CN104450835B - 一种化合物的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种化合物的制备方法，属于微生物技术领域。该方法利用一种从浙江杭州临安天目山采集的土样中分离筛选出的淀粉酶产色链霉菌D，经过菌种的活化培养，发酵培养，收集发酵液，按常规化学方法提取、层析，分离纯化获得活性化合物 Tetramycin P，该化合物为四烯大环内酯类抗生素，并可抑制黄瓜立枯病菌和番茄灰霉病菌等作物病原真菌的生长，抑制效果较常规化学药剂强。

Description

一种化合物的制备方法
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，特别是涉及新化合物四霉素P的制备方法及其对植物病原真菌的抑制作用。
背景技术
由不同病原菌引起的作物病害中，约有70%的病害是由真菌引起的。多烯大环内酯类抗生素是一类具有多个共轭双键的抗生素，其紫外吸收呈指状，特征非常明显。根据共轭双键的数目，多烯类抗生素可分为三烯、四烯、五烯、六烯、七烯等5类，通常具有很强的抗真菌活性，且抗真菌谱广，对作物主要病原真菌如黄瓜立枯病菌(Rhizoctonia solani)、番茄灰霉病菌(Botrytis cinerea)、番茄早疫病菌(Alternayia solani)、小麦赤霉病菌(Fusarium graminearium)和黄瓜枯萎病菌(F. oxysporum)；对粮食和饲料中常见的霉菌如黄曲霉(Aspergillus flavus)、赭曲霉(A. ochraccus)和黑曲霉(A. niger)，以及酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)等均有活性。据报道该类抗生素目前主要在医药上应用较多，若以多烯大环内酯类化合物为主要活性成分开发成广谱抗真菌生物制剂，将为农业生产提供良好的生防材料。
目前对植物病害的防治，主要采用化学农药杀灭病原菌，但化学农药对人畜的毒副作用和残留问题至今仍难以有效的解决。利用放线菌产生的抗病原真菌的活性物质进行植物病原真菌病害的生物防治，则具有周期短、易于研究、便于生产、无毒无害等优点。
发明内容
本发明从杭州的土壤中分离到一株生防放线菌，并对此生防放线菌发酵代谢产物中的抗菌成分进行分离，得到了主要活性成分，经四大光谱分析，明确了其结构式。该发明为微生物农药的进一步研制和开发提供优良的出发菌株和生物活性化合物。
本发明的目的是针对化学农药不安全与微生物农药种类较少的不足，提供一种新的抗植物病原真菌活性化合物；本发明的另一目的是提供该活性化合物在植物病害上的防治作用。
本发明淀粉酶产色链霉菌的分离、筛选与鉴定：
是于2006 年 8月在浙江杭州临安天目山采集的土样中，经分离、培养、发酵、活性测定以及对抑制植物真菌病害病原菌有效菌株的筛选等步骤获得并保存；经微生物分类学鉴定为淀粉酶产色链霉菌（Streptomyces diastatochromogenes），定名为淀粉酶产色链霉菌（S. diastatochromogenes）D。该菌株已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期2007年5月25日，保藏登记号CGMCC No. 2060。
淀粉酶产色链霉菌D显微形态特征：孢子丝直、钩状、松散螺旋形，孢子长圆、椭圆或卵圆形。
本发明所述的淀粉酶产色链霉菌D，经发酵提取可获得对部分植物真菌病害病原菌具有抑制作用的活性化合物，该化合物的化学名称为（7E, 12Z, 13E, 15E, 17E, 19E）-21-((4-amino-3,5-dihydroxy -6- methyltetrahydro-2H-pyran -2-yl) oxy -12 –ethylidene -1,5,6,25 – tetrahydroxy -11- methyl-9 -oxo-10,27 –dioxabicyclo[21.3.1] heptacosa-7,13,15,17,19-pentaene-24-carboxylic acid，是一种新的四烯大环内酯类化合物，已有文献中未见有报道，中文名称命名为四霉素P，英文名称为Tetramycin P。
本发明目的通过以下技术方案来实现：
一种新化合物的制备方法，按以下步骤进行：
（1）菌种的活化培养：将分离保存的淀粉酶产色链霉菌D菌种移至试管内高氏一号斜面上，在28℃±1℃条件下，培养至试管斜面长满孢子；
（2）发酵培养：发酵培养液为每1000 mL中含有可溶性淀粉20 g，黄豆粉40 g，NH4Cl 3 g， CaCO3 5 g，MgSO4 2 g，灭菌，待冷却至50 ℃，在无菌条件下接种淀粉酶产色链霉菌D至发酵培养液中，在 28℃±1℃条件下，培养5天；
（3）发酵物提取：发酵完毕，收集发酵液，按常规化学方法提取、层析，分离纯化获得活性化合物 Tetramycin P，该化合物分子式为C35H51O13N，结构式见下式；
（4）将此活性化合物用于抑菌活性的测定。
本发明的有益效果：
一是本发明提供了一种新的四烯大环内酯类化合物Tetramycin P（四霉素P），该化合物对常见植物病原真菌具有较强的抑制作用；
二是本发明提供了新的四烯大环内酯类化合物Tetramycin P（四霉素P）的制备方法，为今后新的农用杀菌剂的开发增添了新途径。
具体实施方式
实施例1：（淀粉酶产色链霉菌D的分离与筛选）
本发明于2006年8 月在浙江临安天目山采集的土样中，经分离、培养、发酵、活性测定以及对抑制植物真菌病害病原菌有效菌株的筛选等步骤，从中获得淀粉酶产色链霉菌（Streptomyces diastatochromogenes）D，保存。
淀粉酶产色链霉菌（S. diastatochromogenes）D抑菌活性测定：取其发酵上清液1mL于无菌培养皿内，与9 mL冷却至50℃的PDA培养基迅速混匀，冷却后在每个培养基平面分别放1个直径为4 mm的黄瓜立枯病菌或番茄灰霉病菌等供试菌菌饼，菌饼接于培养皿中央（培养皿直径为9 cm），置培养箱中28 ℃培养36 h，以无菌水处理作为对照，重复3次；采用十字交叉法测定菌落直径，以下列公式计算抑制率：
测定结果表明：淀粉酶产色链霉菌D代谢产物对黄瓜立枯病菌和番茄灰霉病菌的抑制率分别为100 %和78 %。
实施例2：（淀粉酶产色链霉菌D发酵代谢产物的制备方法）
按以下步骤进行：
（1）菌种试管斜面活化培养：斜面培养基为高氏一号培养基，其组分与含量为：K2HPO4 0.5 g、KNO3 1 g、MgSO4 0.5 g、可溶性淀粉20 g、NaCl 0.5 g、FeSO4 0.01 g、琼脂20g，溶化后补足水至1L；在无菌条件下用接种环挑取少许淀粉酶产色链霉菌D的孢子，至已灭菌的高氏一号培养基试管（15×150 mm）中，置培养箱内28℃±1℃，活化培养96 h，至试管斜面长满孢子；
（2）发酵培养：发酵培养液为每1000 mL中含有可溶性淀粉20 g，黄豆粉40 g，NH4Cl 3 g， CaCO3 5 g，MgSO4 2 g，余量为水；每300 mL三角瓶装60 mL发酵培养液，配制后121℃灭菌20 min，待冷却至50 ℃，无菌条件下挑取一铂金环淀粉酶产色链霉菌D孢子接种， 28℃±1℃，发酵培养5天；
（3）发酵物提取：发酵完毕后收集发酵液，加入等体积乙酸乙酯萃取，取下层，再用等体积正丁醇萃取，取上层，在真空条件下浓缩至浸膏，该浸膏再用甲醇溶解，离心取上清液，而后上ODS柱，以甲醇和水（体积比10%~90%）洗脱，进一步分离纯化得活性化合物Tetramycin P（四霉素P）。
实施例3：（四霉素P对黄瓜立枯病菌或者番茄灰霉病菌的抑制作用）
（1）配制各种浓度的四霉素P 溶液；
（2）抑菌活性测定：取各浓度的四霉素P溶液1 mL于无菌培养皿内，与9 mL冷却至50℃的PDA培养基迅速混匀，冷却后在每个培养基平面分别放1个直径为4 mm的黄瓜立枯病菌或者番茄灰霉病菌的菌饼，菌饼接于培养皿中央（培养皿直径为9 cm），置培养箱中28℃培养36 h，以常规化学药剂和无菌水处理作为对照，重复3次；采用十字交叉法测定菌落直径，以下列公式计算抑制率：
实验结果见表1。从表1看出，四霉素P对黄瓜立枯病菌和番茄灰霉病菌的EC50值均低于多菌灵，抑制效果较常规化学药剂多菌灵强。
表1 四霉素P对黄瓜立枯病菌和番茄灰霉病菌的抑制作用

