JP3163341B2 - ビタミンｂ▲１２▼の製造方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、発酵法によるビタミン
Ｂ₁₂の製造方法に関するものである。詳しくはメタノー
ル資化性菌によるビタミンＢ₁₂の製造方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】ビタミンＢ₁₂は、核酸代謝、蛋白質代
謝、脂質代謝及び炭水化物の代謝において必須の因子で
あることがよく知られており、ビタミンＢ₁₂欠乏症、造
血機能障害、肝機能障害、神経疾患の治療薬としての医
薬品や飼料添加物として広く実用に供されている。

【０００３】ビタミンＢ₁₂の生産供給については、その
構造の複雑さのために化学合成法が極めて困難で、工業
的には現在及び将来にわたって発酵法又は生化学方法に
よる生産が主流を占めるものと考えられる。微生物によ
るビタミンＢ₁₂の生産については、これまでシュードモ
ナス属、プロピオニバクテリウム属、そしてストレプト
ミセス属等に属するビタミンＢ₁₂生産菌による糖質から
の生産が知られていた。一方、近年、安価で大量生産さ
れているメタノールを発酵原料とするビタミンＢ₁₂生産
菌が数多く報告されてきた。特にメタノール資化性の偏
性嫌気性細菌は、細胞当たりのビタミンＢ₁₂含量が極め
て高いことから、新しいビタミンＢ₁₂生産菌として注目
を集めている。例えば、ブチリバクテリウム・メチロト
ロフィカムＡＴＣＣ３３２６６(Butyribacterium methy
lotrophicum)はメタノールを炭素源として培養すると約
7.4mg／乾燥菌体１ｇのビタミンＢ₁₂をを蓄積した（米
国特許明細書第４４４３０４２９号）。またユウバクテ
リウム・リモサムＡＴＣＣ８４８６(Eubacterium limos
um) は、メタノールの流加培養により、27mg／ｌのビタ
ミンＢ₁₂を生産した（特開昭６２−４４１９７号）。ま
たアセトバクテリウム・ウッディＤＳＭ２３９６(Aceto
bacterium woodii) は、メタノール含有培地で 2.7mg／
ｌのビタミンＢ₁₂を生産した（特開昭６２−１２２５９
号）。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】本発明者らはメタノー
ルを基質としてビタミンＢ₁₂を生産する菌株のスクリー
ニングを行い、約３mg／ｌのビタミンＢ₁₂生産性を有す
るアセトバクテリウム属に属するＢＭＥ−６９株を得
た。しかしながら、このビタミンＢ₁₂生産量は工業的生
産には不十分な生産量であった。従って、本発明の目的
は更に高いビタミンＢ₁₂生産性を有する菌株を見出し、
工業的に有用なビタミンＢ₁₂の製造方法を提供すること
である。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、メタノー
ル資化性を有し、ビタミンＢ₁₂生産性を示す偏性嫌気性
菌であるＢＭＥ−６９株を変異処理し、四塩化炭素耐性
株を取得し、この菌株を四塩化炭素を含む培地中で培養
することにより、ビタミンＢ₁₂生産量及び単位菌体当た
りのビタミンＢ₁₂含量が著しく向上することを認め、本
発明を完成するに至った。

【０００６】すなわち本発明は、アセトバクテリウム属
に属するＢＭＥ−６９株の変異株ＢＭＥ−６９−７又は
ＢＭＥ−６９−２３を、四塩化炭素を含む培地で培養
し、培養物からビタミンＢ₁₂を採取することを特徴とす
るビタミンＢ₁₂の製造方法を提供するものである。

【０００７】本発明に係わる変異株ＢＭＥ−６９−７及
びＢＭＥ−６９−２３は、アセトバクテリウム属に属す
るＢＭＥ−６９株を変異して得られ、メタノールを資化
し、且つ四塩化炭素耐性を有するビタミンＢ₁₂生産菌で
ある。以下、本発明に用いられる菌株について説明す
る。

