CN112899186B - 一株伯克霍尔德菌及其在禾谷镰刀菌生物防治中的应用 - Google Patents
一株伯克霍尔德菌及其在禾谷镰刀菌生物防治中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一株伯克霍尔德菌及其在禾谷镰刀菌生物防治中的应用，属于有益微生物技术领域。本发明的伯克霍尔德菌为伯克霍尔德菌(Burkholderia latens)G12；该菌株于2020年9月25日保藏于中国微生物菌株保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.20817，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。该菌株对禾谷镰刀菌具有较好的抑制效果，采用本发明的伯克霍尔德菌G12菌悬液或全培养物或粗提物或胞外代谢物处理小麦籽粒，能够显著降低贮存期禾谷镰刀菌对小麦籽粒的侵染，延长小麦的贮存期。
Description
技术领域
本发明属于有益微生物技术领域，具体涉及一株伯克霍尔德菌及其在禾谷镰刀菌生物防治中的应用。
背景技术
近年来，随着生态农业的快速发展，人们对农产品的品质需求越来越高；由之前的新鲜优质，逐步向绿色安全有机过渡；化学农药的使用也逐步被新型的生物农药所替代。而且，传统的农业种植模式中化学农药的使用，不仅造成了土壤中有益菌群减少、土壤板结、水体污染、作物产量降低，还对生态多样性和生态系统的稳定性造成威胁。因而，新型生物农药的开发对传统农业向生态农业转变极为重要。
禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)是引起小麦赤霉病的主要病原菌之一，赤霉病的发生会造成粮食严重减产和籽粒品质下降；而且，在小麦贮存过程中，籽粒本身携带病菌或贮存条件不当也会使小麦籽粒受到禾谷镰刀菌的侵染；该菌侵染小麦后会产生多种真菌毒素，包括脱氧雪腐镰刀菌烯醇、玉米赤霉烯酮和雪腐镰孢菌烯醇。这些真菌毒素具有毒性，摄入毒素超标的小麦会造成人和动物机体免疫力下降，导致畸性和癌症，严重危害人和动物健康。因而被禾谷镰刀菌侵染后的小麦籽粒不再适用于磨粉和食用，也不能用作饲料。
为了能减少禾谷镰刀菌的危害，国内外研究人员通过多种方法开展禾谷镰刀菌的防治，主要包括无菌种子、禾谷镰刀菌非宿主作物轮作、抗禾谷镰刀菌的育种、化学防治以及生物防治等。虽然采用无污染的小麦种子和轮种禾谷镰刀菌非宿主作物可以有效降低禾谷镰刀菌的源头污染，但因为禾谷镰刀菌孢子容易扩散等原因，导致这些防治方法作用有限。培育具有禾谷镰刀菌抗性的小麦品种进展缓慢；化学防治虽然有效但长期使用会导致农药残留超标、病原菌耐药性增加，影响小麦食品安全的同时还会造成环境污染；生物防治是一种采用拮抗微生物来抑制禾谷镰刀菌的方法，该方法不仅绿色无污染，而且是效果明显的一种病害防治方式，正越来越受到研究人员的关注。
发明内容
针对现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一株伯克霍尔德菌及其在禾谷镰刀菌生物防治中的应用。
为了达到上述目的，本发明采用如下技术方案：
一株伯克霍尔德菌，所述伯克霍尔德菌为伯克霍尔德菌(Burkholderia latens)G12；该菌株于2020年9月25日保藏于中国微生物菌株保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.20817，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
上述伯克霍尔德菌的菌悬液或全培养物或粗提物或胞外代谢物在禾谷镰刀菌生物防治中的应用。
在上述方案的基础上，用于防治由禾谷镰刀菌引起的作物病害中的应用。
在上述方案的基础上，所述的作物病害为小麦赤霉病。
上述伯克霍尔德菌的菌悬液或全培养物或粗提物或胞外代谢物在小麦贮存中的应用。
上述伯克霍尔德菌的菌悬液或全培养物或粗提物或胞外代谢物在制备拮抗或抑制禾谷镰刀菌的制剂中的应用。
一种拮抗或抑制禾谷镰刀菌的制剂，有效成分包含保藏编号为CGMCC No.20817的伯克霍尔德菌(Burkholderia latens)G12的菌悬液或全培养物或粗提物或胞外代谢物。
一种用于小麦贮存的微生物制剂，有效成分包含保藏编号为CGMCC No.20817的伯克霍尔德菌(Burkholderia latens)G12的菌悬液或全培养物或粗提物或胞外代谢物。
