CN103210961A - 防治人参灰霉病和黑斑病的生物农药 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株人参病害生物防治菌株的获得及应用，它是人参内生拮抗细菌NJ13，一种甲基营养型芽孢杆菌，是从人参茎部分离、筛选得到的；其发酵菌液及其滤液能拮抗人参常见7种病害及其它常见植物病害，特别是对人参灰霉病和人参黑斑病防治效果更佳；它来源于人参植株，对人参安全；发酵过程中所用原料成本较低；抗菌活性物质制备简单，操作方便，防治效果好；能有效的解决人参农药防治残留严重的问题，是一种可产业化生产的、广谱、高效的绿色生物农药。

Description

防治人参灰霉病和黑斑病的生物农药

本申请为申请号:201210498378X,申请日：2012年11月29日，发明名称：一株人参病害生物防治菌株的获得及应用的分案申请。 

技术领域

本发明属于植物生物防治技术领域，具体涉及防治人参灰霉病和黑斑病的生物农药。 

背景技术

人参是一种名贵的中药材，在我国具有悠久的药用历史，近些年由于市场需求的增长，人工栽培人参规模也随之增加。在人参种植过程中，病害的发生和发展将会对产量和品质造成严重的影响，有效控制病害是人参生产中的重要环节。目前，防治病害的主要方法是利用化学农药在病害发生期进行控制，但长期使用化学农药或不合理使用会导致人参中农药残留超标、品质下降、污染环境和病原菌产生抗药性等不良后果的出现。自2007年以来，我国人参产品出口数量呈下降趋势，出口的人参常因农药残留超标不时有被退回的现象发生，国际市场信誉不良。因此开展人参病害生物防治研究，获得生防菌株和有效产品，减少或替代化学农药的使用，对于保障我国人参生产安全，加快人参产业可持续发展进程，提高我省人参产品的质量及国际市场竞争力具有重要意义。 

植物内生菌是一类定殖在植物体内与植物建立和谐关系的一类微生物，有些菌株具有拮抗、促生等生物学功能，可产生多种生物活性物质，特别是在新的抗植物病虫害物质方面，为我们提供了一类新的微生物资源，目前已有多种植物的功能内生菌报道。因此，从人参植株体内获得具有较好抗菌和生防作用的新型细菌菌株，进而生产出高效的生物菌剂，将有利于人参病害的防治，减少化学农药的污染。 

发明内容

本发明的目的是为克服农药残留超标问题，而提供一种人参病害防治生物农药。 

防治人参灰霉病和黑斑病的生物农药，是由下述方法制得，它包括： 

1）保藏编号为CGMCC No.6679的甲基营养型芽孢杆菌，在种子培基中，培养；制备种子培养液；所述的种子培养基，包括：胰蛋白胨10 g/L、酵母膏10 g/L、NaCl 5 g/L，pH为7.0；

2）种子培养液接种于发酵培养基中， 28℃恒温摇床培养，制得发酵液；所述的发酵培养基包括：葡萄糖30 g/L、淀粉15 g/L、酵母浸粉15 g/L、NaCl 5 g/L、K₂HPO₄ 1 g/L ，pH为8.0；

步骤1）所述的培养，培养时间为10 h；

步骤2）所述的摇床培养，培养时间为96h；

所述的发酵液稀释5倍。

本发明提供了人参内生拮抗细菌NJ13，是一种甲基营养型芽孢杆菌，是从人参茎部分离、筛选得到的；其发酵菌液及其滤液能拮抗人参常见7种病害及其它常见植物病害，特别是对人参灰霉病和人参黑斑病防治效果更佳；它来源于人参植株，对人参安全；发酵过程中所用原料成本较低；抗菌活性物质制备简单，操作方便，防治效果好；能有效的解决人参农药防治残留严重的问题，是一种可产业化生产的、广谱、高效的绿色生物农药。 

