CN114806946B - 白色链霉菌pd9-pld3及其在ε-聚赖氨酸生产中的应用 - Google Patents

白色链霉菌pd9-pld3及其在ε-聚赖氨酸生产中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株高产ε‑聚赖氨酸的基因工程菌——白色链霉菌(Streptomycesalbulus)pd9‑pld3，其保藏号为CCTCC M 20211549。本发明还公开了所述工程菌用于发酵生产ε‑聚赖氨酸的应用，以及一种用于所述的白色链霉菌(Streptomycesalbulus)pd9‑pld3的优化的发酵培养基。本发明的白色链霉菌(Streptomyces albulus)的ε‑聚赖氨酸产量相比出发菌得到了显著提高，并且能够实现对ε‑聚赖氨酸降解酶的抑制。

Description

白色链霉菌pd9-pld3及其在ε-聚赖氨酸生产中的应用
技术领域
本发明涉及工业微生物技术领域，具体地说，是关于一株基因工程菌——白色链霉菌(Streptomyces albulus)pd9-pld3及其在ε-聚赖氨酸生产中的应用。
背景技术
ε-聚赖氨酸(ε-poly-L-lysine)是一种高效广谱的新型生物防腐剂，是由L-赖氨酸的α-羧基和ε-氨基连接形成的聚合物，一般含有25～35个赖氨酸残基，纯化成品为淡黄色粉末，易溶于水，吸湿性强，略有苦味。与其它防腐剂相比，ε-聚赖氨酸具有抑菌谱广、抑菌效率高、稳定性好、安全性高的特点。ε-聚赖氨酸对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、酵母菌、霉菌均有抑菌效果，对耐热性芽孢杆菌和一些病毒也有抑制作用；在食品中的添加量少却高效；能适应较宽的pH范围，可以随食品一起灭菌，具有很高的热稳定性；ε-聚赖氨酸的用途十分广泛。在食品工业中，还可用作乳化剂、食疗剂；在医药行业中，可用作药物载体以及高吸水性的生物材料。
白色链霉菌(Streptomyces albulus)是ε-聚赖氨酸的工业生产菌株，但白色链霉菌内同时还存在ε-聚赖氨酸降解酶(ε-poly-L-lysine degrading enzyme，pld)用以降解ε-聚赖氨酸，实现对细胞的自我保护。
发明内容
本发明的目的就在于针对白色链霉菌(Streptomyces albulus)在发酵生产ε-聚赖氨酸的过程中由于存在ε-聚赖氨酸降解酶而导致产量受限的问题，从而提供一种改造的基因工程菌，以提高ε-聚赖氨酸的产量，降低ε-聚赖氨酸降解酶的活性。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
本发明的第一个方面，提供了一株高产ε-聚赖氨酸的基因工程菌——白色链霉菌(Streptomyces albulus)pd9-pld3，所述菌株的保藏号为CCTCC M 20211549。
本发明的第二个方面，提供了所述白色链霉菌(Streptomyces albulus)pd9-pld3用于发酵生产ε-聚赖氨酸的应用。
根据本发明的优选实施例，所述发酵生产ε-聚赖氨酸的培养基为添加了CaCO3的M3G培养基。
优选的，所述CaCO3的添加量为0.2wt％～0.5wt％；更好的，所述CaCO3的加入量为0.5wt％。
本发明的第三个方面，提供了一种优化的发酵培养基，用于所述的白色链霉菌(Streptomyces albulus)pd9-pld3，所述培养基为添加了0.2wt％～0.5wt％的CaCO3的M3G培养基。
优选的，所述CaCO3的加入量为0.5wt％。
本发明具有以下有益效果：
1、本发明通过基因工程手段实现了对白色链霉菌(Streptomyces albulus)内ε-聚赖氨酸降解酶的抑制，构建了新的基因工程菌(Streptomyces albulus)pd9-pld3。
2、本发明对摇瓶发酵白色链霉菌生产ε-聚赖氨酸的发酵培养基配方进行了优化，通过添加CaCO3来实现对摇瓶发酵过程中pH值的控制，增加摇瓶发酵的稳定性，ε- 聚赖氨酸产量获得了显著提高。
附图说明
图1为p152-dCas9-pld抑制质粒谱图。
图2为菌株构建抗性基因PCR验证图。
