CN110804572A - 一株链霉菌及其制备ε-聚赖氨酸的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一株链霉菌及其制备ε‑聚赖氨酸的方法，属于微生物发酵工程领域。本发明提供的小白链霉菌(Streptomyces albulus)GS‑114对3μg/mL、1μg/mL和0.1μg/mL或更高浓度的链霉素、庆大霉素和利福霉素具有抗性，并可以高效大量合成ε‑PL，发酵192h产量可达到56.3g/L，生产效率高达7.03g/L/d。该菌株还具有良好的传代稳定性，是一株极具潜力的ε‑PL工业生产菌株。

Description

一株链霉菌及其制备ε-聚赖氨酸的方法
技术领域
本发明涉及一株链霉菌及其制备ε-聚赖氨酸的方法，属于微生物发酵工程领域。
技术背景
ε-聚赖氨酸(简写ε-PL)是一种主要由小白链霉菌(Streptomyces albulus)经液态好氧发酵分泌获得的新型天然生物食品防腐剂。ε-PL抑菌谱广、极易溶于水、热稳定强、安全性高，相继被日本、美国、韩国、欧洲和中国相继批准为新品种食品添加剂并普遍应用于食品工业中。同时作为一种阳离子生物聚合物，ε-PL被广泛用作生物可降解材料、药物载体，生物芯片外被、乳化剂、高吸收性水凝胶和抗癌增进剂等领域，具有广阔的市场应用前景。目前ε-PL在国内国际市场价格较为昂贵(约1200元/kg)，究其原因是缺少能高效合成ε-PL的具有知识产权的微生物菌种，最终导致ε-PL生产成本的增加。因此，选育ε-PL合成能力高的菌株，优化ε-PL发酵、分离和精制的方法具有重要的理论意义和广阔的市场应用前景。
目前为止，岩田敏治等在中国申请的专利(名称：大量生产ε-聚-L-赖氨酸的菌株和生产方法，专利号：97182253.0)公开了一株对浓度10mg/mL或更高浓度的S-2-氨基乙基-L-半胱氨酸(AEC)具有抗性的高产诱变菌B21021(FERM BP-5926)，并从发酵液中分离和提取了ε-PL。1989年，日本Chisso公司利用小白色链霉菌实现了产业化生产，ε-PL产量达到48.3g/L，为国际上报道的最高水平。
贾士儒等的专利(名称：一种诱变菌株白色链霉菌TUST2及利用该诱变菌株生产ε-聚赖氨酸及其盐的方法，专利号：200710057098.4)公开了一株经紫外诱变、化学诱变相与氮离子注入等诱变方法选育出的、对10mg/mL或更高的AEC和ε-PL具有抗性的高产菌株TUST2，其ε-PL产量为20g/L。
宋存江等申请的专利(名称：一株链霉菌及其应用，专利号：201210081685.8)中公开了一株生产ε-PL的链霉菌Streptomyces sp.NK-49(CCTCC No.5932)，以及利用该菌发酵生产ε-PL和产物分离纯化的方法，ε-PL的产量为0.8～2.4g/L。
徐虹等申请的专利(名称：一种小白链霉菌及其在制备聚赖氨酸和聚二氨基丁酸中的应用)公开了一株小白链霉菌Streptomyces albulus PD-1(CCTCCM 2011043)，采用该菌作为出发菌株进行发酵生产后，ε-PL产量达到30g/L以上；在此基础上，通过在PD-1的基因组上过表达铵转运蛋白基因amtB构建了一株小白链霉菌基因工程菌Streptomycesalbulus PD-4，提高了氮源利用效率，ε-PL的产量达到35.7g/L。虽然工程菌的ε-PL合成效率有所提高，但由于基因工程仅提高了单一代谢通路、而不是多条代谢通路的强度，因此小白链霉菌ε-PL产量仍有提升空间。
目前虽然已报道了几株ε-PL高产菌，但就其ε-PL和葡萄糖转化率而言，据日本的报道还有一定的距离。因此，筛选具有更高产量的ε-PL生产菌株十分重要。常见的ε-PL高产菌株的选育的方法是筛选具有L-赖氨酸结构类似物抗性和产物ε-PL抗性的突变菌株，然而这些“筛子”筛选效果一般，价格也十分昂贵，不适合大规模的应用于育种工作。
