CN105505825B - 一种产抗生素的链霉菌txaf2及其应用 - Google Patents

一种产抗生素的链霉菌txaf2及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种新的产抗生素的链霉菌TXAF2，其在中国普通微生物菌种保藏管理中心的保藏号为CGMCC No.10235。本发明还公开了所述链霉菌TXAF2在制备药物或农药中的应用。本发明还公开了一种含有所述链霉菌TXAF2产物的抑菌杀菌剂及其在制备药物或农药中的应用。

Description

一种产抗生素的链霉菌TXAF2及其应用
技术领域
本发明属农业技术及生物医学领域，具体涉及一种产新型抗生素的链霉菌(Streptomyces amritsarensis)TXAF2及应用。
背景技术
我国境内由于有多样的地理环境气候，为丰富的微生物资源提供了基础。故在各种不同纬度、海拔以及气候的地域均可能蕴藏着新的微生物菌种。一般地，通过菌株的形态特征、培养特征以及生理生化特征等可以对微生物菌种进行分类鉴别，同时采用检测微生物菌种的16srDNA的序列可以初步确定该菌种的分类地位。
对在全国各地采集来的微生物菌种进行培养，在得到的代谢产物中寻找各种活性成分，进而研究开发成各种药物(包括医药、农药、兽药等)，这种技术正在被广泛应用，如用作医用抗生素的青霉素、链霉素等，在农用、兽用方面具有防止水稻纹枯病的井冈霉素、防治多种螨虫和夜蛾的阿维菌素等。
发明内容
本发明的目的在于提供一种产抗生素的链霉菌(Streptomyces amritsarensis)TXAF2。
本发明的又一个目的在于提供所述产抗生素的链霉菌(Streptomycesamritsarensis)TXAF2的应用。
本发明中，“产抗生素的链霉菌TXAF2”是指产广谱抗生素的链霉菌TXAF2。其中，“广谱抗生素”是指可以抑制或者杀死包括多种微生物如枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、链球菌、霉菌或原生动物，支原体，衣原体等生命体的一种或多种物质。
本发明提出的一种产新型抗生素的链霉菌(Streptomyces amritsarensis)TXAF2属链霉菌属，并已于2014年12月23日在中国普通微生物保藏中心保藏，保藏号为CGMCCNo.10235。
本发明产抗生素的链霉菌(Streptomyces amritsarensis)TXAF2，为发明人2014年7月3日从我国浙江桐乡稻田水渠边采集的土壤中分离而得。该菌株形态特征、培养特征、生理生化特征及16srDNA的序列和菌种分类结果如下：
1、形态特征：以插片法在高氏一号琼脂上培养7天后用光学显微镜和电子显微镜分别观察菌丝和孢子的形态，结果表明，该菌基内菌丝体无横隔、不断裂，气生菌丝体分支细长，生长茂密，孢子丝长，顶端有2-6圈螺旋，孢子椭圆形。基内菌丝短且密集。
2、生理生化特征及碳源利用见表1：
表1、TXAF2菌株的生理生化特征及碳源利用
碳源利用 结果 生理生化特征 结果
D-葡萄糖 + 明胶液化 -
D-果糖 + 淀粉水解 +
D-甘露醇 + H<sub>2</sub>S产生 -
D-木糖 + 吲哚反应 -
L-阿拉伯糖 + VP反应 -
L-肌醇 + 柠檬酸利用 -
棉子糖 + 尿素酶试验 -
淀粉 + 甲基红反应 -
蔗糖 + 触酶试验 +
3、本发明所述的链霉菌(Streptomyces amritsarensis)TXAF2菌株的16srDNA序列如SEQ ID NO:1所示。
根据形态、生理生化特征以及16srDNA序列分析，该菌株属于链霉菌属(Streptomyces)。从序列比对上来看，该产新型抗生素的链霉菌(Streptomycesamritsarensis)TXAF2 CGMCC No.10235，与Streptomyces amritsarensis strain 2A对比，从16srDNA序列上来看，存在两处的不同，故为亲缘关系较近的两个不同的种。
本发明所述的产新型抗生素的链霉菌(Streptomyces amritsarensis)TXAF2，其培养方法为：在pH＝7.8，30℃下，200rmp摇床培养48小时；培养基的组成为(wt％)：葡萄糖1％，蔗糖1％，淀粉1％，酵母膏0.5％，鱼粉蛋白胨1.5％，(NH4)2SO4 0.6％，K2HPO4 1％，MgSO4·7H2O 0.75％，NaCl 1％。
