CN102030819B

CN102030819B - 一种广谱多肽菌素及其应用

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Publication number: CN102030819B
Application number: CN2010105549731A
Authority: CN
Inventors: 钱朝东; 李欧; 丁锐; 白骅; 吴雪昌; 杜加秋; 林建秋
Original assignee: Zhejiang University ZJU; Zhejiang Hisun Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Zhejiang University ZJU; Zhejiang Hisun Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2010-11-22
Filing date: 2010-11-22
Publication date: 2012-11-21
Anticipated expiration: 2030-11-22
Also published as: CN102030819A

Abstract

本发明提供了一种新的具有生物防治和医疗应用潜在价值的多肽菌素及其应用，所述多肽菌素结构如式(I)所示。本发明的有益效果主要体现在：提供了一种毒性低于多粘菌素B、具有生物防治和医疗应用价值的多肽菌素及其制备方法和应用，体外实验表明该化合物对所有测试过的革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌及真菌均具有显著的抑制作用；盘栽实验表明该化合物对多种真菌性植物病害具有一定的防治作用，特别是对水稻纹枯病的防治效果最为显著。

Description

一种广谱多肽菌素及其应用

(一)技术领域

本发明涉及一种新的多肽菌素及其应用。

(二)背景技术

在全球范围内，由病原菌及害虫导致的植物病害是造成农业损失的主要原因之一。半个世纪以来，人们主要采用化学农药对这类病害进行防治，并取得了显著的效果。然而很多化学农药都具有高毒、高残留、难降解等特性，随着这些农药的广泛使用，环境污染日趋严重，生态平衡遭到破坏；人及牲畜的健康也受到了极大的威胁。此外，随着耐药病菌及害虫的不断出现，化学农药的防治效率逐渐下降，这些问题引起了人们高度的重视，促使人们寻找一种能够替代化学农药的新的防治策略。

生物防治是指利用某些有益的活体生物或其次级代谢产物对植物病虫害进行防治的方法。其作用机制主要包括抗菌作用、竞争作用、寄生作用、交叉保护作用等。生物防治因其具有对人畜安全，环境污染少，易降解，防治对象针对性强等特点，逐渐得到了人们的青睐，不断寻找并开发这些具有良好防治效果的生防生物及其代谢产物也成了研究的热点。微生物制剂是指来源于微生物的生防试剂，包括微生物活体菌剂和代谢产物制剂两种。目前，已有多种细菌和真菌制剂在美国环保署(EPA)中注册，并被开发为商业生防试剂，如农杆菌属(Agrobacterium)、假单胞菌属(Pseudomonas)、链霉菌属(Streptomyces)的一些细菌，及念珠菌属(Candida)、盾壳霉属(Coniothyrium)、白粉寄生菌属(Ampelomyces)、木霉属(Trichoderma)的一些真菌。另外，多种代谢产物制剂已在我国广泛的应用于植物病虫害的防治，如春雷霉素、多抗霉素、井冈霉素A、灭粉霉素等。

类芽孢杆菌属(Paenibacillus)是Ash等于1993年根据16S rRNA基因序列比对结果，将其从芽孢杆菌属(Bacillus)中独立出来而创建的。类芽孢杆菌广泛存在于土壤和植物根系中，是潜在的生防微生物。据报道，Paenibacillus polymyxa E681、Paenibacillus elgii SD 17、Paenibacilluslentimobus B1146等类芽孢杆菌，对多种真菌性植物病害具有良好的防治效果。此外，类芽孢杆菌能产生丰富的次级代谢产物，仅该属的模式种多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)，就能产生包括多粘菌素(polymyxins)、乔利肽菌素(Jolipeptin)、谷缬菌素(Gatavalin)、杀镰孢菌素A-D(Fusaricidins)、Saltavalin以及LI-F抗生素(含12种不同组分)等在内的几十种次级代谢产物。其中多粘菌素B和E早在几十年前就已在临床上得到应用。随着研究的深入，必将有越来越多的类芽孢杆菌及其代谢产物被人们发现和利用。

(三)发明内容

本发明的目的在于提供一种新的具有生物防治和医疗应用潜在价值的广谱多肽菌素及其制备方法与应用。

本发明采用的技术方案是：

一种多肽菌素，结构如式(I)所示：

该化合物相关参数如下：

外观：白色粉末；

分子量：1086；

分子式：C₅₃H₉₀N₁₂O₁₂；

MS图谱：见图1；

NMR图谱：¹H-NMR见图2-A，¹³C-NMR见图2-B；

根据上述特性，可断定该化合物为多肽菌素(polypeptin)家族中的新成员，将其命名为多肽菌素D。该化合物是国内外首次从类芽孢杆菌中分离到的又一新脂肽类抗生素。该化合物对多种革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌及真菌具有显著的抑制作用，在植物体内抗菌实验中，式(I)的新化合物对水稻纹枯病的防治效率可达86％以上。

