，也可以将具有两酶活性的菌体及将该菌体包括、吸附或化学地结合在适当的载体上的固定菌体用于例如制造海藻糖。进而，本发明的酶也可作为用公知的方法进行固定的各种酶的固定酶来使用。
本发明的海藻糖的制造方法，是在磷酸存在下，使上述2种酶与麦芽糖作用的方法。磷酸是麦芽糖加磷酸进行分解所必要的，反应液中取0.1～500毫摩尔/升、优选的是5～10毫摩尔/升的浓度范围是适宜的。作为磷酸，例如可以使用正磷酸、磷酸钠、磷酸钾、磷酸二氢钠、磷酸二氢钾等的无机磷酸及其盐等。另外，作为基质，使用麦芽糖。但是，麦芽糖可以是精制品，或者也可以是含有麦芽糖的糖质。麦芽糖浓度，从容易操作的粘度的溶液，及每次加料的收量即所谓经济性的观点看，取10～600克/升、优选的是200～400克/升的范围是适宜的。
酶的浓度可以考虑海藻糖的生成率及反应时间等而适当地决定。但是，通常取0.1～50单位/g-基质为适宜。反应温度可考虑酶的最佳温度及反应时间等而适当地决定，但若考虑防止杂菌污染，取30～65℃、优选的为45～55℃范围是适宜的。另外，反应pH，若考虑酶的最佳pH，取5.0～9.0，优选的是6.0～7.0的范围是适宜的。反应时间可根据海藻糖的生成率、酶的添加量、反应容器的容量来适宜地决定。但是，一般，在工业规模时，50～80小时的范围是适宜的。
麦芽糖磷酸酶及海藻糖磷酸酯，可以分别作为粗酶或精制酶加以利用。进而，也可使用具有两酶活性的菌体及将该菌体包括、吸附或化学地结合于适当的载体中的固定菌体。进而，也可作为用公知的方法固定的各种酶的固定酶来使用。例如，可以使用用海藻酸及K-角叉薄聚糖固定菌体或将提取酶吸附在阴离子交换树脂上的。
通过上述反应生成的海藻糖，与淀粉糖的精制方法相同地，可以通过硅藻土过滤、用离子交换树脂进行脱盐、用离子交换色谱分析法的分级、浓缩、结晶化而进行分离精制。
[实施例]
以下，用实施例进一步说明本发明。
实施例1
菌体内及菌体外麦芽糖磷酸酶的制造及精制
将邻单胞菌属SH-35株(FERM BP-5144)接种在含有麦芽糖1％(w/v)、多胨S(日本制药制)2％、磷酸铵0.15％、尿素0.15％、食盐1％、磷酸氢二钾0.1％、硫酸镁·七水合盐0.02％及碳酸钙0.2％的pH7.0的液体培养基上。接着，将该液体培养基，在37℃下需氧地培养24小时。将得到的培养液，在4℃下，以12,000×g离心分离15分钟，分开菌体及上清液。将得到的菌体悬浮在少量的20mM磷酸缓冲液(pH7.0)后，用超声波菌体破碎机破坏菌体。然后，在该破碎菌体悬浮液中，加入硫酸铵，作成30％饱和液，在4℃下放置一夜。接着，进行离心分离、除去沉淀物，在得到的上清液中进一步加入硫酸铵，作成70％饱和液。在4℃下放置一夜，以离心分离收集生成的沉淀物，使其溶解在20mM磷酸缓冲液(pH7)后，用上述相同缓冲液进行充分的透析。
接着，在用上述相同缓冲液进行平衡了的DEAE-付拉克特凝胶(默克社制)柱中通入上述液体，以吸附酶。用含在上述相同缓冲液中所含的OM到0.6M的食盐浓度梯度法洗脱出吸附了的酶后，用UF腊(阿米康社制、YM-30)进行浓缩。浓缩酶，用含有0.2M食盐的上述相同缓冲液平衡了的赛法克利尔(セファケリル)S-300(弗尔马西亚社制)柱，用凝胶过滤色层(分离)法进行精制。收集得到的活性成分，用含有1.5M硫酸铵的上述相同缓冲液充分地透析后，通入到用含有1.5M硫酸铵的上述相同缓冲液平衡了的费尼尔·特约帕尔(东曹社制)柱中，以吸附酶。