对培养基中的营养源无特殊要求，需要微生物生长必需的碳源、氮源以及其他营养源。
对温度、pH、时间等培养条件没有严格的限制，但NaCl浓度大于或等于2％时，该菌无法生长。为了产率最大化，选择菌株生长旺盛且产抗生素活性较高的条件为宜，如培养基的pH范围可为5-9，以接近中性为好；培养基温度在20-35℃，培养时间在3-6天，NaCl浓度控制在2％以内。进一步地，这些条件还可能与菌株当时生长状况有关，故为了得到最好的培养效果，均应根据实际情况进行调整。
本发明提出了所述产抗生素的链霉菌(Streptomyces amritsarensis)TXAF2的应用。进一步提出了该链霉菌(Streptomyces amritsarensis)TXAF2的制备药物或农药中的应用。所述药物包括人用药物。即，所述链霉菌(Streptomyces amritsarensis)TXAF2的抗生素提取物可作为药物或农药使用。
所述链霉菌(Streptomyces amritsarensis)TXAF2的抗生素提取物作为药物使用时，所述药物的给药剂量最低为10ng/kg，以动物的重量计，给药方式为注射；所述链霉菌(Streptomyces amritsarensis)TXAF2的抗生素提取物作为农药使用时，所述农药的给药浓度最低为10ng/L，每亩作物每次均匀喷洒5-100L，2天喷洒一次，喷洒15次。
优选地，所述链霉菌(Streptomyces amritsarensis)TXAF2的抗生素提取物作为药物使用时，所述药物的给药剂量为50ng/kg，以动物的重量计，给药方式为注射；所述链霉菌(Streptomyces amritsarensis)TXAF2的抗生素提取物作为农药使用时，所述农药的给药浓度为50ng/L，每亩作物每次均匀喷洒5-100L，2天喷洒一次，喷洒15次。
本发明所述的产新型抗生素的链霉菌(Streptomyces amritsarensis)TXAF2经过发酵，得到的产物可用于抗假单胞杆菌属(Pseudomonas)、黄单胞菌属(Xanthomonas)、欧文氏菌属(Erwinia)等多种影响农业植物正常生长的病菌，同时对大肠杆菌、枯草杆菌、黑曲霉、酵母菌、具有卡那霉素抗性的大肠杆菌、具有氨苄霉素抗性的大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、多抗性枯草芽孢杆菌(包括WB980-G4/IA474枯草芽孢杆菌、PHT43-PG/WB800枯草芽孢杆菌)、金黄色葡萄球菌、假单胞杆菌属、黄单胞菌属、欧文氏菌属的菌等细菌有好的抗菌作用。该菌的发酵产物或发酵产物的纯化分离物出了可以抑制、杀死上述微生物以外，可以用于杀伤或抑制支原体、衣原体、原生动物以及人、畜寄生虫。
本发明中，所述链霉菌(Streptomyces amritsarensis)TXAF2用作农药，例如，杀菌剂、抑菌剂。所述链霉菌(Streptomyces amritsarensis)TXAF2用作人用药物，例如，皮肤外用药等。
本发明中，所述链霉菌(Streptomyces amritsarensis)TXAF2的发酵产物可使用溶媒萃取法进行提纯。
本发明中，所述产广谱抗生素的链霉菌(Streptomyces amritsarensis)TXAF2通过发酵产抗生素。
本发明中，对于大部分微生物来说，给药用量为4ng/L(体外实验)或4ng/kg(动物实验)及以上可抑制微生物生长或杀灭大部分微生物；更优地，当用量达10ng/L(体外实验)或10ng/kg(动物实验)及以上可以达到显著抑菌的效果；其中，“体外实验”是指所述链霉菌(Streptomyces amritsarensis)TXAF2所产抗生素作为农药使用的实验。
本发明中，给药方式可以注射、喷洒、涂抹、涂敷、颗粒等常用各种方式。
本发明中，所述链霉菌(Streptomyces amritsarensis)TXAF2通过发酵培养的条件为：在pH6-8，150-220rmp摇床培养36-48小时；培养基包括以下组成wt％：葡萄糖1％，蔗糖1％，淀粉1％，酵母膏0.5％，鱼粉蛋白胨1.5％，(NH4)2SO4 0.6％，K2HPO4 1％，MgSO4·7H2O 0.75％，NaCl 1％。
