CN105018366A - 甲基营养型芽孢杆菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus？methylotrophicus)SZ-3和SZ81，其保藏号分别为CGMCC？No.8275和CGMCC？No.8276。甲基营养型芽孢杆菌SZ-3对引起人参根腐病，黑斑病和菌核病的病原菌均具有显著拮抗作用。甲基营养型芽孢杆菌SZ-81对引起人参疫病、锈腐病和黑斑病的病原菌均具有显著拮抗作用。本发明还提供甲基营养型芽孢杆菌SZ-3和SZ81在防治植物真菌病害中的应用，或在制备防治植物真菌病害的微生物制剂中的应用。<pb pnum="1" />

Description

甲基营养型芽孢杆菌及其应用

技术领域

本发明涉及甲基营养型芽孢杆菌及其应用。

背景技术

人参(Panax ginsengC.A.Mey)为五加科人参属多年生宿根阴性双子叶药用植物，是我国的名贵药材，有“百草之王”的美誉。人参在中国、韩国、朝鲜、俄罗斯等国家有大面积种植，其中，中国东北是人参的主产区，已成为当地的重要支柱产业之一。人参的长期人工种植，且品种选育难度大导致人参种质退化、病害严重、质量差、产量低。化学农药的大量使用，导致农药残留和环境污染，降低了人参药材的安全性和商品价值。病害防控问题已成为制约人参产业可持续发展的重大问题之一。

人参病害约有20～40种，其中，以下5类病原菌是导致人参常见病害并限制人参产业发展的主要病原菌：腐皮镰孢菌(Fusarium solani)导致的人参根腐病一般发病率在30％左右，严重时六年生人参根腐病造成的死亡率可达50％～80％，主要危害幼苗根部和根茎部(地表以下茎部)，腐烂的参根呈黑褐色湿腐状，后期糟朽状，仅存中空的根皮；恶疫霉菌(Phytophthora cactorum)导致的人参疫病发病率可达70％，其症状为发病轻时叶片上产生不规则的暗绿色斑，重者茎叶枯萎，根部腐烂，植株成片枯死，减产严重；人参核盘菌(Sclerotiniaschinseng)导致的人参菌核病主要危害3年生以上参根，发病部位为芽苞、根和根茎，参根侵染后，初期在表面生少许白色绒状菌丝体，以后，内部迅速腐败、软化，细胞全部被消解殆尽，只留下坏死的外表皮，表皮内外形成许多鼠粪状的菌核；人参链格孢菌(Alternaria panax)导致的人参黑斑病一般发病率20％-30％，严重时达到100％，造成早期落叶，植株枯萎，不结实，参根和参籽减产；毁灭柱孢菌(Cylindrocarpon destructans)导致的人参锈腐病严重时发病率达70％以上。该病发生于根的各部位，病斑呈铁锈色，由点至面扩散至全根，土壤湿度大、透气不好、腐殖质层厚，发病重。

长期以来通过使用化学农药等化学防治措施来防治人参病害的结果远未达到人们预想的效果，而且过量使用化学农药会破坏土壤的微生态环境，加重环境污染，也使有毒物质在参根内大量积累，降低人参的使用安全性和商品价值，因此，人们把防治重点逐步转向生物防治措施和农业防治措施上。在农作物植物保护领域，利用作物根际土壤筛选对病原菌具有显著拮抗效果的土壤微生物，并制成生物菌剂是生物防控研究的重要手段，也是有益微生物资源开发的重要途径。

生物防治是以生态学原理为基础，利用生物物种间的相互作用，以一种或一类生物抑制另一种或另一类生物。生物防治最大的优点的不污染环境，没有农药残留，这是农药等非生物方法防治病虫害所无法比的。利用拮抗微生物防治病原微生物是生物防治技术的重要组成部分，它避免了化学农药使用带来的一系列植保、环境和能源方面的问题，避免了农药残留对人畜的危害，更重要的是促进了农业的可持续发展。

