CN1068049C - 一种用吸水链霉菌生产抗生素的新方法 - Google Patents

Abstract

用本发明的吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)U-58CGMCC No.0299，通过微生物发酵的方法得到菌丝体，用溶媒抽提和重结晶的方法制得腐霉素。该菌使用的发酵营养基主要成分有葡萄糖，淀粉，酵母粉，玉米浆，蛋白胨和无机盐等，最适温度为28-30℃，最适空气流量为1∶0.5-1.0V/V/分，最适发酵周期为96-120小时，每立升发酵液可得到腐霉素钠盐结晶2.7-3.0克。

Description

一种用吸水链霉菌生产抗生素的新方法

本发明是关于微生物发酵法生产抗生素的新方法，特别是关于利用筛选分离到的一株吸水链霉菌HS-86的突变株U-58生产腐霉素的新方法。

鸡球虫病是严重危害养禽业发展的寄生虫病之一，尤其4-6周雏鸡常因球虫病爆发而大批死亡，据统计鸡球虫病每年给世界养禽业造成数亿美元的经济损失，现有的化学合成抗球虫药虽有较好的防治作用，但容易产生耐药性，难以长期应用。聚醚类离子载体抗生素是七十年代中期发展起来的、具有阳离子载体性质的微生物次级代谢产物，是一类有很强的抗球虫作用又不导致球虫产生耐药性的广谱抗生素，同时它又能促进动物生长。我们在筛选新抗过程中，获得一株链霉菌HS-86，经鉴定为吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)HS-86，其突变株为U-58。将新活化的吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)U-58菌种，于1997年4月7日交到北京，中关村，“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心“保藏，保藏编号为CGMCCNo.0299，该菌株代谢产物的理化性质虽与日本公开特许公报51-35494,52-83805,U.S.Patent 4069316报导的聚醚类抗生素Carriomycin的理化性质一致，但Carriomycin的产生菌吸水链霉菌T-42082(Streptomyces hygroscopicus T-42082)与本发明所使用的菌株在形态特征，培养特征，生理生化特性方面有不同之处，主要差别在于本菌孢子有短刺，不利用鼠李糖，而菌株T-42082孢子表面有疣，利用鼠李糖。此外，发酵时抗生素产生的分布也有不同：T-42082产生的抗生素在发酵液和菌丝体内均存在，而该菌产生的抗生素99％以上存在于菌丝体中，有利于抗生素发酵的固液分离，大大简化了提取工艺，缩短了提取步骤。本发明的另一个重要特征在于利用该菌发酵，产生腐霉素的水平高。在已报导的专利实例中，提供了在100L发酵罐中，从30L发酵液中得到6.5克Carriomycin.在本发明中，在800L发酵罐中，从300L发酵液中得到824克。据目前文献报导，Carriomycin是聚醚类抗生素中毒性最低的一种，它不仅可用于防治鸡的球虫病，还可治疗由密螺旋体引起的猪痢疾，本发明的腐霉素经试验证明是一种高效，低毒的防治鸡球虫病的抗生素，因此本发明的目的是提供更适于工业化生产的一株吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopics)U-58 CGMCC No.0299和该菌相应的发酵，提取方法。

本发明的目的可以通过以下措施来达到：将CGMCC No.0299的孢子斜面接入种子培养基的三角瓶中，使菌体扩大培养后，接入含有碳、氮源和无机盐类的发酵培养基中培养。控制发酵时的温度，发酵时间，空气流量。发酵后收集菌体，采用溶媒(如甲醇，乙醇，丙酮)抽提，重结晶制备具有生物活性的腐霉素。

本发明的目的还可以通过以下步骤来实现：

采用的种子培养基成分为：葡萄糖1-2％，玉米浆0.5-1％，可溶性淀粉1-3％，蛋白胨0.2-0.5％，黄豆饼粉1-3％，氯化钠0.2-0.4％,PH7.0-7.5.