本发明还提出了一种用于培养所述链霉菌(Streptomyces amritsarensis)TXAF2的培养基，其包括以下组成wt％：葡萄糖1％，蔗糖1％，淀粉1％，酵母膏0.5％，鱼粉蛋白胨1.5％，(NH4)2SO4 0.6％，K2HPO4 1％，MgSO4·7H2O 0.75％，NaCl 1％。
本发明还提出了一种抑菌杀菌剂，其含有所述链霉菌(Streptomycesamritsarensis)TXAF2产生的抗生素。其中，所述抗生素通过发酵产生的。所述链霉菌(Streptomyces amritsarensis)TXAF2发酵后经过滤或离心去除菌体，添加赋形剂，冷冻干燥或者喷雾干燥，获得初步分离的有效成分，包括抑菌杀菌活性成分。该有效成分包括抗生素可以直接使用或进一步纯化。
进一步地，有效成分抑菌、杀菌活性物质可采用溶媒萃取法进行精细提纯。以乙酸丁酯作为萃取剂，以萃取柱为萃取设备，采用逆流萃取的方式，进行溶媒萃取，用多级错流法反萃取后进行结晶，获得抗生素产品。该产品可以直接应用或者进一步纯化。
进一步地，上述初步纯化或萃取纯化获得的产品，包括抑菌杀菌剂等，可以用层析住、离子交换树脂、分子筛层析等方法进一步纯化分离，获得具有不同有效组分的具有抑菌活性的物质。
本发明还提出了上述抑菌杀菌剂在作为药物或作为农药中的应用。在一具体实施方案中，链霉菌(Streptomyces amritsarensis)TXAF2 CGMCC No.10235所产的抗生素可用作药物，治疗多种病原菌(例如，金黄色葡萄球菌)导致的外伤感染。在一具体实施方案中，链霉菌(Streptomyces amritsarensis)TXAF2 CGMCC No.10235所产的抗生素可用作农药，缓解多种农作物病菌(例如，假单胞杆菌、欧文氏菌、黄单胞菌感染)引起的病害。
本发明中，所述抑菌杀菌剂(含有所述链霉菌(Streptomyces amritsarensis)TXAF2产生的发酵产物)分别对酵母菌、黑曲霉、大肠杆菌、氨苄霉素抗性的大肠杆菌、枯草杆菌、多种抗性枯草芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、破伤风杆菌、军团杆菌、白喉杆菌、沙门氏菌、假单胞杆菌属(Pseudomonas)、欧文氏菌属(Erwinia)、黄单胞菌属(Xanthomonas)具有抑菌杀菌作用。
附图说明
图1为产新型抗生素的链霉菌(Streptomyces amritsarensis)TXAF2 CGMCCNo.10235的菌株典型菌丝体生长形态光学显微镜照片。
图2为产新型抗生素的链霉菌(Streptomyces amritsarensis)TXAF2所产抗生素对细菌的抑菌圈实验图。
图3为本发明菌株(Streptomyces amritsarensis)TXAF2 16srDNA[gb|KP113542.1|]数据在NCBI数据库中比较后形成的16s rDNA系统发育树示意图。
图4本发明菌株(Streptomyces amritsarensis)TXAF2 16srDNA序列与最接近本发明的菌株Streptomyces amritsarensis strain 2A的16S rDNA脱氧核糖核酸序列比较，query为本发明序列，sbjct为Streptomyces amritsarensis strain 2A的16S rDNA序列。
具体实施方式
结合以下具体实施例，对本发明作进一步的详细说明，本发明的保护内容不局限于以下实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保护范围。实施本发明的过程、条件、试剂、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本发明没有特别限制内容。
实施例1、产新型抗生素的链霉菌(Streptomyces amritsarensis)TXAF2 CGMCCNo.10235的培养