用在上述缓冲液中所的从1.5M到0M的硫酸铵浓度梯度法洗脱出吸附了的酶后，收集得到的活性成分，用含有0.2M食盐的上述缓冲液充分地进行透析。用上述的UF膜浓缩后，用含有0.2M食盐的上述缓冲液平衡了的斯帕第克斯200(弗尔马西亚社制)再次进行凝胶过滤色层(分离)法，并用上述方法浓缩得到的活性成分后，用聚丙烯酰凝胶园片电泳法(PAGE)及SDS-PAGE法，可得到均匀的菌体内麦芽糖磷酸酶精制酶(5ml、约2,800单位、活性收率约28％)。
另外，对于菌体外酶，也以培养上清液作为初始原料，用与上述方法相同的方法进行精制浓缩，以活性收率约25％(5ml、约425单位)得到麦芽糖磷酸酶的精制酶。
实施例2
菌体内及菌体外海藻糖磷酸酶的制造及精制
将邻单菌属SH-35株(FERM BP-5144)接种在含有海藻糖1％(w/v)、酵母提取物2％、磷酸铵0.15％、尿素0.15％、食盐1％、磷酸氢二钾0.1％、硫酸镁·七水含盐0.02％及碳酸钙0.2％的pH7.0的液体培养基上。将该液体培养基与实施例1相同地进行培养，经过后处理，得到菌体破碎液及上清液。对于得到的菌体破碎液和上清液，分别用与实施例1相同的方法进行精制。用PAGE法及SDS-PAGE法，分别以活性收率35％(5ml、约7,880单位)及32％(5ml、约2,400单位)得到均匀的菌体内海藻糖磷酸酶及菌体外海藻糖磷酸酶。
实施例3
邻单胞菌属SH-35株生产的麦芽糖磷酸酶及海或糖磷酸酶的酶化学的各种性质
关于本发明邻单胞菌属SH-35株(FERM BP-5144)生产的新的麦芽糖磷酸酶及海藻糖磷酸酶的一般的酶化学特性，使用以与实施例1及2相同的方法精制得到的精制酶进行研究，其结果如下所示。另外，予实验结果，由于在菌体内及菌体外两种酶显示了大致相同的物理化学的各种性质，所以在此，表示了菌体内酶的各种性质。
(1)作用
在10mM磷酸缓冲液(pH7.0)中溶解了1％(w/v)的麦芽糖及海藻糖溶液中，对于1g基质分别添加5单位(分解反应)的麦芽糖磷酸酶及海藻糖磷酸酶，在50℃下反应5小时后，在沸水浴中加热3分钟，用高速液体色谱法测定酶失活后而得到的糖化液中的糖。其结果分别检测出葡萄糖及葡萄糖-1磷酸。另外，在以10mM的三羟甲基氨基甲烷(Tris)盐酸缓冲液(pH7.0)中溶解了的1％的(w/v)的葡萄糖及β-D-葡萄糖-1磷酸钠盐或者α-D-葡萄糖-1磷酸钠盐的混合溶液作为基质，对于1g基质，分别添加5单位麦芽糖磷酸酶及海藻糖磷酸酶，在50C下反应5小时后，如上述那样进行处理，测定其糖组成的结果，从葡萄糖及β-D-葡萄糖-1磷酸盐分别检测出麦芽糖磷酸酶及海藻糖磷酸酶，但没检测出来自葡萄糖及α-D-葡萄糖-1磷酸盐的二糖类的合成反应。
用以下方法进行生成糖的分析。即，以用0.45μm的薄膜过滤器过滤加热失活得到的糖化液中的不溶物所得到的滤液作为供试验糖液，使用YMC-Pack、ODS-AQ(AQ-304、YMC社制)柱的高速液相色谱分析法进行测定。另外，在移动相中使用水，柱温为30℃检测时，使用了差示折射仪。
(2)基质特异性(分解反应)
以各种糖类作为基质时的活性作为相对活性来代替以往所述的活性测定法(分解反应)所示的基质(麦芽糖或海藻糖)进行表示。其结果如表2所示。
[表2]
邻单胞菌属SH-35株生产的葡萄糖磷酸酶及海藻糖磷酸酶的基质特异性
基质        相对活性(％)
