KR20010020206A

KR20010020206A - 현저한 양의 ε-폴리-Ｌ-라이신을 생산하는 균주 및 이를 사용한 ε-폴리-Ｌ-라이신의 제조방법

Info

Publication number: KR20010020206A
Application number: KR1019997009787A
Authority: KR
Inventors: 이와타도시하루; 시라이시신지; 이와사와유미코; 히라키준
Original assignee: 고토 기치; 칫소가부시키가이샤
Priority date: 1997-04-23
Filing date: 1997-04-23
Publication date: 2001-03-15
Also published as: KR100433741B1; CN1161455C; CN1260004A

Abstract

본 발명은, 통상적인 ε-폴리-L-라이신 생산 균주 또는 이의 개량된 변형체와 비교되는 바와 같이 ε-폴리-L-라이신을 생산할 수 있는 개량된 능력을 지니고 있으며 ε-폴리-L-라이신 생산성을 증가시킬 수 있는 균주와 ε-폴리-L-라이신을 생산할 수 있고 스트렙토마이세스 알불러스 종에 속하는 미생물을 돌연변이시켜 10㎎/㎖ 이상의 고농도의 S-(2-아미노에틸)-L-시스테인에 대해 내성이 있고 ε-폴리-L-라이신을 생산할 수 있는 균주를 생성하고, 이러한 균주를 배지중에서 호기적을 배양하고 배양액으로부터 ε-폴리-L-라이신을 수집함으로 포함하여, 상기한 균주를 사용함으로써 현저한 양의 ε-폴리-L-라이신을 생산할 수 있는 방법에 관한 것이다.

Description

현저한 양의 ε-폴리-Ｌ-라이신을 생산하는 균주 및 이를 사용한 ε-폴리-Ｌ-라이신의 제조방법{Strain producing remarkable amount of ε-poly-L-lysine and process for producing ε-poly-L-lysine by using the same}

발효 방법에 따른 εPL의 제조방법으로는, 자연계로부터 분리해낸 εPL 생산 균주이며 스트렙토마이세스(Streptomyces) 속에 속하는 스트렙토마이세스 알불러스 아종의 라이시노폴리메러스(Streptomyces albulus subsp.lysinopolymerus) 346-D(FERM P-3834) 균주를 배지에서 배양하고, 생성된 배양 배지로부터 εPL을 분리시키고 정제시킴을 포함하는 방법이 공지되어 있다[참조 문헌: 심사된 일본 특허공보 제59-20359호]. 또한, 상기한 스트렙토마이세스 알불러스 아종의 라이시노폴리메러스 346-D를 돌연변이(mutagenesis) 처리하여 L-라이신의 유사 물질인 S-(2-아미노에틸)-L-시스테인에 대한 내성을 지닌 돌연변이로 형질전환시키고, 생성된 돌연변이, 즉 스트렙토마이세스 알불러스 라이시노폴리메러스 11011A-1(FERM BP-1109)를 배지에서 배양하고, 생성된 배양 배지로부터 εPL을 분리시키고 정제시킴을 포함하는 방법이 공지되어 있다[참조 문헌: 심사된 일본 특허공보 제3-42070호 또는 심사된 일본 특허공보 제3-78998호].

다양하게 적용될 수 있는 εPL을 저렴하게 제조하는 경우, 심지어는 상기한 균주 11011A-1을 사용하더라도 εPL의 생산량 및 글루코스 전환 효율의 관점에서는 충분하지가 않다. 따라서, εPL을 생산하는 능력이 개량된 균주 및 상기한 개량 균주를 사용하여 εPL을 생산하는데 있어 공업적으로 저렴하고 효율적인 방법의 개발이 요구되고 있다.

본 발명자들은 통상적인 εPL 생산 균주 또는 이의 돌연변이 균주와 비교하는 경우, εPL을 생산하는 보다 개량된 능력을 지닌 균주를 수득하고자하는 관점에서 광범위한 조사를 반복했다. 그 결과, 10㎎/㎖ 이상의 고농도의 S-(2-아미노에틸)-L-시스테인(이후부터는 "AEC"로 언급함)에 대한 내성을 지닌 돌연변이가 다량의 εPL을 생산할 수 있는 균주일 수 있고, 다량의 εPL이 배지에서 상기 균주를 호기적으로 배양함으로써 생산할 수 있음을 밝혀내었다. 이러한 발견을 근거로 하여, 본 발명을 완성하였다.