一种防止禾谷镰刀菌侵染贮存小麦的方法，向小麦籽粒表面喷洒含有保藏编号为CGMCC No.20817的伯克霍尔德菌(Burkholderia latens)G12的菌悬液或全培养物或粗提物或胞外代谢物，喷洒后阴凉晾干，置于室温下，通风干燥贮存。
在上述方案的基础上，所述伯克霍尔德菌(Burkholderia latens)G12的菌悬液或全培养物或粗提物或胞外代谢物的喷洒量为2mL/20g小麦籽粒。
本发明技术方案的优点：
本发明从海水中分离获得一株伯克霍尔德菌，该菌株对禾谷镰刀菌具有较好的抑制效果，采用本发明的伯克霍尔德菌G12菌悬液或全培养物或粗提物或胞外代谢物处理小麦籽粒，能够显著降低贮存期禾谷镰刀菌对小麦籽粒的侵染，延长小麦的贮存期。
附图说明
图1菌株G12菌落形态图；
图2菌株G12的16S rRNA电泳图(1为菌株G12 16S rRNA扩增条带，2为Marker)；
图3菌株G12拮抗禾谷镰刀菌平板对峙结果(A：实验组，中间为禾谷镰刀菌，四周接种菌株G12；B：对照组)；
图4菌株G12防止禾谷镰刀菌侵染贮存小麦结果(A瓶的小麦中添加禾谷镰刀菌的孢子，B瓶的小麦中添加禾谷镰刀菌的孢子和菌株G12)。
具体实施方式
在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。
下面结合具体实施例，并参照数据进一步详细的描述本发明。以下实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。
实施例1菌株G12的分离、纯化、鉴定
(1)分离纯化
2018年5月采用稀释培养法从青岛沿海的海水中分离细菌。具体步骤为：
取1mL海水，加入100mL灭菌水，进行稀释，取稀释液在LB固体平板上分离细菌菌株，根据菌株的颜色、形态等特征进行初步分类，通过划线纯化得到纯的菌株，编号为G12，在LB液体培养基中培养，加入终浓度为20％的甘油，冻存于-20℃冰箱备用。
(2)菌株鉴定
按照“伯杰细菌鉴定手册”(第八版)中描述的方法，对菌株G12进行形态特征和生理生化特征鉴定，具体结果如下：
1、形态特征：菌株G12在LB培养基上单菌落凸起，不透明，培养2天后，菌落约为5-8mm(图1)。
2、菌株G12具有如下生物学性质：能在4-42℃生长，革兰氏染色为阴性，能利用葡萄糖、阿拉伯糖、D-甘露糖，D-甘露醇，己二酸，不能利用麦芽糖。
3、16S rRNA基因分析
提取G12的细菌基因组DNA，利用16S rRNA基因通用引物进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳结果如图2所示；扩增产物连接到pMD19-T载体，转化重组质粒到大肠杆菌，测序得到的基因序列。根据EzTaxon-e server数据库标准菌株序列同源性比较，菌株G12的16S rRNA基因与标准菌株Burkholderia latens LMG 24064T的16S rRNA基因同源性为100％，基因分析表明该菌为伯克霍尔德菌(Burkholderia latens)。所述的G12的16S rRNA序列如SEQ IDNo.1所示。
SEQ ID No.1
综合形态特点、生理生化鉴定和16S rDNA测序和同源性分析的结果，鉴定菌株G12为伯克霍尔德菌(Burkholderia latens)。命名为伯克霍尔德菌(Burkholderia latens)G12，于2020年09月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101；保藏单位为山东省花生研究所，保藏编号为CGMCC NO.20817。
实施例2菌株G12对禾谷镰刀菌的拮抗作用
采用平板对峙培养法，取10μL禾谷镰刀菌S7(山东省农业科学院作物研究所龚魁杰研究团队提供)孢子液(浓度为7.9×105个/mL)接种于PDA平板中心，在禾谷镰刀菌周围接种纯化的菌株G12(20μL，浓度为2.8×108cfu/mL)进行抑菌试验，作为试验组；以不接种菌株G12的平板作为对照组；在28℃培养箱中静置培养7天，发现菌株G12可显著抑制禾谷镰刀菌生长(图3)，是一株有效的禾谷镰刀菌拮抗菌。
实施例3伯克霍尔德菌G12对小麦中禾谷镰刀菌的拮抗
取15g小麦分别放进2个三角瓶中，瓶子编号为A和B。