将产新型抗生素的链霉菌(Streptomyces amritsarensis)TXAF2 CGMCCNo.10235在高氏一号琼脂培养基上以插片法28℃培养4-7天后，用光学显微镜观察菌丝和孢子的形态，观察结果如图1所示。
由图1可见，该菌基内菌丝体无横隔、不断裂，气生菌丝体分支细长，生长茂密，孢子丝长，顶端有2-6圈螺旋，孢子椭圆形。基内菌丝短且密集。
菌株的分类
委托商业公司，如铂尚生物技术(上海)有限公司或上海派森诺生物科技股份有限公司或其它任何一家生物技术服务公司测定该菌的16srDNA序列[将该序列登录到NCBI，genebank的登录号为KP113542]，具体序列见核酸序列1，SEQ ID NO.1。将该序列在NCBI数据库进行比对，可知该菌与Streptomyces amritsarensis strain 2A同源性达99％，结合细菌的形态和生理特征，可初步确定该菌为Streptomyces amritsarensis。
实施例2、产新型抗生素的链霉菌(Streptomyces amritsarensis)TXAF2 CGMCCNo.10235的发酵
以葡萄糖1％，蔗糖1％，淀粉1％，酵母膏0.5％，鱼粉蛋白胨1.5％，(NH4)2SO40.6％，K2HPO4 1％，MgSO4·7H2O 0.75％，NaCl 1％的比例配置培养基，pH调到6-8，112℃、15min高压蒸汽灭菌。将生长在高氏平板培养基上的链霉菌(Streptomycesamritsarensis)TXAF2 CGMCC No.10235直接接种于该培养基中，28-30℃、150-220rmp摇床培养36-48小时。
实施例3、链霉菌(Streptomyces amritsarensis)TXAF2 CGMCC No.10235发酵产物抗菌谱的测定
在通用LB培养基上培养酵母菌，并利用实施例2方式对链霉菌(Streptomycesamritsarensis)TXAF2 CGMCC No.10235进行发酵，使用滤纸片抑菌圈方法，将沾有发酵产物的滤纸片放于涂有卡那霉素抗性的大肠杆菌的LB培养基上进行28℃恒温培养，24h后产生明显抑菌圈，如图2所示。
用实施例3所述方法将产生的发酵产物分别对酵母菌、黑曲霉、大肠杆菌、氨苄霉素抗性的大肠杆菌、枯草杆菌、多种抗性枯草芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、破伤风杆菌、军团杆菌、白喉杆菌、沙门氏菌、假单胞杆菌属(Pseudomonas)、欧文氏菌属(Erwinia)、黄单胞菌属(Xanthomonas)进行抑菌圈实验，与空白对照组抑菌圈对比如下。
实施例4、产新型抗生素的链霉菌(Streptomyces amritsarensis)TXAF2 CGMCCNo.10235所产抗生素的提纯方法
初步纯化。将实施例3中所得发酵也过滤或离心去除菌体；添加0.1％至100倍的赋形剂(赋形剂可以是多糖、蛋白或各种盐类)，冷冻干燥或者喷雾干燥，即获得初步分离的有效成分。该成分可以直接使用或进一步纯化。
抑菌、杀菌活性物质的精细提纯方法采用的是溶媒萃取法：以乙酸丁酯作为萃取剂，以萃取柱为萃取设备，采用逆流萃取的方式，进行溶媒萃取，用多级错流法反萃取后进行结晶，获得抗生素产品。该产品可以直接应用或者进一步纯化。
初步纯化或溶媒萃取纯化获得的产品可以用层析住、离子交换树脂、分子筛层析等方法进一步纯化分离，获得具有不同有效组分的具有抑菌活性的物质。离子交换树脂纯化方法为：将发酵液或初纯产物用1倍质量的pH7.0，20mM磷酸盐缓冲液[用磷酸氢二钾/钠与磷酸二氢钾/钠配置]溶解，与树脂[任意市售树脂，按说明书再生]混合，室温作用20分钟，然后用pH7.0，20mM磷酸盐缓冲液洗涤1-3次；用10-500mM盐酸洗脱，收集洗脱液，添加1％－10倍的赋形剂[多糖如海藻多糖、淀粉；蛋白如谷朊粉、牛血清白蛋白；盐如氯化钠、磷酸镁等一种或者几种混合]，也可不添加赋形剂；将其在-40℃至-4℃抽真空冻干或者直接在进风口100℃，出风口80℃的条件下喷雾干燥。当水份为0.001％－10％时，即为所需的纯品抗菌/杀菌物质(即以下实施例5和6所述的抗生素提取物/抗生素提纯物)或者含有相应赋形剂的抗菌/杀菌物质。