发明内容
本发明的第一个目的是提供一株具有高效合成ε-PL能力的小白链霉菌(Streptomyces albulus)GS-114，于2019年7月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CCTCC NO:M2019590，保藏地址为中国，武汉，武汉大学。
本发明的第二个目的是提供含有所述微生物的组合物。
在一种实施方式中，所述组合物为微生物制剂。
在一种实施方式中，所述微生物制剂包括所述小白链霉菌GS-114和细胞保护剂。
在一种实施方式中，所述细胞保护剂是体积分数为30～90％的甘油。
在一种实施方式中，所述小白链霉菌GS-114的含量≥1×104CFU/g或1×104CFU/mL。
本发明的第三个目的是提供所述小白链霉菌GS-114的应用。
本发明的第四个目的是提供一种生物法发酵合成ε-PL的方法，是利用所述小白链霉菌GS-114菌株在含碳源的培养基中发酵，生产ε-PL。
在一种实施方式中，所述方法是以葡萄糖、甘油、琥珀酸、果糖、蔗糖、麦芽糖乳糖或阿拉伯糖为中的一种或几种为生长碳源，经微生物发酵合成ε-PL。
在一种实施方式中，所述方法是以有机氮源牛肉膏、酵母提取物、蛋白胨、鱼粉、玉米浆等，以及无机氮源(NH4)2SO4、NH4Cl、NH4 NO3中的一种或几种为生长氮源，经微生物发酵合成ε-PL。
在一种实施方式中，所述方法是在28～30℃发酵120～192h。
在一种实施方式中，所述方法是在YP发酵培养基中，将发酵过程pH调控为3.6～4.6，于28～35℃、1.0～2.0vvm搅拌通气条件下发酵，当发酵液中葡萄糖浓度和铵态氮浓度分别降到10g/L和1g/L以下时，开始补充850g/L碳源葡萄糖和终浓度为35g/L的氮源硫酸铵。
在一种实施方式中，所述方法是在YP发酵培养基中，通过5mol/L浓度的氨水将发酵过程调控pH为3.6～4.4，于30℃、1vvm搅拌通气条件下发酵，并于发酵48h时(葡萄糖浓度和铵态氮浓度分别降到10g/L和0.5g/L以下)开始补充碳源葡萄糖和氮源硫酸铵，控制发酵液中葡萄糖浓度1～10g/L，铵态氮浓度在0.1～1g/L。
在一种实施方式中，所述方法在是在YG发酵培养基中，通过5mol/L浓度的氨水将发酵液的pH控制在3.6～4.4之间，于30℃、1vvm搅拌通气条件下发酵，并于发酵48h时开始补充碳源纯甘油和终浓度为35g/L的氮源硫酸铵。
在一种实施方式中，所述方法以5-15％的接种量接种浓度为1×108～5×108CFU/mL的种子液。
在一种实施方式中，以5-15％的接种量接种菌浓为1×108～5×108CFU/mL的种子液，初始搅拌转速150～350r/min，通风量设定为1vvm，罐压0.05MPa，当溶氧浓度降低到20％以下时转速自动上升将溶氧控制在20％～40％，直至达到最高转速800r/min为止；采用5mol/L浓度的氨水将发酵液的pH控制在3.5～4.5之间，于30℃搅拌通气条件下进行发酵；并于发酵40h时开始补充浓度分别为850g/L的葡萄糖溶液碳源和35g/L的硫酸铵氮源。
在一种实施方式中，所述方法还调控发酵液pH在5.0～6.0一段时间后分别将转速和通气量固定在800rpm和2vvm，待pH下降至2.8～3.3后持续一段时间至溶氧上升至40％～80％后，采用5mol/L浓度的氨水将发酵液的pH控制在3.6～4.4。发酵于30℃，200～800rpm搅拌通气条件下进行，通风量设定为1vvm，调控转速控制溶氧为20％；为避免高浓度甘油和硫酸铵对菌体生长的抑制，于发酵48h时开始补充葡萄糖碳源和硫酸铵氮源。
在一种实施方式中，还对发酵液中的ε-PL进行分离与纯化。为实现这一目的，本发明采取以下技术方案和操作步骤：
(1)发酵液4500～8000rpm离心10～20min和去除菌体，收集上清；