取灭过菌的2mL LB液体培养基，加入10μL浓度为7.9×105个/mL的禾谷镰刀菌S7孢子悬液，充分混匀后加入A瓶，作为对照组；在LB液体培养基中培养菌株G12，取2mL浓度为2.8×108cfu/mL的菌G12，加入10μL浓度为7.9×105个/mL的禾谷镰刀菌S7孢子悬液，充分混匀后加入B瓶，作为实验组。放置于28℃，培养7天后，如图4，A瓶小麦表面长满了禾谷镰刀菌，B瓶小麦表面没有长禾谷镰刀菌，表明伯克霍尔德菌G12能显著抑制小麦中禾谷镰刀菌的生长。
实施例4伯克霍尔德菌G12菌悬液防止禾谷镰刀菌侵染贮存小麦
取200g新收获、籽粒饱满、未被禾谷镰刀菌污染的小麦，每100g一组，随机分为2组，每组设3个平行；向第一组小麦表面喷洒灭过菌的LB培养基，喷洒量为2mL/20g，记为对照组；向第二组的小麦表面喷洒培养48h的伯克霍尔德菌G12菌悬液(菌浓度2.8×108cfu/mL)，喷洒量为2mL/20g，记为试验组；上述各组小麦于阴凉晾干后，置于室温下，通风干燥贮存。每30天取样检测小麦中禾谷镰刀菌的含量，共计90天，各组禾谷镰刀菌含量情况如表1所示。
表1禾谷镰刀菌含量(cfu/g)
| 天数 | 30d | 60d | 90d |
| 对照组 | 1.2×10<sup>2</sup> | 6.1×10<sup>3</sup> | 4.7×10<sup>6</sup> |
| 试验组 | 未检出 | 67 | 1.9×10<sup>2</sup> |
由表1可知，随着时间的增加，试验组中禾谷镰刀菌的含量远远少于对照组中的含量；这说明喷洒培养伯克霍尔德菌G12菌液能够有效的防止小麦中禾谷镰刀菌的污染，延长小麦贮存期。
实施例5伯克霍尔德菌G12胞外代谢物防止禾谷镰刀菌侵染贮存小麦
伯克霍尔德菌G12胞外代谢物：取冻存伯克霍尔德菌G12菌液接种到LB液体培养基中，培养12h活化菌株；然后向新的LB液体培养基中接入活化的伯克霍尔德菌G12菌液，在37℃震荡培养36-48h，至菌液浓度2.8×108cfu/mL。菌液经过8000rpm离心10min后，再经过0.22μm滤膜过滤除去菌体后，制备获得伯克霍尔德菌G12胞外代谢物。
取200g新收获、籽粒饱满、未被禾谷镰刀菌污染的小麦，每100g一组，随机分为2组，每组设3个平行；向第一组小麦表面喷洒灭过菌的LB培养基，喷洒量为2mL/20g，记为对照组；向第二组的小麦表面喷洒上述制备的伯克霍尔德菌G12胞外代谢物，喷洒量为2mL/20g，记为试验组；上述各组小麦于阴凉晾干后，置于室温下，通风干燥贮存。每30天取样检测小麦中禾谷镰刀菌的含量，共计90天，各组禾谷镰刀菌含量情况如表2所示。
表2禾谷镰刀菌含量(cfu/g)
| 天数 | 30d | 60d | 90d |
| 对照组 | 1.1×10<sup>2</sup> | 6.3×10<sup>3</sup> | 6.2×10<sup>6</sup> |
| 试验组 | 未检出 | 97 | 2.3×10<sup>2</sup> |
由表2可知，随着时间的增加，试验组中禾谷镰刀菌的含量远远少于对照组中的含量；这说明喷洒伯克霍尔德菌G12胞外代谢物能够有效的防止小麦中禾谷镰刀菌的污染，延长小麦贮存期。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。
序列表
<110> 山东省花生研究所
<120> 一株伯克霍尔德菌及其在禾谷镰刀菌生物防治中的应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1427
<212> DNA
<213> 伯克霍尔德菌(Burkholderia latens)
<400> 1
cctccttgcg gttagactag ccacttctgg taaaacccac tcccatggtg tgacgggcgg 60
tgtgtacaag acccgggaac gtattcaccg cggcatgctg atccgcgatt actagcgatt 120
ccagcttcat gcactcgagt tgcagagtgc aatccggact acgatcggtt ttctgggatt 180
agctccccct cgcgggttgg caaccctctg ttccgaccat tgtatgacgt gtgaagccct 240
acccataagg gccatgagga cttgacgtca tccccacctt cctccggttt gtcaccggca 300
gtctccttag agtgctcttg cgtagcaact aaggacaagg gttgcgctcg ttgcgggact 360