实施例5、链霉菌(Streptomyces amritsarensis)TXAF2 CGMCC No.10235所产新型抗生素可用作药物，治疗多种病原菌的外伤感染。
以金黄色葡萄球菌等菌为例，将小鼠耳外缘割破，感染不同致病菌(种类如下)。取不同剂量的实施例4中的抗生素提取物/抗生素提纯物，用适量无菌水溶解，对多组小鼠进行静脉注射和皮下注射。小鼠在无菌培养箱饲养3天后，观察伤口感染情况，所述抗生素剂量以动物的重量计，如10ng/kg指的是每kg动物施用10ng的抗生素提取物。
实施例6、链霉菌(Streptomyces amritsarensis)TXAF2 CGMCC No.10235所产新型抗生素可用作农药，缓解多种农作物病菌引起的病害。
以假单胞杆菌、欧文氏菌、黄单胞菌感染为例，对多组水稻、棉花、小麦等作物进行病菌感染，将实施例4中抗生素提取物溶于适量蒸馏水中，作为农药使用，进行2天1次喷洒，所述“1次喷洒”是指每亩作物均匀喷洒5-100公斤[或升]的抗生素提取物，一个月后，即，喷洒15次后，观察作物虫害情况。
本发明的保护内容不局限于以上实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保护范围。

Claims (11)

1.一种产抗生素的链霉菌(Streptomyces amritsarensis)TXAF2，其特征在于，所述链霉菌TXAF2在中国普通微生物菌种保藏管理中心的保藏号为CGMCC No.10235。
2.如权利要求1所述的链霉菌(Streptomyces amritsarensis)TXAF2在制备药物或农药中的应用，其特征在于，所述链霉菌TXAF2生产的抗生素用于抗菌，所述菌包括：大肠杆菌、枯草杆菌、黑曲霉、酵母菌、金黄色葡萄球菌、假单胞杆菌属、黄单胞菌属、欧文氏菌属的菌。
3.如权利要求2所述的链霉菌(Streptomyces amritsarensis)TXAF2在制备药物或农药中的应用，其特征在于，所述菌包括：具有卡那霉素抗性的大肠杆菌、具有氨苄霉素抗性的大肠杆菌、PWB980-G4/IA474枯草芽孢杆菌、PHT43-PG/WB800枯草芽孢杆菌。
4.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述药物包括皮肤外用药。
5.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述链霉菌(Streptomyces amritsarensis)TXAF2生产的抗生素使用溶媒萃取法进行提纯。
6.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述链霉菌(Streptomyces amritsarensis)TXAF2通过发酵产抗生素。
7.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述药物的给药剂量最低为10ng/kg，以动物的重量计，给药方式为注射；所述农药的给药浓度最低为10ng/L，每亩作物每次均匀喷洒5-100L，2天喷洒一次，喷洒15次。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述药物的给药剂量为50ng/kg，以动物的重量计，给药方式为注射；所述农药的给药浓度为50ng/L，每亩作物每次均匀喷洒5-100L，2天喷洒一次，喷洒15次。
9.如权利要求2～8之任一项所述的应用，其特征在于，所述链霉菌(Streptomycesamritsarensis)TXAF2通过发酵培养的条件为：
在pH6-8，150-220rmp摇床培养36-48小时；培养基包括以下组成wt％：葡萄糖1％，蔗糖1％，淀粉1％，酵母膏0.5％，鱼粉蛋白胨1.5％，(NH4)2SO4 0.6％，K2HPO4 1％，MgSO4·7H2O0.75％，NaCl 1％。
10.一种抑菌杀菌剂，其特征在于，其含有权利要求1所述链霉菌(Streptomycesamritsarensis)TXAF2产生的抗生素。
11.如权利要求10所述的抑菌杀菌剂在制备药物或农药中的应用。
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