CN102618465A - 一株链霉菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株链霉菌Streptomyces sp.NK-49及其应用，即利用该菌生产ε-聚赖氨酸的发酵培养和产物分离纯化的方法。该方法包括以下步骤：首先将保存于贝纳特斜面上的链霉菌Streptomyces sp.NK49，挑取一环孢子接种在高氏一号培养基中作为种子进行活化培养20-36h；将种子液以5-15％的接种量接种至以淀粉水解糖或淀粉水解糖与甘油为碳源的合成培养基中，摇瓶发酵培养48-96h；发酵结束后，发酵液6000～10000rpm离心处理10～20min去除菌体，收集上清，利用5M NaOH溶液将上清调整pH至8，过滤祛除沉淀的杂蛋白；利用弱酸型阳离子交换树脂吸附去除了杂蛋白的上清液中的ε-聚赖氨酸分子，蒸馏水洗涤；利用0.1-0.7mol/L的稀盐酸洗脱吸附的产物，洗脱液利用5M NaOH溶液将pH调整到中性；将中性的洗脱液进行透析，去除小分子杂质，冷冻干燥，得到ε-聚赖氨酸固体粉末；本发明中分离到的链霉菌Streptomyces sp.NK49，具有工业化生产ε-聚赖氨酸的潜力。
Description
技术领域：
本发明涉及链霉菌NK49及其用于生产具有抗菌活性的氨基酸均聚物ε-聚赖氨酸的用途和方法。
背景技术：
ε-聚赖氨酸(ε-Poly-L-Lysine，ε-PL)是一种由25-30个L-赖氨酸单体通过ε-氨基和α-羧基脱水缩合形成的同型单体聚合物多肽，其结构式为：
ε-聚赖氨酸常常由放线菌产生，对于革兰氏阴性细菌、革兰氏阳性细菌和真菌具有广谱的抑菌活性，并且能够承食品加工过程中的热处理，可随食品原料一同处理并加工。ε-聚赖氨酸已经被FDA批准可作为食品防腐。ε-聚赖氨酸安全性高、水溶性强、在人体内可分解为人体必需的氨基酸----赖氨酸，是一种营养型防腐剂。我国ε-聚赖氨酸的生产能力和水平较低，不能满足人们日益增长生活水平的需要。究其原因在于缺少ε-聚赖氨酸合成能力强的具有知识产权的微生物菌种。因此，开展微生物法合成ε-PL的研究，分离新的合成能力高的菌株，优化ε-聚赖氨酸发酵和分离与精制的方法，具有重要的理论意义和广阔的应用前景。
发明内容
本发明的目的之一是提供一株具有较强ε-聚赖氨酸生产能力的链霉菌Streptomyces sp.NK49。
本发明用于生产ε-聚赖氨酸的链霉菌NK49，分离自辽宁省沈阳地区地的 农田土壤。
菌株的16SrDNA序列分析：利用16SrDNA通用引物，得到16SrDNA序列长度为1491bp；其16SrDNA序列在GenBank中进行同源性比对后发现，该菌株与链霉菌属具有100％同源性，结果显示该菌株属于链霉菌属，命名为链霉菌Streptomyces sp.。
链霉菌Streptomyces sp.NK49的形态特征为：在贝纳特斜面上生长时初期呈凸起装半球形白色菌落，形成的菌丝将菌落牢牢固定在培养基上，不易挑起，菌落生长初期呈白色，且具有放射状褶皱，后期孢子逐渐成熟，菌落表面被灰黑色孢子覆盖。菌体光镜下呈丝状，分生孢子丝呈螺旋状，孢子椭圆形。
该菌株于2012年3月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏号为：CGMCC No：5932。
链霉菌Streptomyces sp.NK49发酵培养特征为：在利用碳水化合物进行发酵过程中会产酸。
菌种的保藏条件为将孢子利用脱脂牛奶保护后真空干燥长期保藏，或制备砂土管对孢子进行保藏；该菌平时保藏于贝纳特斜面上，便于直接应用。
本发明的第二个目的是提供链霉菌Streptomyces sp.NK49用于生产ε-聚赖氨酸的发酵培养方法。
为实现这一目的，本发明采取以下技术方案和操作步骤：
(1)将保存于贝纳特斜面上的链霉菌Streptomyces sp.NK49，挑取一环孢子接种在高氏一号培养基中作为种子进行活化培养20-36h；