taacccaaca tctcacgaca cgagctgacg acagccatgc agcacctgtg cgccggttct 420
ctttcgagca ctcccgaatc tcttcaggat tccgaccatg tcaagggtag gtaaggtttt 480
tcgcgttgca tcgaattaat ccacatcatc caccgcttgt gcgggtcccc gtcaattcct 540
ttgagtttta atcttgcgac cgtactcccc aggcggtcaa cttcacgcgt tagctacgtt 600
actaaggaaa tgaatcccca acaactagtt gacatcgttt agggcgtgga ctaccagggt 660
atctaatcct gtttgctccc cacgctttcg tgcatgagcg tcagtattgg cccagggggc 720
tgccttcgcc atcggtattc ctccacatct ctacgcattt cactgctaca cgtggaattc 780
tacccccctc tgccatactc tagcctgcca gtcaccaatg cagttcccag gttgagcccg 840
gggatttcac atcggtctta gcaaaccgcc tgcgcacgct ttacgcccag taattccgat 900
taacgcttgc accctacgta ttaccgcggc tgctggcacg tagttagccg gtgcttattc 960
ttccggtacc gtcatccccc ggctgtatta gagccaagga tttctttccg gacaaaagtg 1020
ctttacaacc cgaaggcctt cttcacacac gcggcattgc tggatcaggc tttcgcccat 1080
tgtccaaaat tccccactgc tgcctcccgt aggagtctgg gccgtgtctc agtcccagtg 1140
tggctggtcg tcctctcaga ccagctactg atcgtcgcct tggtaggcct ttaccccacc 1200
aactagctaa tcagccatcg gccaacccta tagcgcgagg cccgaaggtc ccccgctttc 1260
atccgtagat cgtatgcggt attaatccgg ctttcgccgg gctatccccc actacaggac 1320
atgttccgat gtattactca cccgttcgcc actcgccacc aggtgcaagc acccgtgctg 1380
ccgttcgact tgcatgtgta aggcatgccg ccagcgttca atctgag 1427
Claims (7)
1.保藏编号为CGMCC No.20817的伯克霍尔德菌的菌悬液或全培养物或粗提物或胞外代谢物在禾谷镰刀菌生物防治中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，用于防治由禾谷镰刀菌引起的作物病害中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的作物病害为小麦赤霉病。
4.保藏编号为CGMCC No.20817的伯克霍尔德菌的菌悬液或全培养物或粗提物或胞外代谢物在小麦贮存中的应用。
5.保藏编号为CGMCC No.20817的伯克霍尔德菌的菌悬液或全培养物或粗提物或胞外代谢物在制备拮抗或抑制禾谷镰刀菌的制剂中的应用。
6.一种防止禾谷镰刀菌侵染贮存小麦的方法，其特征在于，向小麦籽粒表面喷洒含有保藏编号为CGMCC No.20817的伯克霍尔德菌(Burkholderia latens)G12的菌悬液或全培养物或粗提物或胞外代谢物，喷洒后阴凉晾干，置于室温下，通风干燥贮存。
7.根据权利要求6所述防止禾谷镰刀菌侵染贮存小麦的方法，其特征在于，所述伯克霍尔德菌(Burkholderia latens)G12的菌悬液或全培养物或粗提物或胞外代谢物的喷洒量为2mL/20g小麦籽粒。
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| GR01 | Patent grant | ||
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