CN102443555B - 链霉菌Streptomyces sp.NK-660及其用于生产ε-聚赖氨酸的发酵培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了链霉菌Streptomyces sp.NK-660及其用于生产ε-聚赖氨酸的发酵培养方法。该方法包括以下步骤：首先将保藏在贝纳特斜面上的NK660取一环孢子，活化于LB培养基中作为种子液，培养24h后以10％的接种量接种于发酵培养基，发酵培养72-96h；发酵液离心去除菌体，利用阳离子交换树脂吸附产物，洗脱液经过浓缩，脱色和透析后冷冻干燥得到ε-聚赖氨酸固体粉末。本发明中分离到的链霉菌Streptomyces sp.NK660，具有很强的ε-聚赖氨酸生产能力，具有大规模工业化应用的潜力。
Description
技术领域：
本发明涉及链霉菌新菌株及其应用，特别是涉及链霉菌Streptomyces sp.NK660用于生产具有抗菌活性的氨基酸均聚物ε-聚赖氨酸的发酵培养方法。
背景技术：
ε-聚赖氨酸(ε-Poly-L-Lysine，ε-PL)是L-赖氨酸单体通过ε-氨基和α-羧基脱水缩合形成的氨基酸均聚物，其结构式为：
ε-聚赖氨酸主要是由丝状细菌和真菌分泌产生的一种抑菌物质，对于革兰氏阴性细菌、革兰氏阳性细菌和真菌具有广谱的抑菌活性。由微生物发酵合成的ε-聚赖氨酸聚合度一般为25～35。目前ε-聚赖氨酸已经由FDA批准作为食品防腐剂使用，具有安全性高、水溶性强等优点，并且在人体内分解为人体必需的氨基酸，是一种营养型防腐剂。
目前由于ε-聚赖氨酸生产菌株的生产能力较差，而且生产工艺复杂，因此，工业化生产受到限制。因此，分离生产能力强的ε-聚赖氨酸生产菌株和改善其发酵工艺都具有十分重要的意义。
发明内容：
本发明的目的之一是提供一株具有较强ε-聚赖氨酸生产能力的链霉菌Streptomyces sp.NK660。
本发明用于生产ε-聚赖氨酸的链霉菌Streptomyces sp.NK660，分离自福建古田地区地表土壤。该菌已于2011年10月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCC No.5392；命名为链霉菌Streptomyces sp.NK660。
链霉菌Streptomyces sp.NK660的形态特征为：在贝纳特斜面上生长时初期呈凸起装半球形白色菌落，形成的菌丝将菌落牢牢固定在培养基上，不易挑起，菌落生长初期呈白色，且具有放射状褶皱，后期孢子逐渐成熟，菌落表面被灰色孢子覆盖。
菌体光镜下呈丝状，分生孢子丝呈螺旋状，孢子椭圆形，表面有刺状凸起。
链霉菌Streptomyces sp.NK660发酵培养特征为：在利用碳水化合物进行发酵过程中会产酸。
菌种的保藏条件为将孢子利用脱脂牛奶保护后真空干燥长期保藏，或制备砂土管对孢子进行保藏；该菌平时保藏于贝纳特斜面上，便于直接应用。
菌株的16SrDNA序列分析：利用16SrDNA通用引物，得到16SrDNA序列为1313bp；其16SrDNA序列在GenBank中进行同源性比对后发现，该菌株与链霉菌属具有100％同源性，结果显示该菌株属于链霉菌属，命名为链霉菌Streptomyces sp.NK660。
本发明的第二个目的是提供链霉菌Streptomyces sp.NK660CGMCC No.5392用于生产ε-聚赖氨酸的发酵培养方法。
为实现这一目的，本发明采取以下技术方案和操作步骤：
(1)将保存于贝纳特斜面上的链霉菌Streptomyces sp.NK660 CGMCC No.5392，挑取一环孢子接种在LB培养基中作为种子进行活化培养18-30h；
(2)将种子液以5-10％的接种量接种至以葡萄糖或甘油作为碳源的合成培养基中，通过摇瓶发酵或者30L自动发酵罐进行发酵培养72-96h；
(3)发酵结束后，发酵液6000～10000rpm离心处理10～20min去除菌体，收集上清，利用6M NaOH溶液将上清调整pH＝8，过滤祛除沉淀的杂蛋白；