(2)将种子液以5-15％的接种量接种至以淀粉水解糖或淀粉水解糖与甘油为碳源的合成培养基中，摇瓶发酵培养48-96h；
(3)发酵结束后，发酵液6000～10000rpm离心处理10～20min去除菌体，收集上清，利用5M NaOH溶液将上清调整pH至8，过滤祛除沉淀的杂蛋白；
(4)利用弱酸型阳离子交换树脂吸附去除了杂蛋白的上清液中的ε-聚赖氨酸分子，蒸馏水洗涤；利用0.1-0.7mol/L的稀盐酸洗脱吸附的产物，洗脱液利用5M NaOH溶液将pH调整到中性；
(5)将中性的洗脱液进行透析，去除小分子杂质，冷冻干燥，得到ε-聚赖氨酸固体粉末；
(6)利用HPLC对产物水解液进行测定，利用1HNMR和13CNMR对产物进行结构分析，利用MODI-TOF MS对产物聚合度和分子量进行测定。
与现有ε-聚赖氨酸生产菌株相比较，本菌株合成聚赖氨酸能力较强、生长 周期较短，且能利用淀粉糖或其水解糖，具有规模进一步利用的潜力。赖氨酸产品的潜力。
具体实施方式：
在下面的实施例中所用菌种均为链霉菌Streptomyces sp.NK49，实施例中所用各种培养基及溶液、试剂配方如下：
(1)土壤稀释液(/L)：NaH2PO4·2H2O 12.17g，蛋白胨60g，SDS 0.5g；
(2)初筛培养基平板(SGB平板)：SG平板中添加0.002％的亚甲基蓝。
(3)Dragendoff试剂：溶液1与溶液2各取5ml置于100ml棕色容量瓶中，蒸馏水定容至100ml，配制完成后使用有效期为半年；其中，溶液1：0.8g五水硝酸铋溶于40ml蒸馏水和10ml冰乙酸的混合液中；溶液2：8.0g碘化钾溶于20ml蒸馏水中。
(4)贝纳特斜面培养基(/L)：葡萄糖10g，蛋白胨2g，酵母粉1g，琼脂15g，pH 7.0；121℃灭菌20min。
(5)高氏一号培养基(/L)：可溶性淀粉20，KNO3 1，MgSO4·7H2O 0.5，NaCl 0.5，K2HPO4 0.5，Fe2(SO4)3 0.01，pH 7.4，121℃灭菌20min。
(6)淀粉水解糖合成培养基(/L)：(NH4)2SO4 10g，淀粉糖50g，酵母粉5g，KH2PO4 1.36g，K2HPO4·3H2O 0.8g，MgSO4·7H2O 0.5g，ZnSO4·7H2O 0.04g，FeSO4·7H2O 0.03g，NaOH调节pH至7.0，115℃灭菌30min。
(7)淀粉水解糖和甘油混合碳源发酵培养基(/L)：(NH4)2SO4 10g，甘油25g，淀粉糖25g，酵母粉5g，KH2PO4 1.36g，K2HPO4·3H2O 0.8g，MgSO4·7H2O0.5g，ZnSO4·7H2O 0.04g，FeSO4·7H2O 0.03g，NaOH调节pH至7.0，115℃灭菌30min。
实施例1、分离鉴定链霉菌Streptomyces sp.NK49
实验材料来自于辽宁省沈阳地区农田土壤，具体步骤如下：
将取来的新鲜土样放置于阴凉干燥处3天，后使用15％碳酸钙混合均匀，再次置于阴凉处自然通风干燥8天。取干燥过筛后的土样1g与9ml用于稀释土壤的稀释液振荡混匀，取上清梯度稀释，分别将稀释100倍和1000倍的上清液涂布于添加了50mg/L K2Cr2O7的高氏一号培养基平板用于ε-聚赖氨酸生产菌种的分离；培养7天后挑选表面干燥致密的放线菌菌落，平板划线到不含K2Cr2O7 高氏一号培养基平板纯化菌落，后挑取独立菌落，接种于SG液体培养基试管中，37℃恒温培养7天，再将团状菌落，挑取接于SGB培养基平板上，培养5天后阳性菌落就会在SGB平板上出现颜料排斥圈；再取阳性反应的菌株原有的SG培养基，上清中滴入Dragendoff试剂进行复筛，以确定生产ε-聚赖氨酸的菌株。经过16SrDNA基因序列分析，并参考伯杰氏手册之后，鉴定该菌株为链霉菌，命名为链霉菌Streptomyces sp.NK49，该菌株16SrDNAGenBank注册号为：JQ768941。进一步构建该菌株的进化树，如图1链霉菌Streptomyces sp.NK49进化树所示。