附图说明

图1 为NJ13菌株菌体对3种人参病原菌的抑制作用图，A：人参菌核病菌；B：人参立枯病菌；C：人参黑斑病菌； 

图2 为NJ13菌株的抗菌谱的测定，A：人参灰霉病菌；B：人参立枯病菌；C：人参锈腐病菌；D：人参根腐病菌；

图3 为NJ13菌株菌落形态和染色观察，A：菌落形态；B：革兰氏染色形态；

图4 为NJ13菌株的细胞形态；

图5 为NJ13菌株的发酵稀释液对人参灰霉病菌的田间防治作用图，A：清水对照；B：发病后喷施NJ13菌株5倍稀释液的防治效果；

图6 为NJ13菌株的发酵稀释液对人参黑斑病菌的田间防治作用图，A：清水对照；B：发病后喷施NJ13菌株5倍稀释液的防治效果。

具体实施方式

实施例1 人参内生拮抗细菌株NJ13的筛选 

2010 年6~9 月，在吉林省5个地区分别采集新鲜人参（Panax ginseng）样品，采集部位为整个植株，生长期为4 年。在人参根、茎、叶不同器官中共分离获得了152 株内生细菌。进行人参拮抗内生菌的筛选分为初筛和复筛。其中人参植物茎部分离的NJ13菌株；于2012年10月18日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其简称为CGMCC，保藏中心登记入册编号为CGMCC No.6679，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101；分类命名：甲基营养型芽孢杆菌（Bacillus  methylotrophicus）。

实施例2 人参内生拮抗细菌株NJ13的抗菌性测定 

采用对峙法对分离得到的人参内生拮抗细菌NJ13进行菌体抑菌活性的实验。将7种人参病害靶标菌（人参锈腐病菌（Cylindrocarpon destructans）、人参灰霉病菌（Botrytis cinerea）、人参菌核病菌（Sclerotinia schinseng）、人参疫霉菌（Phytophthora cactorum）、人参黑斑病菌（Alternaria panax）、人参根腐菌（Fusarium solani）、人参立枯病菌（Rhizoetonia solani））菌饼接入PDA培养皿中央，同时将内生细菌NJ13划线接入靶标菌两侧，25℃培养2～4d，人参内生拮抗细菌NJ13菌体对上述病害均有抑菌作用（图1）。

采用杯碟法对人参内生拮抗细菌株NJ13，进行无菌发酵液抗菌谱测定。①将菌株NJ13接种于装有50mL NB液体培养基的250 mL三角瓶中，28℃振荡培养10h（150 r/min）制成种子液；②按3%的接种量，将种子液接入50ml细菌液体培养基中（葡萄糖20 g/L，胰蛋白胨 5 g/L，酵母粉5 g/L，牛肉膏3. 8 g/L，NaCl 5 g/L，CaCO₃ 1 g/L， pH 7.0），于28℃振荡培养（150 r/min）3d；③收集培养液离心（12000 r/min，4℃）15 min后得清液，取上清液用0.22 μm的无菌滤膜过滤除菌后备用，得无菌发酵液。④将1ml无菌水加入靶标菌的培养试管中，用接种针将菌丝和孢子刮下制成菌悬液与PDA培养基10 mL 混合后到入9 cm 的培养皿中制成混菌平板。⑤将灭菌牛津杯放入混好靶标菌的PDA平板中央，杯中加入200 μL无菌发酵滤液，分别置25℃培养3 d～5 d（真菌）、28℃培养1 d（细菌）后测定抑菌圈直径。结果发现菌株NJ13的发酵液对7种常见人参病菌及其它病原真菌都有不同程度的抑制作用（图2），而发酵液对8种病原细菌的抑菌效果明显小于表1中真菌的抑菌效果，其中对大豆细菌性斑点病菌没有抑制效果（表1）。证明菌株NJ13所产生的活性物质的抑菌谱较广，且对不同种类病原菌具有选择性。 

表1  菌株NJ13发酵滤液对22种植物病原菌的抑菌效果 

植物病原菌	抑菌直径/mm
		人参锈腐菌Cylindrocarpon destructans	22.4
人参灰霉菌Botrytis cinerea	35.2
		人参菌核菌Sclerotinia schinseng	14.5
人参疫霉菌Phytophthora cactorum	28.3
		人参黑斑菌Alternaria panax	34.5
人参根腐菌Fusarium solani	20
		人参立枯菌Rhizoetonia solani	36
大豆根腐镰刀菌F. moniliforme	24.5
		玉米茎基腐镰刀菌F. graminearum	27.2
玉米大斑病菌Exserohilum turcicum	21.5
		根腐镰刀菌Fusarium solani	20.5
烟草赤星病菌Alternaria alternata	19.5
		烟草炭疽菌Colletotrichum nicotianae	34
番茄早疫病菌Alternaria solani	28.5
		番茄叶霉病菌Fulvia fulva	30.5
甜瓜细菌性果斑病菌	13.5
		烟草野火病菌	12.5
大豆细菌性斑点病菌	0
		番茄细菌性斑点病菌	17
白菜软腐病菌	12.5
		黄瓜细菌性斑点病菌	10.5
水稻白叶枯病菌	12.5
		丁香细菌性疫病病菌	11.5

