CN102027948B - 丰加霉素在防治黄瓜立枯病中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了丰加霉素在防治黄瓜立枯病中的应用，属于微生物技术领域。该方法利用一种从浙江杭州临安天目山采集的土样中分离筛选出的淀粉酶产色链霉菌D，经过菌种的活化培养；发酵培养；发酵物提取；分离纯化得活性化合物丰加霉素。盆栽试验表明丰加霉素对黄瓜立枯病有明显的治疗和保护效果，其防治效果比常规化学药剂好，且安全。

Description

丰加霉素在防治黄瓜立枯病中的应用
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，特别是涉及生防放线菌——淀粉酶产色链霉菌(Streptomyces diastatochromogenes)D的培养及其代谢产物的分离与应用。
背景技术
放线菌(Actinomycetes)与人类的关系极为密切。据统计，在已发现的抗生素中，有70％约为放线菌所产生。土壤是放线菌栖居的重要场所，从土壤中获得具有高效抗菌活性的放线菌产生抗生素是目前世界范围内研制开发新医药和新农药必不可少的基础工作。
目前对植物病害的防治，主要采用化学农药防治的方法。化学农药虽然对多种病害有较理想的防治效果，但长期使用会诱发病菌的抗药性。另外，农药的频繁使用不仅增加了农产品的生产成本，农药残留问题也十分严重。利用放线菌产生的抗病原真菌的活性物质进行植物真菌病害的生物防治，则具有周期短、易于研究、便于生产、无毒无害等优点。
以往对丰加霉素活性的报道主要集中在抗肿瘤方面，但由于其对人正常细胞的毒性太大，无法应用于临床。在抗菌活性的报道方面，丰加霉素主要抑制白假丝酵母，新隐球酵母，草分支杆菌和金黄色葡萄球菌等，几乎没有对植物病原菌(稻瘟病菌(Magnaporthegrisea)除外)抑制作用的相关报道(陈伊，李舟，魏玉珍，等.根际放线菌I06-03431产生的核苷类抗生素3431的研究.生物学杂志，2009，26(4)：17-20)。本研究通过对淀粉酶产色链霉菌抗菌活性成分丰加霉素的研究发现，丰加霉素在低浓度就能强烈抑制黄瓜立枯病病原菌即黄瓜立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)菌丝生长。本发明正是填补了这项空白，拓宽了丰加霉素的应用。
发明内容
本发明从杭州的土壤中分离到一株生防放线菌，经微生物分类学鉴定为淀粉酶产色链霉菌(Streptomyces diastatochromogenes)，并对此生防放线菌发酵代谢产物中的抗菌成分进行分离，得到了活性成分，经四大光谱分析，证明为已知核苷类抗生素，丰加霉素(Toyocamycin)。该发明为微生物源农药的进一步研制和开发提供优良的出发菌株和生物活性化合物。
本发明的目的是针对化学农药不安全与微生物源农药种类较少的不足，提供一种从杭州土壤中分离筛选出的放线菌-淀粉酶产色链霉菌D；本发明的另一目的是提供利用该菌株通过发酵提取其代谢产物制备成防治部分植物真菌病害的微生物农药及其制备方法。
本发明淀粉酶产色链霉菌的分离、筛选与鉴定：
是于2006年8月在浙江杭州临安天目山采集的土样中，经分离、培养、发酵、活性测定以及对抑制植物真菌病害病原菌有效菌株的筛选等步骤获得并保存；经微生物分类学鉴定为淀粉酶产色链霉菌(Streptomyces diastatochromogenes)，定名为淀粉酶产色链霉菌(Streptomyces diastatochromogenes)D。该菌株已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏日期2007年5月25日，保藏登记号CGMCCNo.2060。
