CN1260004A - 大量产生ε－聚－L－赖氨酸的菌株和生产方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了具有较常规ε－聚－L－赖氨酸产生菌更高的ε－聚－L－赖氨酸生成能力并能提高ε－聚－L－赖氨酸产率的菌株或其改良菌株,以及使用该菌株大量生产ε－聚－L－赖氨酸的方法。根据该生产ε－聚－L－赖氨酸的方法,对属于小白链霉菌、具有ε－聚－L－赖氨酸生成能力的微生物进行诱变处理,以获得可大量产生ε－聚－L－赖氨酸并对浓度为10mg/ml或更高的S－(2－氨基乙基)－L－半胱氨酸具有抗性的菌株,好气条件下在培养基中培养该菌株,收集培养物中形成的ε－聚－L－半胱氨酸。

Description

大量产生ε-聚-L-赖氨酸的菌株和生产方法
发明领域
本发明涉及大量产生ε-聚-L-赖氨酸(以下称εPL)的菌株和利用该菌株发酵生产εPL的方法。
由于εPL是必需氨基酸L-赖氨酸的聚合物，其安全性高，由于其高阳离子含量，其具有独特的物理特性。因此，预期其可用于化妆品、美容用品、饲料添加剂、药剂、杀虫剂、食物添加剂、电子器材等方面。特别是在食物添加剂领域，其作为天然添加剂已受到人们的注意。
背景技术
作为发酵生产εPL的方法，已知有一种方法(审结日本专利公开59-20359)，该方法包括在培养基中培养小白链霉菌lysinopolymerus亚种346-D(FERM P-3834)，该菌株为从自然界分离的产εPL菌株，属于链霉菌属，然后从培养基中分离和纯化εPL。还有另一种已知方法(审结日本专利公开3-42070或审结日本专利公开3-78998)，该方法包括对小白链霉菌lysinopolymerus亚种346-D进行诱变处理，使其转化为对L-赖氨酸类似物S-(2-氨基乙基)-L-半胱氨酸具有抗性的突变体，在培养基中培养所得突变体，即小白链霉菌lysinopolymerus亚种11011A-1(FERMBP-1109)，然后从培养基中分离和纯化εPL。
要生产可满足各种用途的廉价εPL，就εPL产量和葡萄糖转化效率而言，即使使用上述11011A-1菌株也并不令人满意。因此需要获得产εPL能力提高的菌株，和一种使用上述菌株在工业上廉价有效地生产εPL的方法。
发明人已进行了大量研究，试图获得与常规εPL生产菌株相比，εPL生成能力更高的菌株或其突变体。结果，已发现对浓度为10mg/ml或更高的S-(2-氨基乙基)-L-半胱氨酸(以下称为AEC)具有抗性的突变体可能是具有大量生成εPL能力的菌株，通过在培养基中好气培养所述菌株可大量产生εPL。根据这些发现，完成了本发明。
根据以上所述，本发明的目的是提供与常规εPL生产菌株相比，εPL生成能力更高的菌株或其改良菌株，因此能够提高εPL的产率；还提供了利用该菌株大量廉价地生产εPL的方法。
发明内容
本发明包括下列技术内容：
1).能够大量产生ε-聚-L-赖氨酸的菌株，它是通过对属于小白链霉菌、具有ε-聚-L-赖氨酸生成能力的微生物进行诱变处理获得的，对浓度为10mg/ml或更高的S-(2-氨基乙基)-L-半胱氨酸具有抗性。
2).能够大量产生ε-聚-L-赖氨酸的菌株B21021(保藏号FERM BP-5926)，该菌株是通过对小白链霉菌lysinopolymerus亚种11011A-1菌株(FERM BP-1109)进行诱变处理获得的，对浓度为10mg/ml或更高的S-(2-氨基乙基)-L-半胱氨酸具有抗性。
3).生产ε-聚-L-赖氨酸的方法，包括在培养基中好气培养属于链霉菌属、对浓度为10mg/ml或更高的S-(2-氨基乙基)-L-半胱氨酸具有抗性并具有ε-聚-L-赖氨酸生成能力的微生物，收集在培养基中形成和积累的ε-聚-L-赖氨酸。
4).生产ε-聚-L-赖氨酸的方法，包括在培养基中好气培养上述2)中所述B21021菌株，收集在培养基中形成和积累的ε-聚-L-赖氨酸。
用于本发明的AEC是L-赖氨酸的结构类似物(类似物)，其与L-赖氨酸在结构上的区别仅在于4位上硫原子取代了碳原子。向培养基中加入AEC导致微生物生长的抑制，与L-苏氨酸一起使用时，生长抑制更为明显和强烈。
在审结日本专利公开3-42070中公开的菌株11011A-1是εPL产生菌株，其对L-赖氨酸的类似物AEC具有抗性，它是在浓度为2mg/ml的AEC存在下筛选出来的，仅在浓度为5mg/ml或更低的AEC下能生长，AEC浓度达10mg/ml或更高不能生长。