(2)利用超滤去除大部分杂蛋白；
(3)采用一级弱酸型离子交换树脂与二级弱碱型离子交换树脂处理超滤透过液，进一步去除色素和蛋白；
(4)利用纳滤对流出液进行脱盐和浓缩；
(5)将浓缩液进行脱色，并进行冷冻干燥，得到ε-聚赖氨酸及其盐酸盐成品。
本发明还要求保护所述小白链霉菌GS-114或上述任一所述方法在制备ε-PL或其衍生产品方面的应用。
本发明的有益效果：
1、本发明的小白链霉菌GS-114具有很强的ε-PL合成能力。该菌株能够以葡萄糖为碳源，通过分批补料发酵192h大量合成ε-PL，产量可达到56.3g/L，生产效率高达7.03g/L/d。
2、小白链霉菌GS-114可以葡萄糖为碳源大量合成高聚合度(范围为24-34)的ε-PL产品。
3、本发明的小白链霉菌GS-114还具有优良的传代稳定性：经6次连续传代培养后，在YG发酵培养基中的摇瓶产量稳定在2.8±0.12g/L。
4、发明人经大量研究分析，发现对3μg/mL、1μg/mL和0.1μg/mL或更高浓度的链霉素、庆大霉素和利福霉素具有耐受性的菌株具有更高的产聚赖氨酸的能力，该菌株经液体好氧发酵可大量合成ε-PL，摇瓶产量由1.72±0.08提升到2.8±0.12g/L。
生物材料保藏
小白链霉菌GS-114，分类学命名为小白链霉菌(Streptomyces albulus)GS-114，于2019年7月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CCTCC NO:M2019590，保藏地址为中国，武汉，武汉大学。
附图说明
图1为小白链霉菌GS-114与出发菌M-Z18的培养特征差异；
图2为不同培养基条件下高产菌GS-114和出发菌M-Z18的摇瓶发酵结果差异；
图3为小白链霉菌GS-114和出发菌M-Z18利用甘油为碳源发酵生产ε-PL；
图4为小白链霉菌GS-114和出发菌M-Z18利用不同碳源生产的ε-PL聚合度分布差异；
图5为小白链霉菌GS-114利用葡萄糖为碳源发酵生产ε-PL；
具体实施方式
下面结合具体的实例对本发明作进一步详述，以下实施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。
1.本发明的出发菌株M-Z18是以来自山东的土壤中筛选获得的野生菌Z-18为出发菌株经诱变获得，其可以在以琥珀酸为唯一碳源的平板上生长，对15g/L或更高浓度的磺胺胍具有抗性。
2.本发明的高产菌株GS-114是M-Z18经基因组重排后获得，其对3μg/mL、1μg/mL和0.1μg/mL或更高浓度的链霉素、庆大霉素和利福霉素具有抗性。
3.链霉素和庆大霉素能分别与胞内核糖体S12蛋白和L6蛋白结合，菌株因蛋白翻译过程受抑制而死亡；利福霉素能与RNA聚合酶结合，菌体因RNA形成受抑制而死亡。具有链霉素、庆大霉素和利福霉素抗性的菌株有很强的初级与次级代谢产物合成能力。
实施例1：小白链霉菌GS-114的选育
贝特纳固体培养基(按g/100mL计)：葡萄糖2，酵母提取物0.2，蛋白胨0.4，琼脂2，，pH 7.5，115℃灭菌20min。
抗生素抗性培养基(按g/100mL计)：葡萄糖2，酵母提取物0.2，蛋白胨0.4，琼脂2，pH 7.5，115℃灭菌20min。待培养基温度降至60℃时，向其中添加事先配制好、经0.22μm膜过滤除菌的链霉素、庆大霉素和利福霉素母液。
具体步骤如下：
(1)突变库的构建：采用2％(v/v)DES对出发菌小白链霉菌M-Z18(保藏编号为CCTCC NO：M 2019589，菌株记载于申请号为201911020454.4的专利申请中)孢子悬浮液进行30min处理(28℃水浴)，加入NaS2O3使反应终止，稀释并涂布在含3μg/mL链霉素、1μg/mL庆大霉素和0.1μg/mL利福霉素的贝特纳抗性平板上，选取生长速度快、产孢能力强、菌落形态变化大的菌株至斜面培养基中划线培养，30℃恒温培养5-8天至孢子成熟，评价所得诱变菌株的ε-PL产量和产率，获得高产链霉素抗性、庆大霉素抗性和利福霉素抗性突变库。