实施例2、淀粉水解糖作为单一碳源的摇瓶法培养
将保存于贝纳特斜面上的链霉菌Streptomyces sp.NK49上挑取一环孢子接种到含100ml种子培养基高氏一号培养基的500ml锥形瓶中，30℃，180rpm活化培养，活化24h；将活化种子培养物以10％接种量接种至高氏一号培养基中(摇瓶发酵时采用500ml锥形瓶，装液量为100ml)作为种子液30℃，180rpm培养24h；将种子液以15％的接种量分别接种于10瓶淀粉水解糖合成培养基中(摇瓶发酵时采用500ml锥形瓶，装液量为100ml)进行发酵30℃，180rpm培养80h；发酵结束后，培养物进行离心8000rpm离心处理20min，弃去菌体，收集上清；将上清利用D152弱酸型的阳离子交换树脂进行产物吸附，将ε-聚赖氨酸分子吸附在树脂上；弃去吸附过后的上清，利用蒸馏水洗涤树脂，洗去未吸附的杂志；利用0.2mol/L的稀盐酸洗脱吸附的产物，洗脱液利用6M的NaOH溶液将pH调节到中性；取洗脱液，冷冻干燥浓缩，浓缩液利用透过量1000Da的透析袋进行处理，祛除无机盐离子，透析液冻干后得到ε-聚赖氨酸固体产物。ε-聚赖氨酸产量为0.8-1.9g/L。进一步利用1NMR、13C NMR进行结构检测，采用MODI-TOF MS对产物聚合度和分子量进行测定。如图2产物的MODI-TOF MS检测结果图。
实施例3、以淀粉水解糖和甘油作为混合碳源的摇瓶法培养
(1)将保存于贝纳特斜面上的链霉菌Streptomyces sp.NK49上挑取一环孢子接种到含100ml种子培养基高氏一号培养基的500ml锥形瓶中，30℃，180rpm活化培养，活化24h；将活化种子培养物以10％接种量接种至高氏一号培养基 中(摇瓶发酵时采用500ml锥形瓶，装液量为100ml)作为种子液30℃，180rpm培养24h；将种子液以15％的接种量分别接种于10瓶淀粉水解糖与甘油合成培养基中(摇瓶发酵时采用500ml锥形瓶，装液量为100ml)作为种子液30℃，180rpm培养96h；发酵结束后，培养物进行离心8000rpm离心处理20min，弃去菌体，收集上清；将上清利用D152弱酸型的阳离子交换树脂进行产物吸附，将ε-聚赖氨酸分子吸附在树脂上；弃去吸附过后的上清，利用蒸馏水洗涤树脂，洗去未吸附的杂志；利用0.2mol/L的稀盐酸洗脱吸附的产物，洗脱液利用6M的NaOH溶液将pH调节到中性；取洗脱液，冷冻干燥浓缩，浓缩液利用透过量1000Da的透析袋进行处理，祛除无机盐离子，透析液冻干后得到ε-聚赖氨酸固体产物。ε-聚赖氨酸产量为0.8-2.4g/L。
Claims (2)
1.链霉菌Streptomyces sp.NK49 CGMCC No.5932；
2.链霉菌Streptomyces sp.NK49用于生产ε-聚赖氨酸的发酵培养方法，包括如下操作步骤：
(1)将保存于贝纳特斜面上的链霉菌Streptomyces sp.NK49，挑取一环孢子接种在高氏一号培养基中作为种子进行活化培养20-36h；
(2)将种子液以5-15％的接种量接种至以淀粉水解糖或淀粉水解糖与甘油为碳源的合成培养基中，摇瓶发酵培养48-96h；
(3)发酵结束后，发酵液6000～10000rpm离心处理10～20min去除菌体，收集上清，利用5MNaOH溶液将上清调整pH至8，过滤祛除沉淀的杂蛋白；
(4)利用弱酸型阳离子交换树脂吸附去除了杂蛋白的上清液中的ε-聚赖氨酸分子，蒸馏水洗涤；利用0.1-0.7mol/L的稀盐酸洗脱吸附的产物，洗脱液利用5M NaOH溶液将pH调整到中性；
(5)将中性的洗脱液进行透析，去除小分子杂质，冷冻干燥，得到ε-聚赖氨酸固体粉末；
(6)利用HPLC对产物水解液进行测定，利用1HNMR和13CNMR对产物进行结构分析，利用MODI-TOF MS对产物聚合度和分子量进行测定。
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