本发明的改良菌株是在AEC浓度为10mg/ml或更高的条件下筛选获得的，是属于链霉菌属的微生物，甚至在AEC浓度为40mg/ml的条件下仍能生长。此外，该改良菌株与亲本菌株1101A-1的菌学特性有部分区别。
属于链霉菌属、能产生εPL的微生物可以作为用来获得改良菌株的亲本菌株。其中，优选小白链霉菌lysinopolymerus亚种11011A-1菌株(FERM BP-1109)。
“诱变处理”在本文中是指引起属于链霉菌属、能产生εPL的微生物(菌株)突变的处理，从而获得对浓度为10mg/ml或更高的AEC具有抗性的改良菌株。诱变处理方法的实例包括加入N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍(以下称NTG)至浓度为每毫升缓冲液0.1到3毫克，使菌株与NTG接触10分钟到2小时的方法；使菌株接受100到1000J/cm2紫外线辐射处理的方法；用5-溴尿嘧啶等化学品处理菌株的方法；和其它常规化学或物理诱变处理方法。
经诱变处理的菌株的筛选方法的实例包括接种菌株至基本琼脂培养基上，每毫升培养基中已加入AEC至浓度为10mg或更高，L-苏氨酸至浓度为1mg，收集在培养基中生长的菌株。
以下详述本发明。
获得本发明对高浓度AEC具有抗性的菌株的说明性实例如下。产εPL菌株小白链霉菌lysinopolymerus亚种11011A-1菌株的孢子悬浮在tris-马来酸缓冲液(pH6.0)中。向悬浮液中加入NTG至1.5mg/ml，孢子和NTG37℃下接触60分钟。所得孢子通过离心分离收集，用磷酸缓冲液(0.05M，pH7.0)洗涤，在液体营养培养基(葡萄糖：5％，硫酸铵：1％，酵母提取物：0.5％，K2HPO4：0.08％，KH2PO4：0.136％，MgSO4·7H2O：0.05％，ZnSO4·7H2O：0.004％，FeSO4·7H2O：0.003％，pH6.8，其中％表示g/dl％)中温育过夜。然后离心收集细胞，用磷酸缓冲液(0.05M，pH7.0)洗涤，在含有20mg/ml AEC和1mg/ml L-苏氨酸的基本琼脂培养基(葡萄糖：5％，硫酸铵：1％，K2HPO4：0.08％，KH2PO4：0.136％，MgSO4·7H2O：0.05％，ZnSO4·7H2O：0.004％，FeSO4·7H2O：0.003％，pH6.8，琼脂：1.5％，其中％表示g/dl％)中铺平板，30℃温育3到4天。收集形成的菌落。评价所得的对高浓度AEC具有抗性的菌株的εPL产率。结果，产率最高的菌株是小白链霉菌lysinopolymerus亚种B21021(通产省工业技术院生命工学工业技术研究所(1-3，Higashi 1-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，305，Japan)，国际保藏号：FERM BP-5926，是在1997年4月18日根据布达佩斯条约由原始保藏(FERM P-15193，原始保藏日：1995年9月20日)转为国际保藏)，其次是菌株B22107和B22201。
对高浓度AEC具有抗性的改良菌株对AEC的抗性如下评价。将每一种抗性菌株接种至基本琼脂培养基(如上述)中，培养基中加入AEC的浓度如下表1所示，L-苏氨酸的浓度为1mg/ml，30℃温育2到7天，肉眼观察生长情况。结果示于表1。亲本菌株11011A-1在AEC浓度为5mg/ml时可观察到生长，但在浓度为10mg/ml时未见生长，而高浓度抗性菌株B21021甚至在AEC浓度为40mg/ml时仍可见到生长。本发明的改良菌株对高浓度AEC具有抗性，在这方面，其可与亲本菌株明确地区分。
                   表1试验菌株    AEC浓度           温育时间(天)
        (mg/ml)    2    3    4    5    6    7B21021         5       +    +    +    +    +    +
           10      +    +    +    +    +    +
           20      +    +    +    +    +    +