(4)将过滤后的上清置于摇瓶中，利用弱酸型阳离子交换树脂吸附产物，将ε-聚赖氨酸分子吸附在树脂上；弃去吸附过后的上清，蒸馏水洗涤树脂，洗去未吸附的杂质；利用0.4mol/L的稀盐酸洗脱吸附的产物，洗脱液利用NaOH溶液将pH调整到中性；
(5)洗脱液利用冷冻干燥浓缩，浓缩液利用透过量1000Da的透析袋进行处理，去除无机盐离子，透析液冻干后得到ε-聚赖氨酸固体产物；
(6)进行1HNMR和13CNMR图谱分析；MODI-TOF MS测定产物聚合度和分子量。
与现有ε-聚赖氨酸生产菌株相比，本发明的突出优点在于：相对于之前报道的生产菌株多为突变种，野生条件下产量不高。本菌株生产能力较强，发酵产量高，发酵生产方法更适于规模化生产。
具体实施方式：
在下面的实施例中所用菌种均为链霉菌Streptomyces sp.NK660 CGMCC No.5392，实施例中所用各种培养基及溶液、试剂配方如下：
(1)贝纳特斜面培养基(/L)：葡萄糖10g，蛋白胨2g，酵母粉1g，琼脂15g，pH 7.0；121℃灭菌20min。
(2)LB培养基(/L)：蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl 5g，pH 7.0，121℃灭菌20min。
(3)菌种分离平板——甘油合成培养基平板(SG平板)(/L)：甘油10g，琼脂18g，酵母膏0.1g，NaH2PO4 0.68g，KH2PO4 0.25g，MgSO4·7H2O 0.25g，(NH4)2SO4 0.66g，ZnSO4·7H2O0.05g，FeSO4·7H2O 0.01g，NaOH调节pH至7.0，115℃灭菌30min。
(4)初筛培养基平板(SGB平板)：SG平板中添加0.002％的亚甲基蓝。
(5)Dragendoff试剂：溶液1与溶液2各取5ml置于100ml棕色容量瓶中，蒸馏水定容至100ml，配制完成后使用有效期为半年；其中，溶液1：0.8g五水硝酸铋溶于40ml蒸馏水和10ml冰乙酸的混合液中；溶液2：8.0g碘化钾溶于20ml蒸馏水中。
(6)葡萄糖合成培养基(/L)：(NH4)2SO410g，葡萄糖50g，酵母粉5g，KH2PO4 1.36g，K2HPO4·3H2O 0.8g，MgSO4·7H2O 0.5g，ZnSO4·7H2O 0.04g，FeSO4·7H2O 0.03g，NaOH调节pH至7.0，115℃灭菌30min。
(7)改进的甘油合成培养基(/L)：(NH4)2SO4 4g，甘油20g，酵母粉7g，KH2PO4 1.36g，K2HPO4·3H2O 0.8g，MgSO4·7H2O 0.5g，ZnSO4·7H2O 0.04g，FeSO4·7H2O 0.03g，NaOH调节pH至7.0，121℃灭菌20min。
(8)甘油和葡萄糖混合碳源发酵培养基(/L)：(NH4)2SO4 10g，甘油25g，葡萄糖25g，酵母粉5g，KH2PO4 1.36g，K2HPO4·3H2O 0.8g，MgSO4·7H2O 0.5g，ZnSO4·7H2O 0.04g，FeSO4·7H2O 0.03g，NaOH调节pH至7.0，115℃灭菌30min。
实施例1、分离鉴定链霉菌Streptomyces sp.NK660
实验材料来自于福建古田地区地表土壤，具体步骤如下：
将取来的新鲜土样与10％碳酸钙混合均匀，置于阴凉处自然通风干燥8天。取干燥过筛后的土样1g与9ml用于稀释土壤的稀释液振荡混匀，取上清梯度稀释。将稀释好的上清液涂布于添加了50mg/L K2Cr2O7的甘油合成培养基平板(SG平板)用于ε-聚赖氨酸生产菌种的分离；培养7天后挑选表面干燥致密的放线菌菌落，转移的初选平板(SGB平板)上进行初筛，阳性菌落就会在SGB平板上出现颜料排斥圈；再将出现阳性反应的菌株利用SG培养基液体培养，上清中滴入Dragendoff试剂进行复筛，以确定生产ε-聚赖氨酸的菌株。经过16SrDNA基因序列分析，并参考伯杰氏手册之后，鉴定该菌株为链霉菌，命名为链霉菌Streptomyces sp.NK660，经保藏编号为：CGMCC No.5392。
实施例2、甘油作为单一碳源的摇瓶法培养生产ε-聚赖氨酸
(1)将保存于贝纳特斜面上的链霉菌Streptomyces sp.NK660上挑取一环孢子接种到含100ml种子培养基LB培养基的500ml锥形瓶中，30℃，180rpm活化培养，活化24h。