상기한 설명으로부터 명백한 바와 같이, 본 발명의 목적은 통상적인 εPL 생산 균주 또는 이의 개량 균주와 비교되는, εPL을 생산하는 보다 높은 능력을 가져서 εPL의 생산력을 개량시킬 수 있는 균주, 및 또한 당해 균주를 사용하여 저렴하게 다량으로 εPL을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명은 다량의 ε-폴리-L-라이신(이후부터는 "εPL"로 언급함)을 생산할 수 있는 균주 및 당해 균주를 사용하는 발효법에 의해 εPL을 제조하는 방법에 관한 것이다.

εPL은 필수 아미노산인 L-라이신의 중합체이기 때문에, 높은 양이온 함량으로 인해 안정성이 높으며 특별한 물리적 특성을 지닌다. 따라서, 욕실용품, 화장품류, 사료 첨가물, 의약, 농약, 식품 첨가물, 전자 재료 등에서 유용할 것으로 기대된다. 특히, 식품 첨가물 분야에서 천연 발생의 첨가제로서 주목받고 있다.

본 발명은 하기의 기술적 수단으로 구성된다:

(1) 스트렙토마이세스 알불러스 종에 속하고ε-폴리-L-라이신을 생산하는 능력을 가진 미생물을 돌연변이 처리함으로써 수득되고, 10㎎/㎖ 이상의 고농도의 S-(2-아미노에틸)-L-시스테인에 대한 내성을 갖는, 다량의 ε-폴리-L-라이신을 생산할 수 있는 균주.

(2) 스트렙토마이세스 알불러스 아종의 라이시노폴리메러스 11011A-1(FERM BP-1109) 균주를 돌연변이 처리함으로써 수득되고, 10㎎/㎖ 이상의 고농도의 S-(2-아미노에틸)-L-시스테인에 대한 내성을 갖는, 다량의 ε-폴리-L-라이신을 생산할 수 있는 균주 B21021(수탁 번호: FERM BP-5926).

(3) 10㎎/㎖ 이상의 고농도의 S-(2-아미노에틸)-L-시스테인에 대한 내성을 가지고 있으며 ε-폴리-L-라이신 생산 능력을 갖는 스트렙토마이세스 속에 속하는 미생물을 배지에서 호기적으로 배양하고, 배양액중에서 생성되고 축적된 ε-폴리-L-라이신을 수집함을 특징으로하는 ε-폴리-L-라이신의 제조방법.

(4) 배지에서 상기(2)에서 기술한 균주 B21021을 호기적으로 배양하고 배양액중에서 생성되고 축적된 ε-폴리-L-라이신을 수집함을 특징으로하는 ε-폴리-L-라이신의 제조방법.

본 발명에서 사용되는 AEC는 L-라이신과 구조적으로 유사한 물질(유사체)이고, L-라이신과는 4-위치에서의 탄소원자가 황원자로 치환된 것만이 상이한 구조를 갖는 화합물이다. AEC를 배지에 첨가하면 미생물의 성장 억제를 유발시키고, 이를 L-트레오닌과 혼합하여 사용하는 경우, 성장 억제는 보다 명백해지고 강력해진다.

심사된 일본 특허공보 제3-42070호에 기재되어 있는 균주 11011A-1이 L-라이신 유사 물질인 AEC에 대한 내성을 지닌 εPL 생산 균주이더라도, 2㎎/㎖ 농도의 AEC의 존재하에 선별되고, AEC의 농도가 단지 5㎎/㎖ 이하인 경우에 성장은 하지만 10㎎/㎖ 이상의 AEC 농도에서는 성장하지 않는다.

본 발명에 따른 개량 균주는 10㎎/㎖ 이상의 AEC의 농도하에서 선별함으로써 수득되고, 스트렙토마이세스 속에 속하고 40㎎/㎖의 AEC의 농도에서도 성장할 만큼 이에 대한 내성을 가진 미생물이다. 또한, 개량 균주는 모 균주인 균주 1101A-1와는 균류학적인 특성이 부분적으로 상이한 것으로 인지된다.

상기한 개량 균주를 수득하는데 사용되는 모 균주로는, 스트렙토마이세스 속에 속하고 εPL을 생산할 수 있는 미생물을 사용할 수 있다. 이들중에서, 스트렙토마이세스·알불러스·라이시노폴리메러스 11011A-1(FERM BP-1109) 균주가 바람직하다.