(2)从步骤(3)中的三种抗生素抗性突变库中，分别选择产量最高的菌接入YHP液体培养基，30℃，200rpm培养28h，经离心洗涤两次后加入终浓度为5mg/mL的溶菌酶，30℃水浴120min制备原声质体。加入40％(W/V)的PEG6000温浴(10min)后，稀释涂布于同时含有3μg/mL链霉素、1μg/mL庆大霉素和0.1μg/mL利福霉素的再生平板(按g/L计，含有蔗糖10，葡萄糖2，蛋白胨0.4，酵母粉0.3，MgCl2·6H2O 1，琼脂2，及微量元素溶液2mL，TES溶液10mL，CaCl2 0.3，KH2PO4 0.005，pH 6.8；其中CaCl2和KH2PO4以灭菌溶液的形式加入)。30℃恒温培养10-15天，选取中生长速度快、产孢能力强、菌落形态变化大的50～100株菌落至斜面培养基中划线培养，30℃恒温培养6～10d至孢子成熟。以此类推，共进行了三轮基因组重排育种，评价所得诱变菌株的ε-PL产量和产率，获得高产突变株GS-114。将突变株GS-114保藏于浓度为30～70％的甘油中，-20℃～80℃保藏，备用。
实施例2：出发菌M-Z18与高产菌GS-114的形态特征
对菌株的形态进行肉眼观察与显微镜分析。
由图1可知，两株菌在形态学上存在明显差异。在蛋白胨酵母膏培养基上，出发菌株M-Z18菌落较大，气生菌丝生长良好，菌落及其背面呈黄色或黄褐色。在YP液体培养基内，M-Z18菌丝相互缠绕，形成较大的实心菌球。
菌株GS-114菌落较小，在蛋白胨酵母膏培养基上，气生菌丝生长良好，孢子成灰绿色链状，在显微镜下呈椭圆形；菌落及其背面呈黄绿色或黄褐色。在YP液体培养基内，GS-114菌丝较为松散，菌球较小。
实施例3：不同培养基条件下高产菌GS-114和出发菌M-Z18摇瓶产量的差异
M3G种子培养基(按g/100mL计)：葡萄糖5，(NH4)2SO4 1，Na2HPO4 0.14，KH2PO40.1，MgSO7·H2O 0.025，ZnSO7·H2O 0.005，FeSO7·H2O 0.001，酵母粉0.5，pH 6.8，115℃灭菌20min。
RSM液体发酵培养基(按g/100mL计)：葡萄糖6，(NH4)2SO4 0.5，牛肉浸膏1，KH2PO40.4，MgSO4 0.08，FeSO4 0.005，115℃灭菌20min，自然pH发酵。
YP液体发酵培养基(按g/100mL计)：葡萄糖3，(NH4)2SO4 0.5，酵母粉0.8，KH2PO40.4，MgSO4 0.08，FeSO4 0.005，115℃灭菌20min，自然pH发酵。
将纯化的GS-114孢子接种于分装有M3G的培养基中，30℃×200rpm摇瓶培养24h制备成为种子液。将种子液以8％的接种量分别接种于M3G、RSM和YP液体发酵培养基，摇瓶发酵培养72h。利用甲基橙检测法检测所得突变株发酵上清液中ε-PL的含量。M-Z18和GS-114的摇瓶发酵结果见图2，由图可知，GS-114在三种培养基上的产量均优于M-Z18，尤其是在YP液体发酵培养基中，GS-114的ε-PL产量达到1.85g/L，较M-Z18提高了69％。在M3G培养基中，GS-114单位菌体的ε-PL合成能力达0.33d-1，较M-Z18提高了83％。
实施例4：小白链霉菌高产菌GS-114和出发菌M-Z18利用甘油为碳源控酸分批补料发酵生产ε-PL
YG液体发酵培养基(按g/100mL计)：甘油6，(NH4)2SO4 0.5，酵母粉0.8，KH2PO4 0.4，MgSO4 0.08，FeSO4 0.005，均为质量-体积分数，121℃灭菌20min，自然pH发酵.