其中L-Dab为L型2，4-二氨基丁酸，L-Ile为L型异亮氨酸，L-Val为L型缬氨酸，D-Val为D型缬氨酸，D-Phe为D型苯丙氨酸，L-Leu为L型亮氨酸，L-Ser为L型丝氨酸。

本发明广谱多肽菌素由如下方法获得：将类芽孢杆菌(Paenibacilluselgii)接种至发酵培养基，于28～32℃下培养24～36h，发酵液离心取上清液，上清液经分离纯化得到所述广谱多肽菌素；所述发酵培养基终浓度组成如下：蛋白胨5～20g/L，蔗糖1～5g/L，可溶性淀粉1～5g/L，氯化钠2～8g/L，溶剂为水，pH7.0～7.5。所述类芽孢杆菌为已知菌种，可从常规菌种保藏机构(如CCTCC、ACCC、CGMCC、ATCC、CMCC、NBRC等)获得该菌株，本发明中所用菌株为来自NBRC(NITE biologicalresource center)的Paenibacillus elgii NBRC 100335。

所述分离纯化方法如下：上清液用正丁醇等体积萃取两次，合并萃取液、浓缩蒸干得到萃取物；用水悬浮萃取物，过MCI GEL CHP20P树脂柱，收集活性成分，浓缩蒸干得到粗品；粗品用甲醇溶解，离心过滤去除沉淀，然后进行高效液相色谱层析，收集活性组分，浓缩蒸干即可得到所述广谱多肽菌素。

MCI-GEL精细分离填料可分成几个系列，其中用于反相色谱分离的CHP系列，基体是聚苯乙烯和二乙烯基共聚物或聚甲基丙烯酸酯。CHP树脂和HP树脂是对应的。因为高分介质的化学稳定性好，pH范围广，从酸性到碱性的洗脱液均可用在MCI-GEL CHP系列。MCI-GEL CHP有不同尺寸的中、小粒径的树脂颗粒，以满足提高分离效率和精细分离的需要。CHP20P是聚苯乙烯型精细分离填料，粒径分布为35～75μm和75～150μm，广泛应用分离天然产物等方面。

优选的，所述发酵培养基终浓度组成如下：蛋白胨10g/L，蔗糖3g/L，可溶性淀粉3g/L，氯化钠5g/L，溶剂为水，pH7.0～7.2。

可溶性淀粉是一种白色或淡黄色粉末，无臭无味，不溶于冷水，在热水中则可成为透明溶液，冷却后不结冰，一般用大米、玉米、小米、土豆的淀粉都可制成可溶性淀粉，但以红薯淀粉制得的可溶性淀粉质量最好。红薯淀粉的颗粒较粗，外面所包的胶膜在进行水解时易破裂，容易干燥。其加工过程是：取一定量的红薯淀粉过80目细筛，置于一大缸中，加入8％～9％的盐酸，将溶液搅成薄糊状，于40～45℃浸渍24小时，或在室温下放置6～7天也可。每隔2小时搅动一次，浸渍完毕后，用虹吸法将缸内上层清液排掉，然后水洗数次，同时不断搅动，直至不含氯离子为止。然后掉包脱水干燥，最后用石磨磨细通过120目筛孔，即为可溶性淀粉。

本发明还涉及所述的广谱多肽菌素在制备抗菌制剂中的应用。

进一步，所述的广谱多肽菌素可用于制备抗真菌生物农药。

本发明提供的式(I)新化合物的抗菌图谱具体见表1。其中MRSA(Staphylococcus aureu)ATCC 43300(耐甲氧西林)和表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)CMCC 26069(耐氨苄西林)都为耐药菌。由表1可知，式(I)新化合物对这两种耐药菌都表现出较强的抑菌活性。如表1所示，除大肠杆菌和铜绿假单胞菌外，本发明提供的式(I)新化合物的抗菌活性均高于目前已在临床和饲料添加剂领域广泛使用多粘菌B。