           40      -    -    ±       +    +    +B22107         5       +    +    +    +    +    +
           10      +    +    +    +    +    +
           20      +    +    +    +    +    +
           40      -    -    ±       +    +    +B22201         5       +    +    +    +    +    +
           10      +    +    +    +    +    +
           20      +    +    +    +    +    +
           40      -    ±       +    +    +    +11011A-1       5       -    -    ±       ±       +    +亲本菌株       10      -    -    ±       ±       +    +
           20      -    -    -    -   -    -
           40      -    -    -    -   -    -注释：+有生长    ±少量生长    -无生长
以下描述菌株B21021的菌学特性。
1).形态特征
i)孢子菌丝的分支方式和形式：简单分支，封闭螺旋
ii)孢子数量：数十个
iii)孢子表面结构和大小：
孢子各为1.2到1.5μm大小的圆形或椭圆形，具有多刺的表面结构。
iv)无菌毛，菌核和孢子囊未见到
v)孢子顶端粘附部位：气生菌丝
2).培养基中培养特征
表2中示出的各种培养基中的培养特征是在30℃温育10到14天后观察到的结果。
                              表2
         培养基     营养菌丝   气生菌丝 水溶性色素
蔗糖·硝酸盐琼脂培养基     未形成   未形成     无
葡萄糖·天冬氨酸琼脂培养基   白色到浅黄色   棕黄色     无
甘油·天冬氨酸琼脂培养基     浅黄色   白色，粉状     无
  赖氨酸琼脂培养基     浅棕色   白色     棕色
    营养琼脂培养基     黄色   白色少量形成     无
酵母·麦芽琼脂培养基     棕黄色   棕灰色，粉状     无
  燕麦麦芽琼脂培养基     棕黄色   白色，大量     无
3).生理特征
i)生长温度范围：约15到40℃，最适生长温度：约30℃。
ii)明胶液化，淀粉水解和脱脂乳胨化均为阳性。
iii)脱脂乳凝结：阴性。
iv)黑色素样色素形成：在赖氨酸琼脂培养基上形成棕色色素。
v)细胞壁组成
根据Becker等的方法(Applied Microbiology，Vol.13，p.236(1965))分析，组成细胞壁的成分二氨基庚二酸的形式为L，L型。
4).碳源同化(Pridham-Gottlieb琼脂培养基)
     L-阿拉伯糖                -
     D-木糖                    -
     D-葡萄糖                  +
     D-果糖                    +
     L-鼠李糖                  -
     D-半乳糖                  +
     蔗糖                      -
     棉子糖                    -
     D-甘露醇                  +
     肌醇                      +
     水杨苷                    +
+：可同化，                -：不同化