麦芽糖磷酸酶 海藻糖磷酸酶
麦芽糖海藻糖乳糖蔗糖蜜二糖龙胆二糖纤维二糖异海藻糖曲二糖昆布双糖异麦芽糖麦芽三糖麦芽糖醇异麦芽糖醇麦芽三糖醇     10000000000000000       01000000000000000
(3)最佳pH及稳定pH范围
使用精制酶，测定分解及合成反应的最佳pH。其结果，如图1A所示。麦芽糖磷酸酶的分解反应(用白圈表示)的最佳pH为7.0～7.5，而合成反应(用黑圈表示)是6.0为最佳值。另外，如图1B所示，对于海薄糖磷酸酶，分解反应(白圈)及合成反应(黑圈)都是7.0为最佳值。另外，pH分解反应时，使用20mM磷酸缓冲液进行调节，而在合成反应时，分别使用MES(pH5.5-6.5)、MOPS(pH值6.5～7.0)、HEPES(pH7.0～8.0)、Tris-盐酸(pH7.5～9.0)-的各缓冲液进行调节。
另外，在各缓冲液中，在50℃下处理10分钟精制了的两种酶，以分解反应测定它们的残存酶活性；其结果如图2所示，麦芽糖磷酸酶(白圈)的pH是在5.5～6.5的范围、海藻糖磷酸酶(黑圈)的pH在6.0～9.0范围是稳定的。且pH用醋酸(pH5.0～5.5)、磷酸(pH6.0～8.0)、碳酸(pH8.9)的各缓冲液进行调整。
(4)反应作用适当温度
测定两酶的分解反应及合成反应的作用适当温度的结果，如图3所示，麦芽糖磷酸酶(A.白圈：分解反应、黑圈：合成反应)、海藻糖磷酸酶(B.白圈：分解反应、黑圈：合成反应)，分解反应均是50℃、合成反应均是50～55℃范围。
(5)由于温度引起失活的条件
将麦芽糖磷酸酯及海藻糖磷酸酶，分别在稳定的pH为6.0及7.0的条件下，处理15分钟，将残存的失活与无处理的比较，用常法进行测定。其结果，如图4所示，麦芽糖磷酸酶(白圈)在55℃下，另外，海藻糖磷酸酶(黑圈)在60℃下完全失活。
(6)抑制剂
在各种抑制剂存在下，测定两种酶的合成反应的活性，以无添加时的活性作为100％的相对活性而表示的结果，如表3所示。
[表3]
各种抑制剂对于邻单胞菌属SH-35株生产的麦芽糖磷酸酶及海藻糖磷酸酶的影响
 抑制剂    浓度(mM)          相对活性(％)
麦芽糖磷酸酶 海藻糖磷酸酶
无添加LiClKClNaClBaCl2CaCl2CdCl2CoCl2CuCl2HgCl2MgCl2MnCl2NiCl2FeCl2PbCl2SnCl2ZnCl2FeCl2EDTAIAANBSpCMBPMSFSDS      0111111111111111111111l1     1009899100100103106150891068110711311016861081011111670     10097979399102306190829456949897137910189987461
EDTA(乙二胺四乙酸)，IAA(乙酸-碘)，NBS(N-溴代丁二酰亚胺)，pCMB(对氯苯甲酸汞)，pMSF(P-甲磺酰氟)，SDS(十二烷基苯磺酸钠)
(7)等电离点
通过使用爱索凝胶(FMC Bioproducto社制)的等电聚焦法测定两酶的等电离点的结果，如图5所示，麦芽糖磷酸酶为3.8、海藻糖磷酸酶为4.5。
(8)分子量
通过使用SDS-PAGE法及赛法克利尔(セファケリル)S-200的凝胶过滤法，测定两种精制酶的分子量。其结果，如图6所示，用凝胶过滤法时，两酶的分子量约为200,000，而用SDS-PAGE法时，麦芽糖磷酸酶约为92,000，而且海藻糖磷酸酶约为88,000，所以可以予想这些酶分别是由两个亚单位构成的。