Claims (3)

1.一种化合物的制备方法，包括如下步骤：淀粉酶产色链霉菌D经斜面活化培养、发酵培养获得含有四霉素P的发酵液，加入等体积乙酸乙酯萃取，取下层，再用等体积正丁醇萃取，取上层，在真空条件下浓缩至浸膏，该浸膏再用甲醇溶解，离心取上清液，而后上ODS柱，以体积比10%~90%的甲醇和水洗脱，进一步分离纯化得活性化合物Tetramycin P（四霉素P），所述的淀粉酶产色链霉菌D的保藏登记号为CGMCC No. 2060，四霉素P结构式为：
四霉素P是一种四烯大环内酯类化合物。
2.权利要求1所述的方法，其特征在于所述的菌种D斜面活化培养步骤为：斜面培养基为高氏一号培养基，其组分与含量为：K2HPO40.5g、KNO31g、MgSO40.5g、可溶性淀粉20g、NaCl0.5g、FeSO40.01g、琼脂20g，溶化后补足水至1L；在无菌条件下用接种环挑取少许淀粉酶产色链霉菌D的孢子，至已灭菌的高氏一号培养基试管中，置培养箱内在28℃±1℃条件下活化培养96 h，至试管斜面长满孢子。
3.权利要求1所述的方法，其特征在于所述的发酵培养为：发酵培养液为每1000 mL中含有可溶性淀粉20 g，黄豆粉40 g， NH4Cl 3 g， CaCO3 5 g，MgSO4 2 g；灭菌，待冷却至50℃在无菌条件下接种淀粉酶产色链霉菌D至发酵培养液中，在 28℃±1℃条件下，培养5天。
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