将3L的YG发酵培养基装入5L的生物反应器，121℃灭菌20min。将斜面上活化的菌株M-Z18和GS-114分别接种于M3G种子培养基中，30℃×200rpm摇瓶培养24h制备成为1×108～5×108CFU/mL种子液。种子和发酵培养基的配制方法同实施例3。将种子液以8％的接种量接入冷却后的发酵液中，在192h的整个发酵过程中，使用生物反应器控制温度30℃，通气量1vvm，调控转速控制溶氧为30％，以5mol/L氨水控制pH在3.8～4.1范围内，流加葡萄糖控制碳源浓度在1～10g/L。发酵上清液采用甲基橙比色法或检测高效液相色谱检测ε-PL含量，结果如图4所示。在整个发酵过程中，GS-114菌株始终具有活力ε-PL浓度逐步增加，而M-Z18在168h后便不再合成ε-PL，说明GS-114菌株比M-Z18有更强的ε-PL合成能力。GS-114在发酵192h时ε-PL的浓度为45.7g/L，生产效率达到5.7g/L/d，是M-Z18的1.14倍。
实施例5：ε-PL盐酸盐的制备
实施例3中获得的发酵液首先经4500～8000rpm离心10～20min和去除菌体，收集上清，再利用超滤去除大部分杂蛋白，随后采用采用一级弱酸型离子交换树脂与二级弱碱型离子交换树脂处理超滤透过液，进一步去除色素和蛋白，再利用纳滤对流出液进行脱盐和浓缩，浓缩液经活性炭脱色后冷冻干燥，得到ε-聚赖氨酸及其盐酸盐成品。借助辅助激光解析电离串联飞行时间质谱仪(MALDI-TOF-MS)分析纯化(具体方法参见ApplBiochemBiotechnol,2016,180:1601-1617)后的M-Z18和GS-114的ε-PL产品，结果如图4所示，发现以甘油为碳源时，两株菌所产ε-PL的聚合度为10-32，而以葡萄糖为碳源时，两株菌所产ε-PL的聚合度均为20-34。由于以葡萄糖为碳源发酵获得的ε-PL的聚合度较高(抑菌性较好)，因此虽然甘油发酵的产量高于葡萄糖，在工业生产中仍选择了葡萄糖作为ε-PL发酵的唯一碳源。
实施例5：小白链霉菌高产菌GS-114利用葡萄糖为碳源发酵生产ε-PL
将3L的YP发酵培养基装入5L的生物反应器，121℃灭菌20min。将斜面上活化的菌株GS-114接种于M3G种子培养基中，30℃×200rpm摇瓶培养24h制备成为1×108～5×108CFU/mL种子液。种子和发酵培养基的配制方法同实施例3。将种子液以8％的接种量接入冷却后的发酵液中，在192h的整个发酵过程中，使用生物反应器控制温度30℃，通气量1vvm，调控转速控制溶氧为30％，以5mol/L氨水控制pH为3.8～4.3，流加葡萄糖和硫酸铵溶液控制碳源浓度在1～10g/L，氮源浓度在0.1～1g/L。发酵上清液采用甲基橙比色法或检测高效液相色谱检测ε-PL含量，结果如图5所示。
在整个发酵过程中，GS-114菌株始终具有活力ε-PL浓度逐步增加，发酵192h时ε-PL的浓度为56.3g/L，生产效率高达7.03g/L/d，比出发菌M-Z18提高了43％，超过了国际最高ε-PL产量(48.3g/L)和ε-PL产率(6.03g/L/d)，证明GS-114是一株极具潜力的ε-PL工业生产菌株。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (10)

1.一株具有高效合成ε-PL能力的小白链霉菌(Streptomyces albulus)GS-114，于2019年7月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2019590。
2.含有权利要求1所述小白链霉菌GS-114的组合物。
3.一种微生物制剂，其特征在于，包含权利要求1所述的小白链霉菌GS-114和细胞保护剂。
4.根据权利要求2或3所述的组合物，其特征在于，所述小白链霉菌GS-114的含量≥1×104CFU/g或1×104CFU/mL。
5.一种生物法生产ε-PL的方法，其特征在于，利用权利要求1所述的小白链霉菌GS-114菌株进行发酵；所述发酵是在含葡萄糖、甘油、琥珀酸、果糖、蔗糖、麦芽糖乳糖、阿拉伯糖中的一种或多种成分的碳源，并含有机氮源或无极氮源的环境下发酵。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述有机氮源包括酵母提取物、牛肉膏、鱼粉中的至少一种；所述无机氮源包括(NH4)2SO4、(NH4)2Cl或其混合物。
7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于，在28～35℃发酵24～192h。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，发酵过程调控pH为3.6～4.6，当发酵液中碳源浓度和氮源浓度分别降到10g/L和0.5g/L以下时，补充碳源和氮源。
9.根据权利要求5～8任一所述的方法，其特征在于，对发酵后的发酵液中的ε-PL进行分离与纯化。
10.权利要求1所述的小白链霉菌GS-114、权利要求2～4任一所述的组合物或权利要求5～9任一所述方法在制备ε-PL或其衍生产品方面的应用。
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