淀粉酶产色链霉菌D显微形态特征：孢子丝直、钩状、松散螺旋形，孢子长圆、椭圆或卵圆形。
本发明所述的淀粉酶产色链霉菌D，经发酵提取可获得对部分植物真菌病害病原菌具有抑制作用的活性化合物丰加霉素(Toyocamycin)。
本发明目的通过以下技术方案来实现：
丰加霉素在防治黄瓜立枯病中的应用，按以下步骤进行：
(1)菌种的活化培养：将分离保存的淀粉酶产色链霉菌D菌种移至试管内高氏一号斜面上，在28℃±1℃条件下，培养至试管斜面长满孢子；
(2)发酵培养：发酵培养液为每1000mL中含有玉米粉21.5g，可溶性淀粉10g，麸皮5g，CaCO32.5g，NH4NO31.5g，FeSO40.5g，KH2PO41.5g，灭菌；待冷却至40℃，在无菌条件下接种淀粉酶产色链霉菌D至发酵培养液中，在28℃±1℃条件下，培养5天；
(3)发酵物提取：发酵完毕，收集发酵液，按常规化学方法提取、层析，分离纯化获得活性化合物Toyocamycin，该化合物分子式为C12H13N5O4，结构式见下式；
Figure GSB00000937542700021
(4)将此活性化合物配以农用药物辅料，制备成多种剂型的农用药物。
本发明的有益效果：
一是本发明从杭州土壤分离筛选出代谢物产量高、并对部分植物真菌病害病原菌具有较强抑制作用的淀粉酶产色链霉菌D，这为农业上防治植物真菌病害病原菌提供了一种微生物菌株；
二是本发明提供了从淀粉酶产色链霉菌D的发酵物中提取其活性代谢产物丰加霉素，并进而制备成可防治植物真菌病害的微生物源农药的制备方法；该农药应用于植物真菌病害的防治，其效果较常规化学药剂相仿或略优(见试验例表1)，为农用杀菌剂的开发增添了新的途径。
具体实施方式
实施例1：(淀粉酶产色链霉菌D的分离与筛选)
本发明于2006年8月在浙江临安天目山采集的土样中，经分离、培养、发酵、活性测定以及对抑制植物真菌病害病原菌有效菌株的筛选等步骤，从中获得淀粉酶产色链霉菌(Streptomyces diastatochromogenes)D，保存。
淀粉酶产色链霉菌(Streptomyces diastatochromogenes)D抑菌活性测定：取其发酵上清液1mL于无菌培养皿内，与9mL冷却至50℃的PDA培养基迅速混匀，冷却后在每个培养基平面分别放1个直径为4mm的黄瓜立枯病菌供试菌菌饼，菌饼接于培养皿中央(培养皿直径为9cm)，置培养箱中28℃培养36h，以无菌水处理作为对照，重复3次；采用十字交叉法测定菌落直径，以下列公式计算抑制率：
Figure GSB00000937542700031
测定结果表明：淀粉酶产色链霉菌(Streptomyces diastatochromogenes)D代谢产物对黄瓜立枯病菌的抑制率为100％。
实施例2：(淀粉酶产色链霉菌D发酵代谢产物的制备方法)
按以下步骤进行：
(1)菌种试管斜面活化培养：斜面培养基为高氏一号培养基，其组分与含量为：K2HPO40.5g、KNO31g、MgSO40.5g、可溶性淀粉20g、NaCl 0.5g、FeSO40.01g、琼脂20g，溶化后补足水至1L；在无菌条件下用接种环挑取少许淀粉酶产色链霉菌D的孢子，至已灭菌的高氏一号培养基试管(15×150mm)中，置培养箱内28℃±1℃，活化培养96h，至试管斜面长满孢子；
(2)发酵培养：发酵培养液为每1000mL中含有黄玉米粉21.5g，可溶性淀粉10g，麸皮5g，CaCO32.5g，NH4NO31.5g，FeSO40.5g，KH2PO41.5g，余量为水；每300mL三角瓶装40mL发酵培养液，配制后121℃灭菌20min，待冷却至40℃在无菌条件下，挑取一铂金环淀粉酶产色链霉菌D孢子接种，28℃±1℃，发酵培养5天；