通过杯碟法测定NJ13菌株的传代稳定性，发现具有良好的传代抑菌稳定性，产酶测定发现可产生纤维素酶、脂肪酶、淀粉酶和蛋白质酶四种酶，不产生β-1,3-葡聚糖酶。

实施例3：人参内生拮抗细菌NJ13的鉴定 

将NJ13菌株划线接种在NA培养基上，28℃培养18～24 h后，观察记录单菌落形态。NJ13在NA培养基上呈淡黄色不透明菌落，表面粗糙有褶皱，边缘不规则，液体静止培养时有菌膜形成，革兰氏染色阳性，具有运动性（图3）。

取在LB液体培养基中培养24 h的NJ13菌株菌液进行负染色制备样品，用镊子夹住带膜的铜网蘸取微量菌液，静置2 min，从边缘用滤纸吸干剩余液；然后再用镊子夹住带菌的铜网浸入盛有双蒸水的烧杯内漂洗，再用滤纸吸干液体，接着用2%磷钨酸负染色5 min，干燥后用透射电镜观察发现菌体呈杆状，周生鞭毛，可形成椭圆形芽孢（图4）。 

参照《常见细菌系统鉴定手册》和《伯杰系统鉴定手册》中推荐的部分培养基（表2）和方法测定NJ13菌株的生理生化特性发现，菌株NJ13接触酶、氧化酶、V-P等反应为阳性；能利用柠檬酸、使硝酸盐还原、明胶液化、淀粉水解，牛奶胨化，对NaCl 的耐受性为7%；可以利用葡萄糖、麦芽糖、木糖、半乳糖、甘露醇、肌醇和山梨醇多种糖。 

表2 菌株NJ13的生理生化特性 

鉴定项目	鉴定结果	鉴定项目	鉴定结果	鉴定项目	鉴定结果
						接触酶	+	柠檬酸利用	+	麦芽糖	+
氧化酶	+	硝酸盐还原	+	木糖	+
						葡萄糖氧化发酵	+	明胶液化	+	阿拉伯糖	-
M.R	-	淀粉水解	+	半乳糖	+
						V﹣P	+	牛奶胨化	+	鼠李糖	-
脲酶	-	4℃生长	-	甘露醇	+
						吲哚	-	7%NaCl生长	+	肌醇	+
丙二酸利用	-	葡萄糖	+	山梨醇	+

注：“+”表示阳性，“-”表示阴性。

获得菌株16S rDNA（1425 bp）序列与GenBank数据库中序列进行BLAST分析比对，登录号为JX472998，构建系统进化树。NJ13与Bacillus methylotrophicus聚于同一分支中，其相似性达到99.82%。通过形态特征、培养特征、生理生化特征和分子生物学鉴定结果，NJ13菌株为甲基营养型芽孢杆菌（Bacillus methylotrophicus）。 

实施例4：人参内生拮抗细菌NJ13的发酵 

通过对NJ13菌株生长曲线的测定看出， 0～3 h为延迟期，4～11 h为对数生长期，12～24 h为稳定期，24 h后细菌生长进入衰亡期。在菌株的对数生长期内，菌体生长迅速，代谢旺盛，活力强，最适作为种子液，因此选取10h发酵液作为种子液。

发酵培养及无菌培养液制备同上，将1 mL无菌水加入人参灰霉病菌（Botrytis cinerea）的培养试管中，用接种针将菌丝和孢子刮下制成菌悬液与PDA培养基10 mL混合后到入9 cm的培养皿中制成平板，将灭菌牛津杯放入混好靶标菌的PDA平板中央，杯中加入200 μL无菌发酵滤液，25℃培养3 d后测定抑菌圈大小，菌量测定采用OD600紫外吸收比浊法测定。 