图3为ε-聚赖氨酸降解酶酶活测定图。
图4为摇瓶发酵优化图。
图5为基因工程菌pd9-pld3与出发菌NK660生产ε-聚赖氨酸能力比较图。
图6为基因工程菌pd9-pld3与出发菌NK660的ε-聚赖氨酸降解酶酶活的比较图。
本发明从白色链霉菌(Streptomyces albulus)NK660衍生而来一株白色链霉菌菌株，分类命名为白色链霉菌(Streptomyces albulus)pd9-pld3，已于2021年12月7 日提交中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号为：CCTCC NO: M 20211549。保藏单位地址：中国武汉武汉大学。
具体实施方式
以下通过具体实施例对本发明做进一步地详细描述。应理解，所描述的实施例仅用于说明本发明，而非用于限定本发明的范围。
以下实施例中使用到的培养基(其中的组分含量(％)为重量百分比含量)如下：
M3G培养基：葡萄糖5％，酵母粉0.5％，(NH4)2SO4 1％，K2HPO4·3H2O 0.1048％，KH2PO4 0.136％，浓缩盐溶液(MgSO4·7H2O，FeSO4·7H2O，ZnSO4·7H2O)100mL， pH6.8。葡萄糖单独灭菌。
MS培养基：2％甘氨酸，2％热榨黄豆饼粉，2％琼脂。
LB培养基：1％蛋白胨，0.5％酵母提取物，1％氯化钠。
TSB培养基：1.5％胰蛋白胨，0.5％大豆蛋白胨，0.5％氯化钠。
以下实施例中，构建基因工程菌的步骤所使用的实验材料，如内切酶、质粒、微生物菌株等，除特别说明的外，均可通过常规市售途径获得。实验过程中所涉及的操作也均为本技术领域的常规操作，可参考例如《分子克隆》等，或者按产品说明书操作。
实施例1、基因工程菌的构建
1、p152-dCas9抑制质粒的构建
将整合质粒pSET152作为p152-dCas9抑制质粒的骨架，如图1所示，该质粒中dCas9基因的表达由组成型强启动子ermE*p驱动并由fd终止子终止；sgRNA由来自大肠杆菌的启动子j23119转录，并由T0终止子终止。所述dCas9基因从Cas9核酸酶衍生而来，分别在HNH域和RuvC域(D10A和H840A)发生点突变。
选取目的基因ε-聚赖氨酸降解酶(ε-poly-L-lysine degrading enzyme，pld)基因序列的668-688bp处作为PAM位点的N20序列，序列为：
gggctgaccgcgttgatcac(SEQ IN NO:1)。
质粒构建引物设计如下：
pld-dcas9-pam3F：
cctaggtataatactagtgggctgaccgcgttgatcacgttttagagctagaaatagcaagt(SEQ INNO:2)；
dcas9-R：tatgacatgattacgaattcgg(SEQ IN NO:3)。
利用Hind III和SpeI限制性酶切位点切割质粒，用上述引物获取带PAM的目的片段后，利用ClonExpress II one step克隆试剂盒(Vazyme Biotech Co.Ltd.,Nanjing,China)将目的基因片段克隆到质粒pSET152上，得到抑制质粒p152-dCas9。
2、基因工程菌的构建
利用接合转移进行种间遗传转化：将构建的p152-dCas9抑制质粒转化至穿梭菌大肠杆菌ET12567中，利用该菌株进行与白色链霉菌的接合转移，具体步骤如下：
S1：在接合转移操作的前一天，挑取包含p152-dCas9抑制质粒的穿梭菌大肠杆菌ET12567单菌落，于含50μg/mL卡那霉素、50μg/mL氯霉素和50μg/mL安普霉素的LB液体培养基中，于37℃、220rpm摇床过夜培养；然后吸取500uL细菌培养液，转移到25mL/250mL LB液体中继续培养约4-6h，至OD值0.4-0.6，于50mL离心管， 4℃、8000rpm冷冻离心机离心，收集菌体，再用相同体积的LB液体分别洗涤两次除去抗生素，获得供体菌细胞。
S2：取长好的白色链霉菌(Streptomyces albulus)NK660新鲜斜面，接种到 50mL/250mL TSB液体培养基中，于28℃、220rpm摇床震荡培养24h，得到一级种子液；取1％的一级种子液接种到二级TSB培养基中，相同条件下继续培养24h，于 50mL离心管，4℃、8000rpm冷冻离心机离心收集菌体，再用相同体积的LB液体分别洗涤两次，获得感受态的宿主菌细胞。