본원에서 사용되는 용어 "돌연변이 처리"는 스트렙토마이세스 속에 속하고 εPL을 생산할 수 있는 미생물(균주)의 돌연변이를 유발시켜 10㎎/㎖ 이상의 고농도에서의 AEC에 대해 내성을 지닌 개량된 균주를 수득하기 위한 처리를 의미한다. 이러한 돌연변이 처리 방법의 예로는 N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘(이후부터는 "NTG"로 언급함)을 가하여 완충액 ㎖당 0.1 내지 3㎎의 농도를 생산하고, 균주를 10분 내지 2시간 동안 NTG와 접촉시키는 방법; 균주를 100 내지 1000J/cm²의 조사량으로 자외선에 노출시키는 방법, 균주를 5-브로모라우실과 같은 화학약품으로 처리하는 방법: 및 기타 통상적으로 사용되는 화학적 또는 물리적 돌연변이 처리 방법이 포함된다.

돌연변이 처리에 사용되는 균주를 선별하는 방법의 예로는 배지 ㎖당 각각 AEC를 가하여 10㎎ 이상의 농도를 만들고, L-트레오닌을 가하여 1㎎의 농도를 만든 최소 한천 배지에 균주를 접종한 다음, 배지에서 성장한 균주를 수집하는 방법이 포함된다.

본 발명은 이후에 보다 상세하게 설명될 것이다.

고농도의 AEC에 내성이 있는 균주인, 본 발명의 개량 균주를 수득하는 구체적인 예는 다음과 같다. εPL 생산 균주인 스트렙토마이세스·알불러스·아종·라이시노폴리메러스 11011A-1 균주의 포자를 트리스-말레에이트 완충액(pH 6.0)에 현탁시킨다. 생성된 현탁액에, NTG를 당해 완충액 ㎖당 1.5㎎의 농도가 되는 양으로 가하고, 포자와 NTG를 37℃에서 60분 동안 접촉시킨다. 생성된 포자를 원심분리로 수집하고, 인산염 완충액(0.05M, pH 7)으로 세척하고, 액체 영양 배지(글루코스: 5%, 황산암모늄: 1%, 효모 추출물: 0.5%, K₂HPO₄: 0.08%, KH₂PO₄: 0.136%, MgSO₄·7H₂O: 0.05%, ZnSO₄·7H₂0: 0.004%, FeSO₄·7H₂O: 0.003%, pH 6.8, 여기서 %는 g/㎗를 의미한다)에서 밤새 배양한다. 배양 후, 생성된 세포는 원심분리에 의해 수집하고, 인산염 완충액(0.05M, pH 7)으로 세척하고, 배지 1ml를 기준으로 AEC 20㎎ 및 L-트레오닌 1ml를 각각 함유하는 최소 한천 배지(글루코스: 5%, 황산암모늄 1%, K₂HPO₄: 0.08%, KH₂PO₄: 0.136%, MgSO₄·7H₂O: 0.05%, ZnSO₄·7H₂0: 0.004%, FeSO₄·7H₂O: 0.003%, pH 6.8, 한천; 1.5%, 여기서 %는 g/㎗를 의미한다)에 적용하고, 30℃에서 3일 내지 4일 동안 배양한다. 이어서, 생육된 콜로니를 수집한다. 고농도의 AEC에 대해 내성있는 수득된 균주에 관하여 εPL의 생산성을 평가한다. 그 결과, 가장 높은 생산성을 나타내는 균주는 스트렙토마이세스·알불러스·아종·라이시노폴리메러스 B21021[통상산업성 공업기술원 생명공학공업기술연구소(일본 이바라키켄 쓰쿠바시 히가시 1초메 1반 3고), 국제 수탁 번호: FERM BP-5926, 부다페스트 조약하에 1997년 4월 18일자로 원 기탁(FERM P-15193, 원 기탁일: 1995년 9월 20일)에서 국제 기탁으로 이전됨] 균주이고, 이어서 B22107 및 B22201 균주이다.