将上述的各种理化性质，与已知的麦芽糖磷酸酶及海藻糖磷酸酶进行比较，归纳在表4及表5中。
[表4]
各种来源的麦芽糖磷酸酶的理化性质
本发明的麦芽糖磷酸酶 Agric，Bio1.Chem.37卷、2813页(1973) 特开平1-91778号
菌    种 Plesiomonas属SH-35株(细菌) Lactobacillusbrevis(细菌) Lactobacillussanfransisco(细菌)
酶的定位性 菌体内及培养上清液     菌体内     菌体内
最佳pH分解反应合成反应 7.0～7.56.0 5.4无记录 5.5无记录
最佳温度分解反应合成反应 50℃50～55℃ 50℃无记录 40～50℃无记录
温度稳定性 pH6.0下，处理15分钟，45℃之前稳定，55℃时完全失活 pH5.4下处理30分钟，35℃之前稳定，50℃时完全失活 处理15分钟，40℃之前稳定，60℃时完全失活
等电离点       3.8     无记录     无记录
分子量SDS-PAGE法凝胶过滤法 约92,000约200,000 约80,000约150,000 无记录约150,000
反应生成的葡萄糖I磷酸 β β β
基质特异性(分解发应) 与麦芽糖作用，与其他二糖类不作用 与麦芽糖作用、与异麦芽糖、麦芽三糖不作用 与麦芽糖作用，与其他二糖类不作用
[表5]
各种来源的海藻糖磷酸酶的理化性质
本发明的海藻糖磷酸酶 Agric，Bio1.Chem.49卷、2113页(1985)     平成6年度农化大会·讲演要旨3Ral4的方法 FEMSMicrobio1.Lett.，55,147(1988)
菌    种 Plesiomonas属sH-35株(细菌)     Euglenagracilis(绿藻类)     Grifolafrondosa(担子菌)     Flammulinavelutipes(担子菌)
酶的定位性 菌体内及培养上清液     菌体内     子实体内 分生胞子及子实体内
最佳pH分解反应合成反应 7.07.0 7.06.0 6.0～7.0无记录 7.06.3
最佳温度分解反应合成反应 50℃50～55℃ 40℃无记录 35～37℃ 30℃
温度稳定性 pH7下，处理15分钟，48℃之前稳定，60℃时完全失活 pH7下，处理30分钟，40℃前稳定 处理30分钟，35℃之前稳定      无记录
分子量SDS-PAGE法凝胶过滤法 约88,000约200,000 无记录344,000 约60,000约120,000 无记录
等电离点      4.5     无记录      无记录      无记录
反应生成的葡萄糖I磷酸 β β α α
基质特异性(分解发应) 对海藻糖作用，对其他二糖类不作用 与海藻糖作用、 与海藻糖作用 与海藻糖作用
实施例4
菌体内及菌体外海藻糖磷酸酶的制造方法
将予先在同上培养基培养一夜得到的邻单胞菌属SH-35株种菌(FERM BP-5144)11，无菌地添加到含有海藻糖1％(w/v)、酵母提取液(Difco社制)2％、磷酸铵0.15％、尿素0.15％、食盐1％、磷酸氢二钾0.1％、硫酸镁·七水合盐0.02％及碳酸钙0.2％的pH7.5的液体培养基201中，在37℃、300rpm、通气量1V.V.m条件下，通过搅拌培养24小时。测定该培养液的海藻糖磷酸酶活性的结果，每1ml培养液的活性为1.5单位。另外，同样地也测定麦芽糖磷酸酶活性，但其活性是微量。