种子培养过程：取生长丰茂的斜面种子。斜面种子可用高氏或本氏斜面培养，接种孢子于装有种子培养基的三角瓶中，于28-30℃，旋转摇床培养48小时。

采用的发酵培养基成分为：葡萄糖1-3％，淀粉4-6％，酵母粉0.5-2％，蛋白胨0.2-0.5％，氯化钠0.2-0.5％，玉米浆0.5-1％，硫酸铁0.01-0.03％，氯化锰0.05-0.2％,CaCO₃ 0.5％,PH7.0-7.5。

发酵培养过程：一级摇瓶种子以0.5-2％的接种量进行扩大，二级种子以4-8％的接种量接入发酵培养基中，发酵温度为28-30℃，通气培养，空气流量1:0.5-1.0V/V/分，培养周期为96-120小时。抗生素的分离、纯化，通过如下步骤达到：

发酵液进行固液分离，收集菌丝体，菌丝体用乙醇浸泡3-5次，调PH8.0-9.0，搅拌0.5-1小时，过滤，合并浸泡抽提液，减压浓缩至有结晶析出，过滤得粗结晶，用乙醇重结晶，得无色针状钠盐结晶。将钠盐溶于甲醇或乙醇中，通过阳离子树脂脱盐，浓缩，重结晶，可得到游离酸结晶。

实例一：取一种环CGMCC No.0299涂布在15×180大试管的高氏淀粉斜面上，在28℃培养14天。

取上述菌种一支，接入装有30毫升种子培养基的250毫升三角瓶中，于28℃，220转/分的旋转摇床上培养48小时，种子培养基组成：葡萄糖2％，玉米浆0.5％，淀粉2％，蛋白胨0.5％，黄豆饼粉1％，氯化钠0.2％，PH7.2、

在装有50毫升发酵培养基的500毫升三角瓶中，接入1.5毫升上述种子液，在28℃，220转/分的旋转摇床上发酵5天，发酵培养基组成，葡萄糖2％，淀粉5％，酵母粉1.5％，玉米浆0.5％，蛋白胨0.2％，硫酸铁0.03％，氯化锰0.1％,CaCO₃ 0.5％,PH7.2。

收集上述发酵液3L，离心收集菌丝体，用1.5L乙醇，分五次浸泡菌体，用氢氧化钠调PH8.0-9.0，搅拌1小时，过滤，合并活性部分，减压浓缩至析出浅黄色结晶，过滤得粗品11.4克，用活性炭脱色，乙醇重结晶，得无色针状钠盐结晶9.1克。

实例二：取CGMCC No.0299菌种一支，将菌种接入装有120毫升种子培养基的1L三角瓶中，于28℃，220转/分的旋转摇床上培养48小时，种子培养基成分和培养方法同实例一。

在装有60L种子培养基的100L种子罐中，接入三瓶上述种子液，在28℃，搅拌转速240转/分，1:0.5V/V/分培养30小时，种子培养基组成同实例1。

在装有400L发酵培养基的800L发酵罐中，接入30L上述种子液，在28℃，搅拌转速220转/分，空气流量1:0.5-1.0V/V/分，培养110小时，发酵培养基组成同实例一。

取上述发酵液300L，压滤，收集菌丝体，用150L乙醇分3次浸泡，用氢氧化钠调PH 8.0-9.0，搅拌1小时，抽滤，合并滤液活性部分，减压浓缩至析出黄色结晶，过滤得粗品1000克。用乙醇重结晶，得类白色针状钠盐结晶824克。

Claims (8)

1、一种利用微生物发酵生产腐霉素的方法，包括菌种发酵和产物的分离提纯，其特征在于：生产菌是吸水链霉菌(Streptomyceshygroscopicus)U-58CGMCC No.0299，该菌在含碳、氮源和无机盐的发酵培养基中培养，控制发酵温度，时间和通气量，发酵产生的腐霉素用溶媒抽提菌丝体的方法，经过减压浓缩，重结晶制取腐霉素钠盐结晶。

2、如权利要求1所述方法，其特征在于：发酵温度范围是28-30℃。

3、如权利要求1所述方法，其特征在于：发酵的空气流量范围为1:1.0V/V/分。

4、如权利要求1所述的方法，其特征在于：发酵周期为96-120小时。

5、如权利要求1所述的方法，其特征在于：发酵培养基的碳源是葡萄糖1-3％，淀粉4-6％。

6、如权利要求1所述的方法，其特征在于：发酵培养基的氮源是酵母粉0.5-2％，蛋白胨0.2-0.5％，玉米浆0.5-1.0％。

7、如权利要求1所述的方法，其特征在于：发酵培养基的无机盐类是氯化钠0.2-0.5％，硫酸铁0.01-0.03％，氯化锰0.05-0.2％，碳酸钙0.5％。

8、如权利要求1所述的方法，其特征在于，溶媒抽提是指用乙醇抽提菌丝体，乙醇用量为发酵液体积的二分之一至三分之一量，分为3-5次抽提，抽提PH为8.0-9.0，抽提温度20-37℃。