【０００８】まず、変異株ＢＭＥ−６９−７及びＢＭＥ
−６９−２３を得るのに用いた親株であるＢＭＥ−６９
株について述べる。ＢＭＥ−６９株をバージェイズ・マ
ニュアル・オブ・システマィック・バクテリオロジー第
２巻（Bergey's Manual of Systematic Bacteriology v
ol.2）によって同定したところ、次の菌学的性質が得ら
れた。 (A) 形態的性質 細胞の形態 桿 菌 細胞の大きさ １〜1.5×３〜５μm グラム染色 陽 性 胞子の有無 無 鞭毛の有無 有（周 毛） (B) 寒天上での生育 以下に示す基本培地に２％寒天を加えた寒天斜面培地で
30℃、10日間嫌気的に培養すると、形状は円形、周縁は
円滑、隆起は偏平、光沢があり、表面がスムーズ、そし
て色調は黄褐色のコロニーを形成する。基本培地 メタノール ５ml NH₄Cl 1.0ｇ KH₂PO₄ 0.68ｇ MgSO₄・7H₂O 0.224ｇ NaHCO₃ 10ｇ システイン塩酸（一水塩） 0.5ｇ Na₂S・9H₂O 0.25ｇ 酵母エキス 0.2ｇ レザズリン 1.0mg 5,6-ジメチルベンズイミダゾール 10mg CoCl₂ ・6H₂O １０ｍｇ ニトリロ三酢酸 １０ｍｇ MnSO₄ ・4H₂O 11mg NaCl 20mg FeSO₄ ・7H₂O ２mg CaCl₂ ・2H₂O 2.8mg ZnSO₄ ・7H₂O 3.6mg CuSO₄ 1.2mg Al・K(SO₄)・12H₂O 3.6mg H₂BO₄ 2.0mg NaMoO₄・2H₂O 0.66mg NiCl₂ ・6H₂O 0.48mg ビオチン 0.04mg 葉酸 0.04mg ピリドキシン 0.2mg チアミン 0.1mg リボフラビン 0.1mg ニコチン酸 0.1mg パントテン酸Ca 0.1mg ｐ−アミノ安息香酸 0.1mg チオクト酸 0.02mg 脱イオン水 100ml pH 7.8 培養気相を窒素：炭酸ガス（２：１）で置換する。 (C) 生理学的性質 酸素に対する態度 偏性嫌気性 生育温度 生育温度範囲 ２０〜３０℃ 至適温度 ３０℃ ビタミン要求性 なし 色素の生産 なし カタラーゼ なし デンプン分解性 なし ゼラチン液化性 なし (D) 炭素源の資化性 資化する グルコース、フルクトース、マンノース、ソルボース、
リボース、マルトース、ガラクトース、アラビノース、
キシロース、セロビオース、ギ酸、乳酸、ピルビン酸、
グリセリン、メタノール 二酸化炭素＋水素 資化しない メリビオース、ラムノース、ソルビトール、ラクトー
ス、ラフィノース、トレハロース、メレジトース、エタ
ノール (E) 資化する炭素源からの有機酸の生産 資化する炭素源から酢酸のみを生産する。 (F) 四塩化炭素濃度と生育状況 前記基本培地に表１に示す濃度の四塩化炭素を添加した
場合のＢＭＥ−６９株の生育状況を示す。

【０００９】

【表１】

【００１０】本菌株は、偏性嫌気性で、グラム染色陽性
の桿菌で、胞子を形成せず、資化する炭素源から酢酸の
みを生産することから、アセトバクテリウム属に属する
ものと認められた。また、その他の従来知られている菌
種と比較したところ、アセトバクテリウム・ウッディの
タイプストレインＤＳＭ１０３０とは炭素源の資化性が
非常に異なっていたが、Deutsche Sammulung von Mikro
orgnismen に保存されているアセトバクテリウム・ウッ
ディＤＳＭ２３９６とは炭素源の資化性を含め、その菌
学的性質がほとんど一致していた。従って、本菌種を、
アセトバクテリウム・ウッディＢＭＥ−６９と同定し
た。