接着，以12,000×g、4℃下，离心分离10分钟，得到约160g的菌体(湿润时)及19.51的上清液，用罗米康(Romicon)社制UF膜(YM-30)浓缩，得到约11(约6,400单位)的菌体外浓缩粗酶。测定上清液中的酶活性结果，有全活性(约30×103单位)的约25％(7.5×103单位)的活性。
另外，对于菌体部分，用10mM的磷酸缓冲液(pH7)充分洗净，悬浮在500ml的同上缓冲液后，用超声波菌体破碎机破碎菌体，用常法测定海藻糖磷酸酶活性结果，全活性的约75％(22.5×103单位)含在菌体内。
实施例5
(含有麦芽糖磷酸酶及海藻糖磷酸酶菌体及菌体外酶的制造)
分别以实施例1所用的培养基成分中的海藻糖代替麦芽糖、用酵母提取液代替多胨FC(日本制药(株)制5％(w/v)，除此之外，用同样的方法培养SH-35株(FERM BP-5144)。测定该培养液的麦芽糖磷酸酶活性及海藻糖磷酸酶活性的结果，每1ml培养液中含有0.5单位的麦芽糖磷酸酶活性及0.45单位的海藻糖磷酸酯酶。接着，同样地进行离心分离，得到约150g的菌体(湿润时)及19.61的上清液。接着，测定菌体及上清液中的麦芽糖磷酸酶活性结果，麦芽糖磷酸酶的全活性的约78％(约10,000单位)含在菌体内，而约22％含在菌体外(培养上清液)。另外，海藻糖磷酸酶的全活性的约82％(约9,000单位)含在菌体内、而约18％含在菌体外。用与实施例1相同的方法，浓缩培养上清液，得到约11的浓缩酶，在该浓缩酶中，含有1,700单位的麦芽糖磷酸酶和1,430单位的海藻糖磷酸酶。
实施例6
在l0ml的10mM磷酸缓冲液(pH6)中溶解了10、20、30及40％(w/v)的各麦芽糖溶液中，对于每1g基质重量，分别添加5单位(分解活性)的，用与实施例2及实施例1相同方法调制的菌体内精制海藻糖磷酸酶及菌体内精制麦芽糖磷酸酶，在55℃下，使其反应70小时。反应结束后，测定在100℃下加热5分钟反应，使酶失活后得到的糖化液中的海藻糖含量。其结果，对于基质重量，分别生成58.2、58.1、58.6、57.9％的海藻糖。
另外，用以下方法进行海藻糖的定量。
即，在加热失活的糖化液中加入水，制得约1％(w/v)后，在该糖化液0.5ml中添加0.01单位的葡糖糖化酶(生化学工业制、纯净级30U/mg)，在50℃、pH5.0下，使其反应1小时，将未反应的麦芽糖完全分解成葡萄糖。接着，在100℃的沸腾水浴中，加热5分钟，使葡糖糖化酶失活后，使用YMC-Pack ODS-AQ(AQ-304、Ymc社制)柱的液相色谱分析法(HPLC法)测定用0.45μm的膜过滤器除去生成不溶性蛋白质后得到的滤液中的海藻糖含量。另外，测定是在移动相使用水、柱温为30℃，检测时使用差示析射仪的条件下进。
实施例7
在10ml的5mM磷酸缓冲液(pH6)中溶解了20％(w/v)的高浓麦芽糖浆液(日本食品化工制、商品名MC-95、糖组成：葡萄糖2.5％、麦芽糖95.2％、麦芽三糖0.8％、麦芽四糖1.5％)中，对每1g基质重量，分别添加5单位的，用与实施例2及1相同的方法调制的菌体外精制海藻糖磷酸酶及菌体外精制的麦芽糖磷酸酶，以下与实施例6相同地进行反应。用HPLC法测定生成的海藻糖结果，对于使用的基质重量是54.3％。