(2)将活化种子培养物以10％接种量接种至葡萄糖合成培养基中(摇瓶发酵时采用500ml锥形瓶，装液量为100ml)30℃，180rpm发酵培养72h
(3)发酵结束后，培养物进行离心10000转处理10min，弃去菌体，收集上清，利用6MNaOH将上清调整至pH＝8，过滤祛除沉淀的杂蛋白：
(4)将过滤后的上清利用D151弱酸型的阳离子交换树脂进行产物吸附，将ε-聚赖氨酸分子吸附在树脂上；弃去吸附过后的上清，利用蒸馏水洗涤树脂，洗去未吸附的杂志；利用0.2mol/L的稀盐酸洗脱吸附的产物，洗脱液利用6M的NaOH溶液将pH调节到中性；
(5)将pH调节至中性的洗脱液冷冻干燥浓缩，浓缩液利用透过量1000Da的透析袋进行处理，祛除无机盐离子，透析液冻干后得到ε-聚赖氨酸固体产物，ε-聚赖氨酸产量为2g/L。
实施例3、葡萄糖作为单一碳源的摇瓶法培养生产ε-聚赖氨酸
(1)将保存于贝纳特斜面上的链霉菌Streptomyces sp.NK660上挑取一环孢子接种到含100ml种子培养基LB培养基的500ml锥形瓶中，30℃，180rpm活化培养，活化18h；
(2)将活化种子培养物以10％接种量接种至改进的甘油合成培养基中发酵培养，30℃，180rpm培养72h；
(3)发酵结束后，培养物8000rpm离心10min，弃去菌体，收集上清，利用6M NaOH将上清调整至pH＝8，过滤祛除沉淀的杂蛋白；
(4)将过滤后的上清利用D152弱酸型的阳离子交换树脂进行产物吸附，将ε-聚赖氨酸分子吸附在树脂上；弃去吸附过后的上清，利用蒸馏水洗涤树脂，洗去未吸附的杂志；利用0.2mol/L的稀盐酸洗脱吸附的产物，洗脱液利用6M的NaOH溶液将pH调节到中性；
(5)将pH调节至中性的洗脱液冷冻干燥浓缩，浓缩液利用透过量1000Da的透析袋进行处理，祛除无机盐离子，透析液冻干后得到ε-聚赖氨酸固体产物；ε-聚赖氨酸产量为1.9g/L。
实施例4、以甘油和葡萄糖作为混合碳源的摇瓶法培养生产ε-聚赖氨酸
(1)将保存于贝纳特斜面上的链霉菌Streptomyces sp.NK660上挑取一环孢子接种到含100ml种子培养基LB培养基的500ml锥形瓶中，30℃，180rpm活化培养，活化30h；
(2)将活化种子培养物以10％接种量接种至甘油葡萄糖混合碳源发酵培养基(摇瓶发酵时采用500ml锥形瓶，装液量为100ml)中发酵培养，30℃，180rpm培养72h；
(3)发酵结束后，培养物8000rpm离心10min，弃去菌体，收集上清，利用6M NaOH将上清调整至pH＝8，过滤祛除沉淀的杂蛋白；
(4)将过滤后的上清利用D113弱酸型的阳离子交换树脂进行产物吸附，将ε-聚赖氨酸分子吸附在树脂上；弃去吸附过后的上清，利用蒸馏水洗涤树脂，洗去未吸附的杂志；利用0.2mol/L的稀盐酸洗脱吸附的产物，洗脱液利用6M的NaOH溶液将pH调节到中性；
(5)将pH调节至中性的洗脱液冷冻干燥浓缩，浓缩液利用透过量1000Da的透析袋进行处理，祛除无机盐离子，透析液冻干后得到ε-聚赖氨酸固体产物；ε-聚赖氨酸产量为3g/L。
实施例5、以葡萄糖为碳源的30L自动发酵罐培养生产ε-聚赖氨酸
(1)将保存于贝纳特斜面上的链霉菌Streptomyces sp.NK660上挑取一环孢子接种到含100ml种子培养基LB培养基的500ml锥形瓶中，30℃，180rpm活化培养24h作为一级种子；
(2)将一级种子培养物以10％接种量接种至二级种子培养基葡萄糖合成培养基中发酵培养，30℃，180rpm培养24h；
(3)将培养好的二级种子液1.8L接入含有18L葡萄糖合成培养基的发酵罐中，控制通气量为0.5-2.5vvm保持DO大于30％；不干预pH条件下，通气培养72h；
(4)培养物离心弃去菌体，发酵液利用6000rpm离心15min祛除菌体，收集上清，将上清利用6M NaOH溶液调整至pH＝8，过滤去除杂蛋白；
(5)将过滤后的上清通过装有D152弱酸型阳离子交换树脂的吸附柱，弃去吸附后的上清，利用蒸馏水洗涤树脂，洗去未吸附的杂质；利用0.4mol/L的稀盐酸洗脱吸附的产物，洗脱液利用6M的NaOH将pH调节至中性；