【００１１】次いで、本発明に用いられる変異株である
ＢＭＥ−６９−７及びＢＭＥ−６９−２３について説明
する。本発明に用いられるＢＭＥ−６９−７及びＢＭＥ
−６９−２３は、メタノールを資化し、ビタミンＢ₁₂生
産性が高く、しかも四塩化炭素耐性を有する菌株であ
る。これらの変異株は、ＢＭＥ−６９を変異させて得ら
れるものであり、例えば、ＢＭＥ−６９の７日間培養液
に変異剤であるエチルメタンスルホン酸を 0.5％の濃度
になるように添加し、処理した後、気相を窒素と二酸化
炭素で置換し、生理食塩水で希釈し、この希釈液と四塩
化炭素を含む寒天培地で嫌気的に培養する。出現してき
たコロニーを液体培地で培養することによって得られ
る。上記のような方法によってＢＭＥ−６９株を変異し
て得た、ＢＭＥ−６９−７、ＢＭＥ−６９−２３の２株
は四塩化炭素耐性が親株であるＢＭＥ−６９株に比べ強
く、その他の菌学的性質は親株のＢＭＥ−６９株と全く
同じである。本発明に用いられるＢＭＥ−６９−７は微
工研菌寄第１２７３０号及びＢＭＥ−６９−２３は微工
研菌寄第１２７３１号として登録されている。

【００１２】本発明に使用する発酵培地は、炭素源とし
てメタノールを含み、これに四塩化炭素、窒素源、イオ
ウ源、無機塩、そして必要に応じて他の栄養素、微量要
素、コバルト塩、そして５，６−ジメチルベンズイミダ
ゾールのようなビタミンＢ₁₂生合成の前駆体を含み、さ
らに還元剤などを添加して嫌気的雰囲気にした培地が使
用される。本発明に用いられる培地は四塩化炭素を必須
として含むものであるが、培地に四塩化炭素を添加しな
い場合もＢＭＥ−６９−７株及びＢＭＥ−６９−２３株
はビタミンＢ₁₂を生産する。しかしながらその量は親株
のＢＭＥ−６９株と変わらず、培地に四塩化炭素を添加
することによってＢＭＥ−６９−７株及びＢＭＥ−６９
−２３株のビタミンＢ₁₂生産量は増加する。培地中の四
塩化炭素の濃度は、１×10^-5〜１×10^-7Ｍの範囲が適当
である。炭素源として使用するメタノール濃度は 0.5〜
３体積％が好ましい。しかしながら、メタノール濃度が
高まると微生物の生育を阻害するので、培養中のメタノ
ール濃度を0.05〜１体積％に維持し、逐次メタノールを
添加し、培養することもできる。窒素源としては、通常
の微生物の培養に用いられる硫酸アンモニウム、塩化ア
ンモニウム、リン酸アンモニウム、尿素、硝酸アンモニ
ウム、硝酸ナトリウム等が用いられる。無機塩として
は、リン酸カリウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウ
ム、塩化カルシウム、硫酸第一鉄、セレン酸ナトリウ
ム、塩化マンガン等のほかに、亜鉛、ホウ酸、銅、ニッ
ケル、モリブデン、タングステン等の金属塩の添加が有
効である。微量要素としては、ビオチン、葉酸、ビタミ
ンＢ₁ ，Ｂ₂ ，Ｂ₆ 、ニコチン酸、パントテン酸、ｐ−
アミノ安息香酸、リポ一酸などのビタミン類が用いられ
るほか、天然の栄養源としてコーン・スティーブ・リカ
ー、酵母エキス、ペプトンなども添加できる。また、コ
バルト塩を添加することにより、ビタミンＢ₁₂生産量を
高めることができるが、その濃度は 2.5〜 250μMが望
ましく、より好ましくは５〜80μM が望ましい。さら
に、ビタミンＢ₁₂生合成の前駆体として５，６−ジメチ
ルベンズイミダゾール等を添加してビタミンＢ₁₂生産を
促進することができる。また、還元剤としては、本発明
においてはハイドロサイファイトナトリウムが有効であ
る。ハイドロサルファイトナトリウムは強力な還元力を
持ち、硫化金属のような不溶物を形成せず、有毒なガス
を生じない利点を有しており、更には、アセトバクテリ
ウム属細菌を用いるメタノールからのビタミンＢ₁₂生産
の場合、ビタミンＢ₁₂生産量及び単位菌体当たりのビタ
ミンＢ₁₂含量を著しく向上させる特徴を有している。ハ
イドロサルファイトナトリウムの添加量は25〜 150mg／
ｌがよい。さらに好適には、50〜 100mg／ｌが好まし
い。また、ハイドロサルファイトナトリウム以外の還元
剤をビタミンＢ₁₂生産及び菌の生育を阻害しない範囲で
ハイドロサルファイトナトリウムと共に添加することも
可能である。