实施例8
用与实施例7相同的方法调制，得到含有海藻糖磷酸酶及麦芽糖磷酸酶的菌体约1kg(湿润时)。用常法测定酶活性(分解活性)，其结果在该菌体中，具有55单位/g(湿润时)的海藻糖磷酸酶及68单位/g(湿润时)的麦芽糖磷酸酶活性。在10mM的磷酸缓冲液(pH6.5)中含有30％(w/v)的麦芽糖溶液2501中，添加1kg调制了的菌体，在50℃下使其反应80小时后，离心分离除去菌体。将得到的上清液的一部分进行葡糖糖化酶处理，用HPLC法测定其糖组成。其结果，海藻糖为58.1％、葡萄糖39.6％、葡萄糖-1-磷酸为2.3％。
接着，在得到的糖化上清液约2401(固态物72kg)中，对于固态物重量，添加0.1％的工业用粗葡糖糖化酶(新日本化学社制、商品名斯密其姆#3,000)，将在pH5.5、55℃下再糖化20小时后残存的麦芽糖、大致完全地加水分解成葡萄糖。接着，用常法，活性炭脱色通过离子交换树脂脱盐等进行精制，在减压下进行浓缩，得到浓度约75％(w/v)的精制糖化液(固态物约65kg)。
本发明的效果
按照本发明，提供在菌体内及菌体外(培养基中)中，可生产得到制造海藻糖时所必要的麦芽糖磷酸酶及海藻糖磷酸酶的新的微生物。由于本发明的微生物是细菌，与作为以往海藻糖磷酸酶来源的已知的绿藻及担子细菌相比较，酶的取得方法不仅容易，而且培养时间也大幅度地缩短，所以是经济的。进而，本发明的微生物也具有一种细菌可同时生产海藻糖的酶的生产必要的两种酶的优点。
另外，本发明的两种酶，由于能满足用酶生产海藻糖时要求的各种条件，所以很容易地有效地利用得到的海藻糖，也能保证在经济上得到大幅度地改善。即，本发明的麦芽糖磷酸酶，及海藻糖磷酸酶由于具有高温稳定性，且在高温下可进行酶反应，所以可避免反应中的杂菌污染。进而，由于两种酶具有大致相同的最佳pH范围，所以具有不需要在反应中进行复杂的pH调节的优点。
进而，按照本发明，使用新的麦芽糖磷酸化酶及海藻糖磷酸化酶，可以用酶法制造海藻糖。
另外，本发明的海藻糖的制造方法，pH的调节是容易的，即使在高基质(麦芽糖)浓度下，也可以高收率得到海藻糖。进而，也可使反应温度变高，选择更高反应温度，可以高收率地得到海藻糖。进而，由于可以在高温下进行酶反应，所以可以避免反应中的杂菌污染。
图的简单说明
图1表示邻单胞菌属SH-35株生产的麦芽糖磷酸酶及海藻糖磷酸酶的反应最佳曲线[符号：分解反应(○)、合成反应(●)]。
图2表示邻单胞菌属SH-35株生产的麦芽糖磷酸酶及海藻糖磷酸酶的pH稳定性[符号：麦芽糖磷酸酶(○)、海藻糖磷酸酶(●)]。
图3表示邻单胞菌属SH-35株生产的麦芽糖磷酸酶及海藻糖磷酸酶的作用适宜温度[符号：分解反应(○)、合成反应(●)]。
图4表示示邻单胞菌属SH-35株生产的麦芽糖磷酸酶及海藻糖磷酸酶的温度稳定性[符号：麦芽糖磷酸酶(○)、海藻糖磷酸酶(●)]。
图5表示邻单胞菌属SH-35株生产的麦芽糖磷酸酶及海藻糖磷酸酶的等电离点。
图6表示邻单胞菌属SH-35株生产的麦芽糖磷酸酶及海藻糖磷酸酶的分子量。

Claims (12)

1.一种属于邻胞菌属(Plesiomonas)的微生物(FERMB)-544)，其具有麦芽糖磷酸酶及海藻磷酸酶的生产能力。
2.一种具有下述理化性质的麦芽糖磷酸酶，
(1)作用：
在磷酸存在下可逆地加磷酸分解麦芽糖在的α-1，4-呋喃葡萄糖苷键可生成葡萄糖及β-D-葡萄糖1-磷酸，