表1：式(I)新化合物及多粘菌素B体外抗菌活性

本发明提供的式(I)新化合物对雄鼠及雌鼠的腹腔注射(ip)LD₅₀分别为42.0mg/kg和38.5mg/kg，明显高于多粘菌素B硫酸盐对小鼠的ipLD₅₀(雌鼠和雄鼠均为24mg/kg)，表明本发明提供的式(I)新化合物的毒性低于多粘菌素B硫酸盐，安全性更好。

表1中大部分的真菌都属于土传病害致病菌，如尖镰孢菌(Fusariumoxysporum)CGMCC 3.2830、禾谷镰孢菌(Fusarium gramine arum)CGMCC 3.4598、串珠镰孢菌(Fusarium moniliforme)CGMCC 3.4759、亚麻刺盘镰孢菌(Colletotrichum lini)CGMCC 3.4486、立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)CGMCC 3.2871。式(I)新化合物对这些致病菌都具有较强的抑菌活性。在针对植物真菌性病害的防治中，300mg/L的式(I)新化合物的对水稻纹枯病、黄瓜灰霉病、黄瓜白粉病、小麦白粉病和黄瓜霜霉病防效分别为85.13％、42.56％、61.42％、39.77％和13.51％，由此可见，式(I)新化合物对水稻纹枯病的防治效果最佳，可应用于制备抗真菌生物农药。

本发明的有益效果主要体现在：提供了一种毒性低于多粘菌素B、具有生物防治和医疗应用价值的广谱多肽菌素及其制备方法和应用，体外实验表明该化合物对所有测试过的革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌及真菌均具有显著的抑制作用；盘栽实验表明该化合物对多种真菌性植物病害具有一定的防治作用，特别是对水稻纹枯病的防治效果最为显著。

(四)附图说明

图1为本发明制备的式(I)化合物的ESI-MS图谱；

图2为本发明制备的式(I)化合物的NMR图谱，A为¹H-NMR图谱，B为¹³C-NMR图谱，溶剂为氘代吡啶。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1：将P.elgii NBRC 100335按下述条件发酵可产生式(I)新化合物。

1.将菌株NBRC 100335接种于营养琼脂培养基斜面上活化，30℃培养1～2大；

2.将斜面种子接入盛于250mL三角瓶的50mL种子培养基中，于30℃，200rpm振荡培养24h，即为一级种子液；

3.将一级种子液接入盛于500mL三角瓶的200mL种子培养基中，于30℃，200rpm振荡培养24h，即为二级种子液；

4.总体积7L的发酵罐内加入4L发酵培养基，添加0.1％聚醚消泡剂GPE，115℃下高压蒸汽灭菌60min，冷却至30℃，将200ml二级种子液接入发酵罐内(接种量5％，v/v)，起始转450rpm，溶氧保持在30％以上，发酵24h，获得发酵物。

营养琼脂培养基，按如下组成配制：蛋白胨10g，牛肉膏3g，氯化钠5g，琼脂17g，蒸馏水1000mL，pH7.2。

种子培养基为营养肉汤培养基，按如下组成配制：蛋白胨10g，牛肉膏3g，氯化钠5g，蒸馏水1000mL，pH7.2；

发酵培养基按如下组成配制：蛋白胨10g，蔗糖3g，可溶性淀粉(红薯淀粉)3g，氯化钠5g，蒸馏水1000mL，pH 7.0～7.2。

实施例2：式(I)新化合物的分离纯化

将实施例1中获得的发酵液按下述步骤分离纯化可获得本发明提供的式(I)新化合物纯品。

1.将发酵液转到离心瓶中，6000rpm离心15min，去除菌体，得发酵上清液；

2.上清液中加入等体积的正丁醇，振荡萃取，收集萃取液，萃余液再用等体积正丁醇重复一次。

3.合并两次萃取液，用旋转蒸发仪于65℃真空浓缩干，得正丁醇萃取浓缩物。

4.将正丁醇萃取浓缩物用水重悬，过MCI GEL CHP20P(三菱化学)柱，然后分别用45％、80％及100％甲醇洗脱，收集80％甲醇洗脱液，浓缩蒸干，记为粗品；

5.将粗品用甲醇溶解、离心(12000rpm，10min)，并过膜后，用制备型HPLC进行分离。A液为0.1％乙酸铵水溶液，B液为色谱纯甲醇，洗脱梯度为：先用25％B液洗脱20min，在随后的30min时间里B液从25％提高到85％。收集活性部分，浓缩蒸干，即得式(I)纯品。