개량된 균주인 고농도-AEC-내성 균주의 AEC에 대한 내성은 다음과 같이 측정한다. AEC를 하기 표 1에 기술하는 바와 같은 농도로 가하고 L-트레오닌을 배지 ㎎당 1㎖의 양으로 가한 최소 한천 배지(상기한 바와 같음)에 각각의 내성 균주를 적용시키고, 30℃에서 2 내지 7일 동안 배양한 다음, 성장을 가시적으로 관찰함으로써 내성을 비교한다. 결과는 표 1에 나타내었다. 모 균주인 균주 11011A-1은 5㎎/㎖ 농도의 AEC에서는 성장을 나타내지만 10㎎/㎖의 농도에서는 전혀 성장하지 않는 반면, 고농도 내성 균주인 균주 B21021은 심지어 40㎎/㎖의 AEC 농도에서도 성장을 나타내는 것으로 인지되었다. 본 발명에 따른 개량 균주는 고농도의 AEC에 대해 내성을 가지며, 이러한 측면에서 모 균주와 확실하게 구별될 수 있다.

시험 균주	AEC 농도(㎎/㎖)	배양 일수(일)2 3 4 5 6 7
B21021	5102040	+ + + + + ++ + + + + ++ + + + + +- - ± + + +
B22107	5102040	+ + + + + ++ + + + + ++ + + + + +- - ± + + +
B22201	5102040	+ + + + + ++ + + + + ++ + + + + +- ± + + + +
11011A-1(모 균주)	251020	- - ± ± + +- - ± ± + +- - - - - -- - - - - -

주) +: 성장이 관찰됨

-: 성장이 관찰되지 않음

±: 조금 성장한 것이 관찰됨

균주 B21021의 균류학적인 특성은 다음과 같다:

(1) 형태학적 특성

① 포자형성 균사의 분지법 및 형태

단순 분지, 폐쇄 나선

② 포자의 수: 수십개의 포자

③ 포자의 표면 구조 및 크기

각각의 포자는 구형이거나 크기가 약 1.2 내지 1.5㎛인 달걀형이고, 가시(Spiny) 표면 구조를 갖는다.

④ 편모, 균핵 및 포자낭의 유무: 인지되지 않음

⑤ 포자 끝의 접착 위치: 기체 균사상

(2) 각각의 배지의 배양 특성

표 2에서 나타낸 바와 같은 각각의 배지의 특성은 30℃에서 10일 내지 14일 동안 배양한 후에 관찰한 결과이다.

배지	기층 균사	기체 균사	가용성 안료
슈크로스·니트레이트 한천 배지	생육되지 않음	생육되지 않음	없음
글루코스·아스파라긴 한천 배지	흰색 내지 담황색	회갈색	없음
글리세롤·아스파라긴 한천 배지	담황색	흰색, 분말	없음
티로신 한천 배지	담갈색	흰색	갈색
영양 한천 배지	황색	흰색, 약간 형성됨	없음
효모·말트 한천 배지	황갈색	회갈색, 분말	없음
오트밀 한천 배지	황갈색	흰색, 풍부함	없음

(3) 생리학적인 특성

① 성장 온도 범위

약 15 내지 40℃, 최적 성장 온도: 약 30℃.

② 젤라틴의 액화, 전분의 가수분해 및 탈지 우유의 펩톤화

각각 양성임.

③ 탈지 우유의 응고작용: 음성.

④ 멜라닌형 안료의 형성

티로신 한천 배지에서 갈색 안료가 형성된다.

⑤ 세포벽의 조성

세포벽의 조성물중의 성분에서 디아미노피멜산 형태는 벡커(Becker) 등의 방법에 따른 분석의 결과로서 L,L 형으로 나타난다[참조 문헌: Applied Microbiology, Vol. 13, p. 236 (1965)].

(4) 탄소 공급원의 동화작용(assimilation)[프리드햄-고틀리에(Pridham-Gottlieb) 한천 배지]

L-아라비노스 -

D-크실로스 -

D-글루코스 +

D-프럭토스 +

L-람노스 -

D-갈락토스 +

수크로스 -

라피노스 -

D-만니톨 +

이노시톨 +

살리신 +

+: 동화작용을 함, -: 동화작용을 하지 않음

상기에서 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 개량 균주 중 하나인 균주 B21021은 모 균주인 균주 11011A-1과는 몇몇 균류학적인 특성이 상이하다. 예를 들어, 탄소 공급원의 동화작용과 관련하여, 균주 11011A-1은 살리신을 동화시킬 수 없지만 균주 B21021은 동화시킬 수 있다. 배양학적 특성과 관련하여, 회갈색의 기체 균사는 균주 11011A-1이 적용된 수크로스·니트레이트 한천 배지에서 형성되지만, 균주 B21021의 경우에는 형성되지 않는다. 흰색 기체 균사는 균주 11011A-1이 적용된 영양 한천 배지에서 풍부하게 형성되지만, 균주 B21021의 경우에는 기체 균사는 약간만 형성된다. 가용성 안료는 글루코스·아스파라긴 한천 배지 및 글리세롤·아스파라긴 한천 배지 둘다에서 관찰되지만, 균주 B21021의 경우에는 배지 둘다에서 관찰되지 않는다. 따라서, 균주 B21021은 또한 모 균주 11011A-1과 형태학적 특성면에서 분명하게 구별될 수 있다.