(6)将pH调节至中性的洗脱液冷冻干燥浓缩，浓缩液利用透过量为1000Da的透析袋去除无机盐离子，透析液冻干后得到ε-聚赖氨酸固体产物，产量为9g/L。
实施例6、以甘油为碳源，控制pH条件的30L自动发酵罐培养生产ε-聚赖氨酸
(1)将保存于贝纳特斜面上的链霉菌Streptomyces sp.NK660上挑取一环孢子接种到含100ml种子培养基LB培养基的500ml锥形瓶中，30℃，180rpm活化培养24h作为一级种子；
(2)将一级种子培养物以10％接种量接种至二级种子培养基改进的甘油合成培养基中发酵培养，30℃，180rpm培养24h；
(3)将培养好的二级种子液1.8L接入含有18L改进的甘油合成培养基的发酵罐中，控制通气量为0.5-2.5vvm保持DO大于30％。通气培养24h。人工调节pH＝4进行发酵，实时监测培养基中的碳源浓度，当甘油浓度小于10g/L时补料至甘油浓度为15g/L。补料发酵持续72h；
(4)培养物离心弃去菌体，发酵液利用6000rpm离心20min祛除菌体，收集上清，将上清利用6M NaOH溶液调整至pH＝8，过滤去除杂蛋白；
(5)将过滤后的上清通过填装有D151弱酸型阳离子交换树脂的吸附柱，弃去吸附后的上清，利用蒸馏水洗涤树脂，洗去未吸附的杂质；利用0.4mol/L的稀盐酸洗脱吸附的产物，洗脱液利用6M的NaOH将pH调节至中性；
(6)将pH调节至中性的洗脱液冷冻干燥浓缩，浓缩液利用透过量为1000Da的透析袋去除无机盐离子，透析液冻干后得到ε-聚赖氨酸固体产物，产量为19g/L。
Claims (2)
1.链霉菌Streptomyces sp.NK660 CGMCC No.5392。
2.链霉菌Streptomyces sp.NK660 CGMCC No.5392用于生产ε-聚赖氨酸的发酵培养方法，包括如下操作步骤：
(1)将保存于贝纳特斜面上的链霉菌Streptomyces sp.NK660，挑取一环孢子接种在LB培养基中作为种子进行活化培养18-30h；
(2)将种子液以5-10％的接种量接种至以葡萄糖或甘油作为碳源的合成培养基中，通过摇瓶发酵或者30L自动发酵罐进行发酵培养72-96h；所述以葡萄糖或甘油作为碳源的合成培养基为：
①每升葡萄糖合成培养基：(NH4)2SO4 10g，葡萄糖50g，酵母粉5g，KH2PO4 1.36g，K2HPO4·3H2O 0.8g，MgSO4·7H2O 0.5g，ZnSO4·7H2O 0.04g，FeSO4·7H2O 0.03g，NaOH调节pH至7.0，115℃灭菌30min；
或②每升改进的甘油合成培养基：(NH4)2SO4 4g，甘油20g，酵母粉7g，KH2PO4 1.36g，K2HPO4·3H2O 0.8g，MgSO4·7H2O 0.5g，ZnSO4·7H2O 0.04g，FeSO4·7H2O 0.03g，NaOH调节pH至7.0，121℃灭菌20min；
或③每升甘油和葡萄糖混合碳源发酵培养基：(NH4)2SO4 10g，甘油25g，葡萄糖25g，酵母粉5g，KH2PO4 1.36g，K2HPO4·3H2O 0.8g，MgSO4·7H2O 0.5g，ZnSO4·7H2O 0.04g，FeSO4·7H2O 0.03g，NaOH调节pH至7.0，115℃灭菌30min；
(3)发酵结束后，发酵液6000～10000rpm离心处理10～20min去除菌体，收集上清，利用6M NaOH溶液将上清调整pH＝8，过滤祛除沉淀的杂蛋白；
(4)将过滤后的上清置于摇瓶中，利用弱酸型阳离子交换树脂吸附产物，将ε-聚赖氨酸分子吸附在树脂上；弃去吸附过后的上清，蒸馏水洗涤树脂，洗去未吸附的杂质；利用0.4mol/L的稀盐酸洗脱吸附的产物，洗脱液利用NaOH溶液将pH调整到中性；所述弱酸型阳离子交换树脂为D113或D151或D152弱酸型阳离子交换树脂；
(5)洗脱液利用冷冻干燥浓缩，浓缩液利用透过量1000Da的透析袋进行处理，去除无机盐离子，透析液冻干后得到ε-聚赖氨酸固体产物。
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