实施例3：抑菌活性测定

1.细菌最低抑菌浓度测定

1)用Mueller Hinton肉汤培养基配制浓度为200μg/ml的式(I)新化合物，并进行二倍稀释：200、100、50、25、12.5、6.25、3.12、1.56、0.78、0.39μg/ml。

2)在96孔聚苯乙烯板的第1至第10孔中分别加入50μl倍比稀释后不同浓度的式(I)新化合物溶液(200～0.39μg/ml)，第11孔中加入50μlMueller Hinton肉汤培养基(牛肉浸膏粉0.2％，酸水解酪蛋白1.75％，淀粉0.15％)，作为生长对照，第12孔中加入100μl Mueller Hinton肉汤培养基，作为阴性对照。阳性对照为多粘菌素B和万古霉素。

3)指示菌培养24h后，用Mueller Hinton肉汤培养基稀释为10⁶个/ml，向第1至第11孔中加入50μl稀释菌液，密封后置培养箱中35℃培养18h，判断结果。此时，第1至第10孔中式(I)新化合物的浓度分别为100、50、25、12.5、6.25、3.12、1.56、0.78、0.39、0.20μg/ml。

4)用酶标仪测定OD值，检测波长为570nm。将完全抑制指示菌生长的最低浓度定义为最低抑菌浓度(MIC)。

所述指示菌包括：金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)ATCC29213，金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)ATCC 25923，MRSA(Staphylococcus aureus)ATCC 43300，表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)CMCC 26069，枯草芽孢杆(Bacillus subtilis)菌CGMCC1.1470，大肠杆菌(Escherichia coli)ATCC 35218，变形杆菌(Proteus vulgaris)CMCC 49027，粪肠球菌(Enterococcus faecalis)ATCC29212，铜绿假单胞菌A(Pseudomonas aeruginosa)TCC 27853，白色念珠菌(Candida albicans)ATCC 10231(为真菌，但是生长特性与细菌相似，故也采用这种方法测定最低抑菌浓度)。

2.真菌最低抑菌浓度测定

1)用水配制浓度为2mg/ml的式(I)新化合物，并进行二倍稀释：2000、1000、500、250、125、62.5、31.2、15.6、7.8、3.9μg/ml。

2)在12孔聚苯乙烯板的第1至第10孔中分别加入100μl倍比稀释后不同浓度的式(I)新化合物溶液(2000～3.9μg/ml)，最后两孔中加入100μl无菌水作为生长对照。再将900μl冷却至45～50℃的马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基加入到每个孔中，凝固后待用。此时，第1孔至第10孔式(I)新化合物的浓度分别为100、50、25、12.5、6.25、3.12、1.56、0.78、0.39、0.20μg/ml。

3)将少量无菌水加到布满真菌孢子的固体斜面培养基中，轻轻振摇后倒入无菌的锥形瓶中，反复振荡。孢子悬液用显微镜计数后，将其浓度稀释为10⁵个/ml。用移液器吸取5μl孢子液，点种在每个孔的中间。待液体干后，将板倒置培养箱中22℃培养2天。

4)将小孔中完全抑制真菌生长的最低浓度为最低抑菌浓度(MIC)。

所述指示菌包括：尖镰孢菌(Fusarium oxysporum)CGMCC 3.2830、禾谷镰孢菌(Fusarium gramine arum)CGMCC 3.4598、串珠镰孢菌(Fusarium moniliforme)CGMCC 3.4759、亚麻刺盘镰孢菌(Colletotrichumlini)CGMCC 3.4486、立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)CGMCC 3.2871。

实验结果见表1。

实施例4：植物真菌性病害的防治

1.药剂处理：称取5mg的式(I)新化合物，加DMF溶剂8g，再加水12g配制成供试药液(300mg/L)。

2.活体测定

2.1黄瓜霜霉病菌(Pseudoperonospora cubensis)

选择1张真叶期(摘去生长点)长势一致的盆栽黄瓜苗，喷雾处理后自然晾干，处理后24h后进行接种，取新鲜黄瓜霜霉病病叶，用毛笔蘸取10℃左右蒸馏水洗下病叶背面孢子囊，配成孢子囊悬浮液(2～3×10⁵个/ml)。用接种喷雾器(压力0.1MPa)在黄瓜苗上均匀喷雾接种，接种后的试材移至人工气候室，保持相对湿度100％，温度为15～20℃，24h后保持温度15～24℃，相对湿度90％左右保湿诱发，5天后视空白对照发病情况进行分级调查，按病指计算防效。

2.2黄瓜白粉病菌(Sphaerotheca fuliginea)