개량된 균주로부터 εPL을 생산하는 경우, 개량 균주를 배지에 접종하고 배양한 다음, 이로써 생성되고 축적된 εPL을 배양액으로부터 분리시키고 정제시킨다. 배지로는, 탄소 공급원, 질소 공급원, 무기물 및 기타 영양분을 적절한 양으로 포함하는 한 임의의 배지를 사용할 수 있다. 탄소 공급원으로서, 개량 균주에 의해 동화될 수 있는 것(예: 글루코스, 프럭토스, 글리세린 및 전분)이라면 제한없이 사용할 수 있다. 첨가되는 양은 바람직하게는 1 내지 5%이다(%는 g/㎗를 의미함). 질소 공급원으로는 임의의 펩톤, 카제인 가수분해물, 아미노산, 무기 암모늄염, 바람직하게는 황산암모늄 등을 사용할 수 있다. 질소 공급원은 바람직하게는 0.2 내지 2%(%는 g/㎗를 의미함)의 양으로 가한다. 배양 동안에, 탄소 공급원 및 질소 공급원은 연속적으로 가할 수 있다. 무기물의 예는 인산 이온, 칼륨 이온, 나트륨 이온, 마그네슘 이온, 아연 이온, 철 이온, 망간 이온, 니켈 이온 및 황산 이온을 포함한다. 0.1 내지 0.5%(%는 g/㎗를 의미함)의 양으로 효모 추출물을 혼입시키는 것이 미생물의 성장을 증진시키고 εPL의 생산에 우수한 효과를 가져온다.

배양은 배양액을 진탕시키고 교반시킴으로써 호기성 조건하에 수행한다. 25 내지 35℃의 배양 온도가 바람직하다. 배지의 pH는 바람직하게는 중성(pH 6 내지 8)에 가깝지만, 배양이 시작된 후 미생물이 성장하면서 pH는 낮아진다. pH가 4까지 떨어지면, 알칼리를 가하여 pH를 4에서 유지시킨다. 첨가하는 알칼리로는 암모니아수가 바람직하지만, 수산화나트륨, 수산화칼륨 등을 사용할 수도 있다. 일반적으로 1 내지 7일에 배양액중에서 εPL이 축적된다.

원심분리 또는 여과에 의해 배양액으로부터 세포를 제거한 후, 잔류 용액을 정제시키고 탈색시키고 농축시킨다. 농축물로부터 아세톤 또는 에탄올과 같은 유기 용매중에 εPL을 결정화시킴으로써 이를 수득할 수 있다.

본 발명을 수행하는 최상의 형태

본 발명은 이후부터 보다 상세히 설명될 것이다.

배양액중의 εPL의 생산량은 이츠하키(Itzhaki) 등의 문헌에 기술되어 있는 방법에 따라 측정한다[참조 문헌: "Analytical Biochemistry, 50, 569 (1972)"]. 즉, 배양액을 원심분리하여 세포를 제거하고 상층액 2㎖(εPL: 0 내지 200㎍)를 1mM의 메틸 오렌지 수용액 2㎖와 혼합하고, 생성된 혼합물을 실온에서 30분 동안 정치시키고, 원심분리하여 생성된 εPL-메틸 오렌지 착물을 제거하고, 465㎚에서 상층액의 흡광도를 측정함으로써 배양액중의 εPL의 양을 측정한다.

실시예 및 비교 실시예에서 "%"는 구체적으로 나타내지 않는한 중량(g)/용적(㎗)%를 의미하는 것으로 인지한다.