【００１３】本発明において、培養は嫌気的に行う必要
がある。培養を嫌気的に行うには、培地中にハイドロサ
ルファイトナトリウム等の還元剤を加えるほか、酸素を
除去した窒素ガスや炭酸ガスあるいはこれらの混合気体
培地中に通気し、更に培養容器の気相中に酸素が混入し
ないようにすることが望ましい。培養温度は25〜40℃で
行うが、28〜33℃が望ましい。pHは 6.8〜7.3 に調節す
ることが望ましい。培養は、通常４〜８日で終了する
が、他の培養条件の変更に応じ、適当に変えることがで
きる。

【００１４】培養物からのビタミンＢ₁₂の採取は従来法
と同様に行うことができる。すなわち、ビタミンＢ₁₂は
主として菌体内に蓄積されるので、例えば、培養物をま
ず遠心分離して菌体を得た後、シアノ型ビタミンＢ₁₂と
して培養物から分離するために、菌体にシアンイオンを
加え、塩酸等の酸でpH 4.5〜５に調整して煮沸すること
により抽出できる。なお、菌体中のメチルコバラミン
（ＣＨ₃ −Ｂ₁₂）として培養物から分離する場合には、
80％エタノールを用いる沸点での抽出、冷50％アセトン
での抽出、20％ピリジンを用いる抽出などが用いられて
いる。培養物から抽出されたビタミンＢ₁₂の精製は、フ
ェノール抽出あるいは各種のイオン交換樹脂、イオン交
換セルロース等を用いるカラムクロマトグラフィーなど
を適宜組み合わせて行うことができる。

【００１５】

【実施例】以下実施例にて本発明を説明するが、本発明
はこれらの実施例に限定されるものではない。

【００１６】実施例１(1) 四塩化炭素耐性株の取得法 四塩化炭素耐性のある変異株の取得方法を示す。ＢＭＥ
−６９の７日間培養液に変異剤であるエチルメタンスル
ホン酸を 0.5％の濃度になるように添加し、緩やかに攪
拌した。30℃、10分処理した後、気相をN₂：CO₂ ＝２：
１に置換した生理食塩水で10^-5〜10^-8に希釈した。この
希釈液１mlと四塩化炭素を10^-5Ｍ含む寒天培地19mlを混
合してプレートにする。このプレートを嫌気ジャーに入
れ、N₂：CO₂ ＝２：１に置換した後、30℃、７日間培養
する。出現してきたコロニーを液体培地10mlに移し、30
℃、７日間培養した後、そのビタミンＢ₁₂生産性を評価
した。その結果ＢＭＥ−６９株から四塩化炭素耐性を有
するビタミンＢ₁₂高生産株としてＢＭＥ−６９−７、Ｂ
ＭＥ−６９−２３の２株を得た。