(3)发酵物提取：发酵完毕后收集发酵液，向发酵液中加入等体积的正丁醇进行萃取，取上层，并在真空条件下浓缩至浸膏，再以蒸馏水溶解，离心取上清液，而后上Sephadex LH20柱层析，以体积比10％～90％的乙醇和蒸馏水梯度洗脱，分离纯化得活性化合物Toyocamycin。
实施例3：(丰加霉素对黄瓜立枯病的生防作用)
按以下步骤进行：
采用盆栽试验法测定丰加霉素对黄瓜立枯病的生防效果。采用高11cm和上口径为14cm的塑料盆钵进行黄瓜苗室内盆栽。当瓜苗长至四叶期时，选取长势一致的植株进行试验。黄瓜立枯丝核菌采用灌根法接种。丰加霉素活性试验包括丰加霉素质量浓度为19.5mg/L和9.8mg/L 2个处理，每处理重复3次，同时以恶霉灵1000倍液为药剂对照，并设清水为空白对照。
保护作用测定：采用先喷药后接菌的方法。先在盆栽黄瓜苗的根茎部位灌施不同浓度丰加霉素药液20mL每盆，24h后接种黄瓜立枯病菌。每处理重复三次，每重复10盆瓜苗。统计接菌后14d和21d的秧苗发病情况。
治疗作用测定：采用先接菌后施药的方法。在保湿条件下接种立枯丝核菌，24h后施加不同浓度的丰加霉素药液。每处理3次重复，每重复10盆瓜苗。统计施药后14d和21d秧苗发病情况。由(1)、(2)式分别计算病情指数和防治效果。
黄瓜根茎部发病严重度病情分级标准为[7]：0级，健康苗；1级，茎基或根部稍出现病斑或稍变色；2级，1/3或1/2茎基或根部出现病斑或变色腐烂；3级，全茎或根部被病斑环绕、变色、腐烂；4级，黄瓜苗萎蔫枯死。
病情指数＝[∑(各级病株数×对应各级代表数值)/调查总株数×发病最高级的代表数值]×100(1)
相对防效(％)＝[(对照病情指数-处理病情指数)/对照病情指数]×100    (2)
盆栽试验结果表明(见表1)，丰加霉素对黄瓜立枯病有明显的治疗和保护效果。保护作用中，21d的防护效果相比14天并无明显降低。其中，施药后14d，浓度为19.5mg/L的丰加霉素的的防护效果达到51.06％，同对照农药的防护效果55.71％相当。但是，在5％的置信区间内，19.5mg/L、9.8mg/L和对照农药之间均无显著性差异。治疗作用中，14d和21d的治疗效果相当。其中，施药后14d，浓度为19.5mg/L的的丰加霉素的治疗效果达到71.91％，显著高于对照农药的治疗效果35.83％。
表1丰加霉素对黄瓜立枯病的保护和治疗作用。
Figure GSB00000937542700041
注：同列数据后不同大写字母或小写字母分别表示不同处理间在P＜0.01或P＜0.05水平的差异显著性。

Claims (2)

1.丰加霉素在防治黄瓜立枯病中的应用。
2.权利要求1所述的应用，其中丰加霉素由以下方法获得：淀粉酶产色链霉菌(Streptomycesdiastatochromogenes)D经斜面活化培养和发酵培养获得含有丰加霉素的发酵液，向发酵液中加入等体积的正丁醇进行萃取，取上层，并在真空条件下浓缩至浸膏，再以蒸馏水溶解，离心取上清液，而后上Sephadex LH20柱层析，以体积比10％～90％的乙醇和蒸馏水梯度洗脱，分离纯化得活性化合物丰加霉素，所述的淀粉酶产色链霉菌D已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏登记号为CGMCC No.2060。
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