실시예 1

3ℓ 용적을 갖는 자(jar)에, 5% 글루코스, 0.5% 효모 추출물, 1% 황산암모늄, 0.08% K₂HPO₄, 0.136% KH₂PO₄, 0.05% MgSO₄·7H₂0, 0.04% ZnSO₄·7H₂O 및 0.003% FeSO₄·7H₂O로 이루어지고 pH가 6.8인 배지 2ℓ를 충전시킨다. 스트렙토마이세스·알불러스·아종·라이시노폴리메러스 B21021, 즉 본 발명에 따라 수득한 개량된 균주의 예비 배양액 100㎖를 배지에 접종시키고, 30℃ 및 700rpm에서 3ℓ/분의 통기량으로 72시간 동안 호기적으로 배양시킨다. 10% 암모니아수를 가하여 pH를 4로 유지시킨다. 글루코스 및 황산암모늄의 잔류 농도가 낮아지는 경우, 이들을 연속적으로 가한다.

72시간 동안 배양한 후의 εPL의 생산량 및 글루코스 전환 효율은 표 3에 나타내었다. 본원에서 사용되는 바와 같이 용어 "글루코스 전환 효율(%)"은 (εPL 생산량/글루코스 소비량)×100으로 표현되는 값을 의미한다.

실시예 2

스트렙토마이세스·알불러스·아종·라이시노폴리메러스 B21021 균주 대신에 스트렙토마이세스·알불러스·아종·라이시노폴리메러스 B22107 균주를 사용하는 것을 제외하고는 실시예 1에 기술된 것과 동일한 방법으로 배양을 수행하고, 배양액중의 εPL의 양을 측정한다. 72시간 동안 배양한 후의 εPL의 생산량 및 글루코스 전환 효율은 표 3에 나타내었다.

실시예 3

스트렙토마이세스·알불러스·아종·라이시노폴리메러스 B21021 균주 대신에 스트렙토마이세스·알불러스·아종·라이시노폴리메러스 B22201 균주를 사용하는 것을 제외하고는 실시예 1에 기술된 것과 동일한 방법으로 배양을 수행하고, 배양액중의 εPL의 양을 측정한다. 72시간 동안 배양한 후의 εPL의 생산량 및 글루코스 전환 효율은 표 3에 나타내었다.

비교 실시예 1

스트렙토마이세스·알불러스·아종·라이시노폴리메러스 B21021 균주 대신에 스트렙토마이세스·알불러스·아종·라이시노폴리메러스 11011A-1 균주, 즉 모 균주를 사용하는 것을 제외하고는 실시예 1에 기술된 것과 동일한 방법으로 배양을 수행한다. 72시간 동안 배양한 후의 εPL의 생산량 및 글루코스 전환 효율은 표 3에 나타내었다.

균주	εPL의 생산량(g/ℓ)	글루코스 전환 효율(%)
B21021(실시예 1)B22107(실시예 2)B22201(실시예 3)11011A-1(비교 실시예 1)	16.215.614.39.2	12.111.113.07.7

실시예 4

3ℓ 용적을 갖는 자에, 5% 글루코스, 0.5% 효모 추출물, 1% 황산암모늄, 0.08% K₂HPO₄, 0.136% KH₂PO₄, 0.05% MgSO₄·7H₂0, 0.04% ZnSO₄·7H₂O 및 0.003% FeSO₄·7H₂O로 이루어지고 pH가 6.8인 배지 2ℓ를 충전시킨다. 스트렙토마이세스·알불러스·아종·라이시노폴리메러스 B21021, 즉 본 발명에 따라 수득한 개선된 균주의 예비 배양액 100㎖를 배지에 접종시키고, 30℃ 및 700rpm에서 3ℓ/분의 통기량으로 168시간 동안 호기적으로 배양시킨다. 10% 암모니아수를 가하여 pH를 4로 유지시킨다. 글루코스 및 황산암모늄의 잔류 농도가 낮아지는 경우, 이들을 연속적으로 가한다.

168시간 동안 배양한 후의 εPL의 생산량 및 글루코스 전환 효율은 표 4에 나타내었다.

실시예 5

스트렙토마이세스·알불러스·아종·라이시노폴리메러스 B21021 균주 대신에 스트렙토마이세스·알불러스·아종·라이시노폴리메러스 B22107 균주를 사용하는 것을 제외하고는 실시예 4에 기술된 것과 동일한 방법으로 배양을 수행하고, 배양액중의 εPL의 양을 측정한다. 168시간 동안 배양한 후의 εPL의 생산량 및 글루코스 전환 효율은 표 4에 나타내었다.