选择一张真叶期、长势一致的黄瓜苗，喷雾处理后阴干24h。洗取黄瓜叶片上的新鲜白粉病菌孢子，用双层纱布过滤，制成孢子浓度为10⁴/ml左右的悬浮液，喷雾接种。接种后的试材移入人工气候内，相对湿度保持在60～70％之间，温度保持(21～23℃)在室灯光下，10天左右视空白对照发病情况进行分级调查，按病指计算防效。

2.3黄瓜灰霉病(Botrytis cinerea)

采用叶片接菌法。选择二张真叶期长势一致盆栽黄瓜苗，待药剂喷雾晾干后，接菌饼于叶片上。24～26℃暗光保湿24h后，恢复自然光照保湿培养约4天。待对照充分发病后用卡尺计量每个接种点病斑直径，计算防效。

2.4水稻纹枯病(Rhizoctonia solani)

选择二张真叶期长势一致盆栽黄瓜苗，待药剂喷雾晾干，将菌饼有菌丝的一面接贴于叶片上。24～26℃暗光保湿24h后，恢复自然光照保湿培养约4天。待对照充分发病后用卡尺计量每个接种点病斑直径，计算防效。

2.5小麦白粉病(Blumeria graminis)

选用感病品种(扬麦6号)盆栽，待幼苗长至2～3叶期，喷雾处理后自然晾干，将发病小麦叶片上24h内产生的白粉病菌新鲜孢子均匀抖落接种于处理的2～3叶期盆栽小麦苗上。接种后的试材移至20℃、相对湿度80％左右调控温室玻璃房内培养。注意每天保持盆土湿润，7天左右根据空白对照发病情况分级调查。

3.药效计算

分级标准采用《农药田间药效试验准则》，以病情指数计算防治效果。病情指数＝∑(各级病叶数×相对级数值)×100/(总叶数×9)；

防治效果(％)＝(对照病情指数-处理病情指数)×100/对照病情指数

在植物体内抗菌活性实验中，多肽菌素D对多种植物真菌性病害都有不同程度的防治作用。其对水稻纹枯病、黄瓜灰霉病、黄瓜白粉病、小麦白粉病和黄瓜霜霉病防效分别为81.98％、31.27％、55.29％、39.31％和11.11％。结果表明，多肽菌素D对水稻纹枯病表现出良好的防治效果。

实施例5：小鼠毒性分析

1.小鼠

小鼠为昆明种，6～8周，重17～22g。对小鼠的处理都参照实验动物护理和使用指南(National Academy Press 1996)进行。当发现小鼠处于垂死状态时，采用颈椎脱臼处死法以减轻小鼠的痛苦。

2.实验方法

2.1腹腔途径给药法

在腹腔注射实验中，每组20只小鼠，雌雄各10只。每只小鼠注射0.2ml含多肽菌素D的0.5％CMC-Na溶液，多肽菌素D的浓度包括100、75、56.25、42.2、31.65和23.5mg/kg(小鼠重量)。观察14天，记录每天小鼠的死亡只数。通过Probit分析计算多肽菌素D的半致死量(LD₅₀)，置信度设为95％。

2.2口服灌胃给药法

在口服实验中，每组20只小鼠，雌雄各10只。给药组每只小鼠注射0.2ml含多肽菌素C的0.5％CMC-Na溶液。浓度包括650、550、450、350和250mg/kg(小鼠重量)。对照组每只小鼠注射不含多肽菌素D的0.2ml 0.5％CMC-Na溶液。观察14天后，对小鼠进行重新称重。采用SPSSsoftware 16.0，对给药组和对照组的体重增量进行t检验，判断是否具有显著差异。

3.实验结果

多肽菌素D对雄鼠及雌鼠的腹腔注射(ip)LD₅₀分别为42.0mg/kg(95％置信区间为44.1～58.1mg/kg)和38.5mg/kg(95％置信区间为40.1～53.2mg/kg)，口服(oral)LD₅₀＞650mg/kg。

Claims

1.一种广谱多肽菌素，结构如式(I)所示：

其中L-Dab为L型2，4-二氨基丁酸，L-Ile为L型异亮氨酸，D-Val为D型缬氨酸，D-Phe为D型苯丙氨酸，L-Leu为L型亮氨酸，L-Ser为L型丝氨酸。

2.如权利要求1所述的广谱多肽菌素在制备抗菌制剂中的应用。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述的广谱多肽菌素用于制备抗真菌生物农药。