S3：将含有p152-dCas9抑制质粒的供体菌(大肠杆菌ET12567)和受体菌(白色链霉菌NK660)分别用2mL LB稀释后按1:1混合，各取200uL混合液均匀地涂布到MS培养基平板上，于28℃恒温培养箱中培养18-20h，然后取出，给培养基覆盖5-10mM的Apr和萘啶酮酸钠，在30℃继续培养2-3天，待培养基上长出结合子。
3、基因工程菌的验证
接合转移操作结束后，对培养基上长出的结合子进行构建菌株的筛选验证，具体如下：
首先挑取培养基上生长出来的单菌落，在含100μg/mL安普拉霉素Apr的MS培养基上划线验证，初步筛选掉因链霉菌自身抗性原因而导致的假阳性。
经30℃培养2-3天后，待抗性板上生长出单克隆，即可进行PCR验证。利用如下引物对质粒上Apr抗性基因进行PCR，来验证质粒是否成功进入菌株内。
AprF：gtgcaatacgaatggcgaaaagc(SEQ IN NO:4)；
AprR：gccaatcgactggcgagc(SEQ IN NO:5)。
PCR扩增产物通过测序验证，结果如图2所示，在1000bp位置有条带，显示 p152-dCas9抑制质粒已成功转入白色链霉菌中，获得的基因工程菌命名为白色链霉菌(Streptomyces albulus)pd9-pld3，该基因工程菌已于2021年12月7日提交中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号为：CCTCC M 20211549。
为验证本发明获得的基因工程菌(Streptomyces albulus)pd9-pld3的传代稳定性，我们同时对传三代后的工程菌进行PCR验证，结果同样显示在图2中，可知本发明获得的基因工程菌(Streptomyces albulus)pd9-pld3具有较好的传代稳定性。
实施例2、ε-聚赖氨酸降解酶酶活测定
由于ε-聚赖氨酸降解酶位于细胞膜上，因此将实施例1的方法获得的白色链霉菌(Streptomyces albulus)pd9-pld3的发酵液菌体破碎后制成粗酶液，加入ε-聚赖氨酸作为底物，在30℃、pH＝7的条件下反应60min，通过HPLC高效液相色谱测定ε-聚赖氨酸的降解量，以计算出降解速率，用降解速率来反映ε-聚赖氨酸降解酶的相对活性。
HPLC测定ε-聚赖氨酸含量方法为：
将发酵培养获得的发酵液取样，在12000rpm下离心15分钟，分离菌体，过滤得到澄清滤液；将滤液稀释适当倍数，使用高效液相色谱测定ε-聚赖氨酸产量。
HPLC的色谱柱为C18柱，流动相为8％乙腈，流速为0.4mL/min，检测波长215 nm，进样体积20μL，柱温箱温度40℃。
图3显示了粗酶液降解ε-聚赖氨酸的结果，可见随着粗酶液体积的增加，ε-聚赖氨酸的消耗量也增加，可知利用粗酶液降解ε-聚赖氨酸速率来反映ε-聚赖氨酸降解酶的相对活性的方法是可行的。
实施例3、摇瓶发酵实验的配方优化
对实施例1的方法获得的白色链霉菌(Streptomyces albulus)pd9-pld3摇瓶发酵生产ε-聚赖氨酸的摇瓶发酵配方进行优化。
大量文献表明白色链霉菌发酵过程中，ε-聚赖氨酸的产物积累与pH息息相关。在摇瓶实验中，由于无法实现对pH的精准调控，为了避免白色链霉菌由于消耗葡萄糖导致pH下降过快影响菌株的积累富集，进而影响到最终ε-聚赖氨酸的产量，我们通过在培养基中加入CaCO3来减缓摇瓶发酵过程中pH的下降速度。
利用白色链霉菌(Streptomyces albulus)pd9-pld3发酵培养基M3G作为出发培养基，将CaCO3的添加比例分别设置为0％，0.2％，0.5％，0.8％，进行对出发菌株白色链霉菌(Streptomyces albulus)NK660的96h摇瓶发酵，通过测定发酵过程中的pH和ε-聚赖氨酸的产物积累情况来判断CaCO3添加的最佳优化比例，结果如图4所示。
由图4的结果可知，CaCO3的添加比例为0.2％和0.5％时，发酵96小时后ε-聚赖氨酸的产物积累最多，说明恰当比例的CaCO3的添加有利于摇瓶发酵中的ε-聚赖氨酸积累。