실시예 6

스트렙토마이세스·알불러스·아종·라이시노폴리메러스 B21021 균주 대신에 스트렙토마이세스·알불러스·아종·라이시노폴리메러스 B22201 균주를 사용하는 것을 제외하고는 실시예 4에 기술된 것과 동일한 방법으로 배양을 수행하고, 배양액중의 εPL의 양을 측정한다. 168시간 동안 배양한 후의 εPL의 생산량 및 글루코스 전환 효율은 표 4에 나타내었다.

비교 실시예 2

스트렙토마이세스·알불러스·아종·라이시노폴리메러스 B21021 균주 대신에 스트렙토마이세스·알불러스·아종·라이시노폴리메러스 11011A-1 균주, 즉 모 균주를 사용하는 것을 제외하고는 실시예 4에 기술된 것과 동일한 방법으로 배양을 수행한다. 168시간 동안 배양한 후의 εPL의 생산량 및 글루코스 전환 효율은 표 4에 나타내었다.

균주	εPL의 생산량(g/ℓ)	글루코스 전환 효율(%)
B21021(실시예 4)B22107(실시예 5)B22201(실시예 6)11011A-1(비교 실시예 2)	31.028.625.019.1	12.412.611.47.8

실시예 7

168시간 동안 배양함으로써 실시예 4에서 수득한 배양액을 원심분리하여 세포를 제거한 다음, pH를 7.5로 조정한다. 이어서, 잔사를 IRC-50(양이온 교환 수지), IRA-402(음이온 교환 수지) 및 XT-1006(양이온 교환 수지)을 각각 사용하여 분리시키고 정제시킨 다음, 역삼투막(RO)을 통해 농축시켜 εPL을 수득한다. εPL의 수율은 표 5에 나타내었다.

비교 실시예 3

168시간 동안 배양함으로써 비교 실시예 2에서 수득한 배양액을 실시예 7에서와 같이 원심분리하여 세포를 제거한 다음, pH를 7.5로 조정한다. 이어서, 잔사를 IRC-50(양이온 교환 수지), IRA-402(음이온 교환 수지) 및 XT-1006(양이온 교환 수지)을 각각 사용하여 분리시키고 정제시킨 다음, 역삼투막(RO)을 통해 농축시켜 εPL을 수득한다. εPL의 수율은 표 5에 나타내었다.

균주	εPL의 수율(g)
B21021(실시예 7)11011A-1(비교 실시예 3)	3924

표 3, 4 및 5에서 명백한 바와 같이, εPL의 생산량 및 글루코스 전환 효율 둘다가 균주 11011A-1과 비교시 현저하게 증가된 것으로 나타난다.

고농도의 AEC에 대해 내성이 있는 본 발명의 개량 균주는 고수율로 다량의 εPL을 생산할 수 있는 능력을 갖는다. εPL 생산 균주를 사용하여 고생산성 및 고수율로 εPL을 생산할 수 있다.

Claims

스트렙토마이세스·알불러스(Streptomyces albulus) 종에 속하고 ε-폴리-L-라이신을 생산할 수 있는 미생물을 돌연변이 처리함으로써 수득되고, 10㎎/㎖ 이상의 고농도의 S-(2-아미노에틸)-L-시스테인에 대해 내성을 갖는, 다량의 ε-폴리-L-라이신을 생산하는 균주.
스트렙토마이세스·알불러스·아종·라이시노폴리메러스 11011A-1(FERM BP-1109) 균주를 돌연변이 처리함으로써 수득되고, 10㎎/㎖ 이상의 고농도의 S-(2-아미노에틸)-L-시스테인에 대해 내성을 갖는, 다량의 ε-폴리-L-라이신을 생산하는 균주 B21021(수탁 번호: FERM BP-5926).
10㎎/㎖ 이상의 고농도의 S-(2-아미노에틸)-L-시스테인에 대해 내성을 갖고 ε-폴리-L-라이신을 생산할 수 있는 스트렙토마이세스 속에 속하는 미생물을 배지에서 호기적으로 배양하고, 배양액중에 생성되고 축적된 ε-폴리-L-라이신을 수집함을 특징으로하는 ε-폴리-L-라이신의 제조방법.
제2항에 따른 균주 B21021을 배지에서 호기적으로 배양하고 배양액중에 생성되고 축적된 ε-폴리-L-라이신을 수집함을 특징으로하는 ε-폴리-L-라이신의 제조방법.