【００１７】(2) 四塩化炭素耐性株の四塩化炭素耐性 ビタミンＢ₁₂高生産株として得たＢＭＥ−６９−７、Ｂ
ＭＥ−６９−２３に対して四塩化炭素濃度を１×10^-4Ｍ
〜１×10^-7Ｍ、無添加の条件で添加してそれぞれの生育
をみた。結果を表２及び表３に示す。

【００１８】

【表２】

【００１９】

【表３】

【００２０】ＢＭＥ−６９−７、ＢＭＥ−６９−２３株
共に１×10^-4Ｍ添加での生育は見られず、濃度を１×10
^-5〜１×10^-7Ｍとした時、無添加の時、その生育に差は
見られず、600nm の吸収で1.0 〜1.2 の生育を見せた。
前述したように、親株であるＢＭＥ−６９は四塩化炭素
耐性が弱く、ＢＭＥ−６９−７株、ＢＭＥ−６９−２３
株が変異株であることを認定した。

【００２１】(3) 四塩化炭素耐性株のビタミンＢ₁₂生産性 前述の基本培地に、四塩化炭素10^-5Ｍを添加し、硫化ナ
トリウム0.25ｇとシステイン塩酸 0.5ｇをハイドロサル
ファイトナトリウム75mgに変えた培地10mlを、直径18m
m、長さ180mm の試験管に入れ、気相を窒素67％、二酸
化炭素33％の雰囲気下で嫌気状態とした後、 120℃で15
分間蒸気滅菌した。これに予め基本培地で30℃、７日間
培地で静置培養したＢＭＥ−６９−７、ＢＭＥ−６９−
２３株の菌懸濁液 0.1mlを植菌し、30℃で７日間静置培
養した。培養終了後、菌体を集め、洗浄後、 0.1％のKC
N を含有する 0.1Ｍ酢酸緩衝液（pH4.5)を加え、 120℃
で10分間加熱抽出した。抽出されたビタミンＢ₁₂量は55
0nm の吸光度により測定した。また、乾燥菌体量は濁度
計に直接試験管を挿入し、600nm の波長で濁度を測定し
た後、乾燥菌体量に換算した。また、濁度が測定範囲を
超える場合には、0.05％システイン・塩酸・一水塩と0.
05％硫化ナトリウム・九水塩を含む生理食塩水で適当に
希釈し、測定した。その結果、ＢＭＥ−６９−７株は
8.0mg／ｌで24.2mg／（乾燥菌体１ｇ）、ＢＭＥ−６９
−２３株は 6.2mg／ｌで20.0mg／（乾燥菌体１ｇ）のビ
タミンＢ₁₂生産量を示した。

【００２２】比較例１ 基本培地のシステイン・塩酸・一水塩 0.5ｇ／ｌと硫化
ナトリウム0.25ｇ／ｌをハイドロサルファイトナトリウ
ム75mg／ｌに代え、ＢＭＥ−６９株を30℃で７日管培養
した。その結果、ビタミンＢ₁₂生産量は 3.0mg／ｌ、1
1.7mg／（乾燥菌体１ｇ）であった。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 三木 克哉 茨城県つくば市千現１丁目14−14 パー クハイツ千現301 (72)発明者 蔭山 貞夫 東京都杉並区荻窪１丁目39−13 審査官 甲斐 順子 (56)参考文献 特開 平３−65179（ＪＰ，Ａ) 特開 平３−87194（ＪＰ，Ａ) 特開 昭62−122593（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12P 19/00 - 19/64

Claims (1)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 アセトバクテリウム属に属するＢＭＥ−
   ６９株の変異株であるＦＥＲＭ Ｐ−１２７３０又はＦ
   ＥＲＭ Ｐ−１２７３１を、四塩化炭素を含む培地で培
   養し、培養物からビタミンＢ_１２を採取することを特徴
   とするビタミンＢ_１２の製造方法。