实施例4、基因工程菌pd9-pld3与出发菌NK660生产ε-聚赖氨酸能力的比较
将基因工程菌(Streptomyces albulus)pd9-pld3与出发菌(Streptomycesalbulus) NK660利用优化过的摇瓶发酵培养基配方(葡萄糖5％，酵母粉0.5％，(NH4)2SO41％， K2HPO4·3H2O 0.1048％，KH2PO4 0.136％，浓缩盐溶液(MgSO4·7H2O，FeSO4·7H2O，ZnSO4·7H2O)100mL，CaCO3 0.5％)同时进行96h摇瓶发酵，分别收集0h，12h， 24h，48h，60h，72h，84h，96h的发酵液，称量同等重量的菌体进行破碎，在同样的条件下完成酶活测定实验，以进一步对出发菌(Streptomyces albulus)NK660与抑制基因工程菌(Streptomycesalbulus)pd9-pld3的ε-聚赖氨酸产量、ε-聚赖氨酸降解酶pld 酶活的测定与比较，结果分别如图5和图6所示。
图5的结果显示，在96小时的摇瓶发酵过程中，两菌株的pH变化情况差别不大，但基因工程菌(Streptomyces albulus)pd9-pld3的ε-聚赖氨酸产量明显高于出发菌(Streptomyces albulus)NK660，在96h时，基因工程菌(Streptomyces albulus)pd9-pld3的ε-聚赖氨酸产量达到0.933g/L，是出发菌(Streptomyces albulus)NK660的1.67 倍。
图6的结果显示，在96小时的摇瓶发酵过程中，基因工程菌(Streptomycesalbulus) pd9-pld3的ε-聚赖氨酸降解酶pld酶活相比出发菌(Streptomyces albulus)NK660降低了约20.7％，从而有利于产物ε-聚赖氨酸的积累。
序列表
<110> 上海清美绿色食品（集团）有限公司
<120> 白色链霉菌pd9-pld3及其在ε-聚赖氨酸生产中的应用
<130> 221061
<141> 2022-05-05
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gggctgaccg cgttgatcac 20
<210> 2
<211> 62
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cctaggtata atactagtgg gctgaccgcg ttgatcacgt tttagagcta gaaatagcaa 60
gt 62
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tatgacatga ttacgaattc gg 22
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gtgcaatacg aatggcgaaa agc 23
<210> 5
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gccaatcgac tggcgagc 18

Claims (5)

1.一株白色链霉菌（Streptomycesalbulus）pd9-pld3，其特征在于，该菌株的保藏号为CCTCC NO: M 20211549。
2.白色链霉菌（Streptomyces albulus）pd9-pld3的应用，其特征在于，用于发酵生产ε-聚赖氨酸。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述发酵生产ε-聚赖氨酸的培养基为添加了CaCO3的M3G培养基。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述CaCO3的添加量为0.2 wt%～0.5 wt%。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述CaCO3的加入量为0.5 wt%。
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