由以上所述可见，本发明的改良菌株21021某些菌学特征与亲本菌株11011A-1不同。例如，就碳源同化而言，菌株11011A-1不能同化水杨苷，而菌株B21021可同化。就培养特征而言，11011A-1菌株在蔗糖·硝酸盐琼脂培养基上形成棕灰色气生菌丝，但菌株B21021不形成。11011A-1菌株在营养琼脂培养基上大量形成白色气生菌丝，而菌株B21021只形成少量气生菌丝。11011A-1菌株在葡萄糖·天冬氨酸琼脂培养基和甘油·天冬氨酸琼脂培养基中均形成水溶性色素，而B21021菌株在两种培养基中均不形成色素。因此，菌株B21021从菌学特征上可明确地与亲本菌株即菌株11011A-1区分开。
为了用改良菌株生产εPL，将改良菌株接种至培养基并培养，然后由培养基中分离和纯化形成和积累的εPL。只要其中含有适量碳源、氮源、无机物和其它营养素，任何培养基均可使用。至于碳源，能被改良菌株同化的碳源如葡萄糖、果糖、甘油和淀粉均可使用，而没有任何限制。加入的量优选为1-5％(％表示g/dl％)。氮源中，蛋白胨、酪素水解物、氨基酸、无机铵盐等均可使用，优选硫酸铵。优选加入的氮源的量为0.2到2％(％表示g/dl％)。培养时，可连续加入碳源和氮源。无机物的实例包括磷酸根离子、钾离子、钠离子、镁离子、锌离子、铁离子、锰离子、镍离子和硫酸根离子。加入0.1到0.5％(％表示g/dl％)的酵母提取物可促进微生物生长，对εPL生产有好处。
在好气条件下振荡培养、搅拌培养或其它方法培养。培养温度优选为25到35℃。培养基的pH优选接近中性(pH6-8)，但开始培养后pH会降低。当pH降低到4时，加入碱维持pH为4。加入的碱优选为氨水，但氢氧化钠、氢氧化钾或其它碱也可使用。通常1到7天后εPL在培养基中积累。离心或过滤除去细胞后，剩余溶液纯化、脱色并浓缩。让浓缩液在有机溶剂如丙酮或乙醇中结晶即可得到εPL。
实施本发明的最佳方式
以下更具体地叙述本发明。
培养基中产生的εPL量根据Itzhaki等的方法(Analytical Biochemistry，50，569(1972))测定。即培养基中的εPL量按以下方法确定：将培养物离心除去细胞，将2毫升上清液(εPL：0到200μg)与2毫升1mM甲基橙水溶液混合，所得混合物室温放置30分钟，离心除去产生的εPL-甲基橙复合物，在465nm测定上清液的吸收值。
在实施例和比较实施例中，除另外说明外，％表示重量(g)/体积(dl)％。
实施例1
在体积为3升的容器中，装入2升培养基，培养基组成为：葡萄糖：5％，硫酸铵：1％，酵母提取物：0.5％，K2HPO4：0.08％，KH2PO4：0.136％，MgSO4·7H2O：0.05％，ZnSO4·7H2O：0.004％，FeSO4·7H2O：0.003％，pH6.8。向培养基中接种100毫升小白链霉菌lysinopolymerus亚种B21021菌株即本发明的改良菌株的预培养物，30℃ 700rpm好气培养72小时，空气流速为3L/min。pH用10％的氨水维持为4。残留葡萄糖和硫酸铵浓度降低时，连续加入葡萄糖和硫酸铵。
培养72小时后εPL的产量和葡萄糖的转化率示于表3。“葡萄糖转化率(％)”在本文中表示为(εPL产量/葡萄糖消耗量)×100。
实施例2
除使用小白链霉菌lysinopolymerus亚种B22107菌株代替小白链霉菌lysinopolymerus亚种B21021菌株外，同实施例1一样进行培养，测定培养物中的εPL量。培养72小时后εPL产量和葡萄糖转化率示于表3。
实施例3
除使用小白链霉菌lysinopolymerus亚种B22201菌株代替小白链霉菌lysinopolymerus亚种B21021菌株外，同实施例1一样进行培养，测定培养物中的εPL量。培养72小时后εPL产量和葡萄糖转化率示于表3。
比较实施例1
除使用小白链霉菌lysinopolymerus亚种11011A-1菌株即亲本菌株代替小白链霉菌lysinopolymerus亚种B21021菌株外，同实施例1一样进行培养。培养72小时后εPL产量和葡萄糖转化率示于表3。
                  表3菌株                 εPL产量(g/l)    葡萄糖转化率(％)B21021(实施例1)       16.2            12.1B22107(实施例2)       15.6            11.1B22201(实施例3)       14.3            13.011011A-1(比较实施例1) 9.2             7.7
实施例4