碳、氮源和无机盐单因子试验发现淀粉为碳源时抑菌效果最好，菌量较大，考虑实际应用中淀粉添加量较大时会影响耗氧微生物的通气情况，因此选用葡萄糖与淀粉复合使用作为碳源。在氮源测定中发现酵母浸粉对NJ13的生长影响很大，作为固定氮源使用，当以硝酸钠为氮源时抑菌效果最好，菌量较大，且价格低廉，所以选择硝酸钠和酵母浸粉复合使用作为本试验氮源。无机盐试验中除硫酸锌外，培养菌株均生长良好，其中磷酸氢二钾的抑菌效果最好，且在培养基的配置过程中比碳酸钙的水溶性好。正交试验得到最佳发酵配方为葡萄糖30 g/L、淀粉15 g/L、酵母浸粉15 g/L、NaCl 5 g/L、K₂HPO₄ 1 g/L。 

培养条件确定将种子培养液（胰蛋白胨10 g/L，酵母膏10 g/L， NaCl 5g/L， Ph 7.0）培养10h，以4%的接种量接入发酵培养基中培养；培养条件为培养基的起始pH为8.0，28℃恒温摇床培养96h，摇瓶装量75mL/250mL，转速为180 r/min发酵后，其抑菌活性和含菌量最好。 

实施例5：NJ13菌株发酵培养液对人参灰霉病和人参黑斑病的田间防治试验 

供试人参品种为大马牙4年生人参，防治对象为人参黑斑病菌（Alternaria panax）和人参灰霉病菌（Botrytis cinerea），试验地点为吉林省抚松县榆树参场，对照药剂为50%嘧菌环胺WG（先正达中国投资有限公司生产）。

小区面积5 m²，随机区组排列，设3 次重复。药剂处理每小区喷液量1.0 kg，对照喷等量清水。喷药3次。在发病初期施药前及最后一次用药后7 d对病害的病情指数（严重度分级标准）进行调查，调查每小区的总叶数，以及各叶片发病级数，分级记载，计算出各处理的病情指数和防治效果。 

生防菌株NJ13发酵液对人参灰霉病的田间防治试验结果表明（表3），不同浓度的NJ13菌株发酵液对人参灰霉病均具有一定的防治效果，其中稀释5倍后处理的防效最高（图5），为73.86%，低于0.67 mg/L的50%嘧菌环胺WG处理，但差异不显著，稀释10倍和30倍的处理防效较低，分别为47.11%和37.34%，以其他处理差异极显著。 

表3 生防菌株NJ13发酵液对人参灰霉病的田间防治效果 

生防菌株NJ13发酵液对人参黑斑病的田间防治试验结果表明（表4），不同浓度的NJ13菌株发酵液对人参黑斑病的防治效果较好，均大于79%，其中稀释5倍后处理的防效最高（图6），为93.90%，接近对照药剂0.67 mg/L的50%嘧菌环胺WG防效（94.33%）。

表4 生防菌株NJ13发酵液对人参黑斑病的田间防治效果 

根据对人参两种重要叶部病害的田间防治试验可以看出，生防菌株NJ13及其代谢物质对黑斑病和灰霉病均具有一定的防治效果，其中对于黑斑病的防效要好于灰霉病。因此，该菌株具有防治两种病害的生物农药开发潜力。

Claims (4)

1.防治人参灰霉病和黑斑病的生物农药，是由下述方法制得，它包括：

1）保藏编号为CGMCC No.6679的甲基营养型芽孢杆菌，在种子培基中培养；制备种子培养液；所述的种子培养基，包括：胰蛋白胨10 g/L、酵母膏10 g/L、NaCl 5 g/L，pH为7.0；

2）种子培养液接种于发酵培养基中， 28℃恒温摇床培养，制得发酵液；所述的发酵培养基包括：葡萄糖30 g/L、淀粉15 g/L、酵母浸粉15 g/L、NaCl 5 g/L、K₂HPO₄ 1 g/L ，pH为8.0。

2.根据权利要求1所述的防治人参灰霉病和黑斑病的生物农药，其特征在于：步骤1）所述的培养，培养时间为10 h。

3.根据权利要求1或2所述的防治人参灰霉病和黑斑病的生物农药，其特征在于：步骤2）所述的摇床培养，培养时间为96h。

4.根据权利要求3所述的植物病害防治的生物农药，其特征在于，将所述的发酵液稀释5倍。

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