(2)基质特异性(分解反应)：
与麦芽糖作用，不与其他二糖类作用，
(3)最佳pH及稳定pH值范围
分解反应的最佳pH是7.0～7.5，合成反应的最佳pH是6.0。在50℃加热10分钟条件下pH5.5～7.0的范围内是稳定的，
(4)对温度的稳定性：
pH6.0下加热15分钟时在45℃之前是稳定的，
(5)作用适当温度的范围：
在50℃附近有分解反应的最佳作用温度，合成反应的作用适当温度是50℃-55℃，
(6)失活条件：
50℃下加热10分钟时，pH5.0及8.0下完全失活，另外pH6.0下处理15分钟，在55℃下完全失活，
(7)抑制：
可被铜、水银、镉、锌、N-溴代丁二酰亚胺、对氯苯甲酸汞、十二烷基苯磺酸钠抑制。
(8)用等电聚焦法的等电离点：
3.8
(9)用SDS聚丙烯酸酰胺电泳法测定的分子量：
约92000(用凝胶过滤法的分子量约是200000、是由两个亚单位构成的)。
3.一种具有下述理化性质的海藻糖磷酸酶，
进而，本发明涉及具有的下理化性质的海藻糖磷酸酶。
(1)作用：
在磷酸存在下可逆地加磷酸分解海藻糖中的α-1，4-呋喃葡萄糖苷键可生成葡萄糖及β-D-葡萄糖1-磷酸，
(2)基质特异性(分解反应)：
与海藻糖作用，不与其他二糖类作用，
(3)最佳pH及稳定pH值范围
分解及合成反应的最佳pH是7.0，在50℃加热10分钟条件下pH6.0～9.0的范围内是稳定的，
(4)对温度的稳定性：
pH7.0下加热15分钟时在50℃之前是稳定的，
(5)作用适当温度的范围：
分解反应及合成反应的作用适当温度是50℃-55℃，
(6)失活条件：
50℃下加热10分钟时，pH5.0及9.5下完全失活，另外pH7.0下处理15分钟，在55℃下完全失活，
(7)抑制：
可被铜、水银、镉、锌、N-溴代丁二酰亚胺、对氯苯甲酸汞抑制，
(8)用等电聚焦法的等电离点：
4.5
(9)用SDS聚丙烯酸酰胺电泳法测定的分子量：
约88000(用凝胶过滤法的分子量约是200000、是由两个亚单位构成的)。
4.一种麦芽糖磷酸酶及海藻糖磷酸酶的制造方法，其特征是培养权利要求1所述的微生物，生成、积蓄权利要求2所述的麦芽糖磷酸酶以及权利要求3所述海藻糖磷酸酶的至少一种，而后采集。
5.权利要求4所述的制造方法，其中上述培养是在碳源麦芽糖存在下进行，生成积蓄麦芽糖磷酸酶及海藻糖磷酸酶。
6.权利要求4所述的制造方法，其中上述培养是在碳源海藻糖存在下进行，优先地生成积蓄海藻糖磷酸酶。
7.权利要求4所述的制造方法，其中从培养后的培养液中分离菌体，将分离的菌体直接作为麦芽糖磷酸酶和/或海藻糖磷酸酶的粗酶。
8.权利要求4所述的制造方法，其中从培养后的培养液中分离菌体，从分离的菌体提取麦芽糖磷酸酶和/或海藻糖磷酸酶的粗酶。
9.权利要求4所述的制造方法，其中从培养后的培养液中分离菌体，将得到的培养上清液作为麦芽糖磷酸酶和/或海藻糖磷酸酶的粗酶含有液。
10.一种海藻糖的制造方法，其中特征是将权利要求2所述的麦芽糖磷酸酶以及权利要求3所述的海藻糖磷酸酶在磷酸的存在下与麦芽糖作用。
11.权利要求10所述的制造方法，其中麦芽糖磷酸酶及海藻糖磷酸酶是培养权利要求1所述的微生物后而得到的菌体内酶素或菌体外酶素。
12.权利要求10或11所述的制造方法，其中酶反应是在30℃～65℃的温度范围内进行。
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