在体积为3升的容器中，装入2升培养基，培养基组成为：葡萄糖：5％，硫酸铵：1％，酵母提取物：0.5％，K2HPO4：0.08％，KH2PO4：0.136％，MgSO4·7H2O：0.05％，ZnSO4·7H2O：0.004％，FeSO4·7H2O：0.003％，pH6.8。向培养基中接种100毫升小白链霉菌lysinopolymerus亚种B21021菌株即本发明的改良菌株的预培养物，30℃ 700rpm好气培养168小时，空气流速为3L/min。pH用10％的氨水维持为4。残留葡萄糖和硫酸铵浓度降低时，连续加入葡萄糖和硫酸铵。
培养168小时后εPL的产量和葡萄糖的转化率示于表3。。
实施例5
除使用小白链霉菌lysinopolymerus亚种B22107菌株代替小白链霉菌lysinopolymerus亚种B21021菌株外，同实施例4一样进行培养，测定培养物中的εPL量。培养168小时后εPL产量和葡萄糖转化率示于表4。
实施例6
除使用小白链霉菌lysinopolymerus亚种B22201菌株代替小白链霉菌lysinopolymerus亚种B21021菌株外，同实施例4一样进行培养，测定培养物中的εPL量。培养168小时后εPL产量和葡萄糖转化率示于表4。
比较实施例2
除使用小白链霉菌lysinopolymerus亚种11011A-l菌株即亲本菌株代替小白链霉菌lysinopolymerus亚种B21021菌株外，同实施例4一样进行培养。培养168小时后εPL产量和葡萄糖转化率示于表4。
                  表4菌株                 εPL产量(g/l)  葡萄糖转化率(％)B2102l(实施例4)       31.0          12.4B22107(实施例5)       28.6          12.6B22201(实施例6)       25.0          11.411011A-1(比较实施例2) 19.1          7.8
实施例7
实施例4中培养168小时获得的培养物离心除去细胞，然后调pH至7.5。分离出残渣，使用IRC-50(阳离子交换树脂)、IRA-402(阴离子交换树脂)和XT-1006(阳离子交换树脂)进行纯化，然后通过反渗透膜(RO)浓缩，从而获得εPL。εPL的产量示于表5。
比较实施例3
比较实施例2中培养168小时获得的培养物同实施例7一样离心除去细胞，然后调pH至7.5。分离出残渣，使用IRC-50(阳离子交换树脂)、IRA-402(阴离子交换树脂)和XT-1006(阳离子交换树脂)进行纯化，然后通过反渗透膜(RO)浓缩，从而获得εPL。εPL的产量示于表5。
              表5菌株                               εPL产量(克)B21021(实施例7)                     3911011A-1(比较实施例3)               24
由表3、4和5可见，改良菌株无论在εPL产量和葡萄糖转化率上均较菌株11011A-1显著提高。
工业实用性
本发明对高浓度AEC具有抗性的改良菌株具有高效大量产生εPL的能力。利用该εPL产生菌株可以高产率、高产量地生产εPL。

Claims (4)

1.大量产生ε-聚-L-赖氨酸的菌株，该菌株是通过将属于小白链霉菌、具有εPL生成能力的微生物进行诱变处理而获得的，其对浓度为10mg/ml或更高的S-(2-氨基乙基)-L-半胱氨酸具有抗性。
2.大量产生ε-聚-L-赖氨酸的菌株B21021(保藏号FERM BP-5926)，该菌株是通过将小白链霉菌lysinopolymerus亚种11011A-1菌株(FERMBP-1109)进行诱变处理而获得的，其对浓度为10mg/ml或更高的S-(2-氨基乙基)-L-半胱氨酸具有抗性。
3.生产ε-聚-L-赖氨酸的方法，该方法包括在培养基中好气培养属于链霉菌属的微生物，该微生物对浓度为10mg/ml或更高的S-(2-氨基乙基)-L-半胱氨酸具有抗性并具有ε-聚-L-赖氨酸生成能力，收集培养物中形成和积累的ε-聚-L-半胱氨酸。
4.生产ε-聚-L-赖氨酸的方法，该方法包括在培养基中好气培养权利要求2的B21021菌株，收集培养液中形成和积累的ε-聚-L-半胱氨酸。
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