芽孢杆菌(Bacillus)是植物病害生物防治研究中的重要微生物类群，其种类多分布广，是土壤和植物微生态的优势种群。主要有枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、解淀粉枯草芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)、蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)等。由于芽孢杆菌具有抑制植物病害的能力，又是自然界中广泛存在的非致病细菌，对人畜无害，不污染环境，因而备受关注。美国已有GB03、MBI600、QsT713和解淀粉枯草芽孢杆菌变种等4株枯草芽孢杆菌生防菌株获得环保局商品化或有限商品化生产应用许可。在德国解淀粉枯草芽孢杆菌变种FZB24被商业化生产，用于控制粮食作物的不同真菌病害。该类微生物通过分泌抗生物质和生长竞争，在防治植物病害方面发挥多种有益作用。目前利用甲基营养型芽孢杆菌防治人参真菌性病害未见报道。

发明内容

本发明的目的在于，针对人参生产上主要真菌性病害，尤其是人参土传病害发生面积日益扩大，化学药剂防治易造成环境污染和农药残留外，防效也不理想的实际情况，提出2个甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)菌株，分别为SZ-3和SZ-81，及其在分别引起人参的根腐病、黑斑病、菌核病、疫病和锈腐病的腐皮镰孢菌(Fusarium solani)、人参链格孢菌(Alternariapanax)、人参核盘菌(Sclerotinia schinseng)、恶疫霉菌(Phytophthora cactorum)和毁灭柱孢菌(Cylindrocarpon destructans)5种病原菌防控上的应用。

本发明提供了2个对上述5种病原菌具有良好防控作用的甲基营养型芽孢杆菌菌株，分别为Bacillus methylotrophicus SZ-3和Bacillus methylotrophicusSZ-81，并且2个甲基营养型芽孢杆菌菌株的混合发酵液对上述5种人参病原菌的联合防控效果更加显著。

本发明通过如下技术方案实现：

上述菌株的物种鉴定是这样进行的：通过16SrDNA序列分析，测定2株细菌的16SrDNA序列长度分别为1464bp和1420bp，具体如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示。

其中，SEQ ID No.1如下所示：

GGTGGGAAAT GCTTTGCTTT ATTGCAATAT CGAGCGGACAGATGGGAGCT TGCTCCCTGA TGTTAGCGGC GGACGGGTGAGTAACACGTG GGTAACCTGC CTGTAAGACT GGGATAACTCCGGGAAACCG GGGCTAATAC CGGATGGTTG TTTGAACCGCATGGTTCAGA CATAAAAGGT GGCTTCGGCT ACCACTTACAGATGGACCCG CGGCGCATTA GCTAGTTGGT GAGGTAACGGCTCACCAAGG CGACGATGCG TAGCCGACCT GAGAGGGTGATCGGCCACAC TGGGACTGAG ACACGGCCCA GACTCCTACGGGAGGCAGCA GTAGGGAATC TTCCGCAATG GACGAAAGTCTGACGGAGCA ACGCCGCGTG AGTGATGAAG GTTTTCGGATCGTAAAGCTC TGTTGTTAGG GAAGAACAAG TGCCGTTCAAATAGGGCGGC ACCTTGACGG TACCTAACCA GAAAGCCACGGCTAACTACG TGCCAGCAGC CGCGGTAATA CGTAGGTGGCAAGCGTTGTC CGGAATTATT GGGCGTAAAG GGCTCGCAGGCGGTTTCTTA AGTCTGATGT GAAAGCCCCC GGCTCAACCGGGGAGGGTCA TTGGAAACTG GGGAACTTGA GTGCAGAAGAGGAGAGTGGA ATTCCACGTG TAGCGGTGAA ATGCGTAGAGATGTGGAGGA ACACCAGTGG CGAAGGCGAC TCTCTGGTCTGTAACTGACG CTGAGGAGCG AAAGCGTGGG GAGCGAACAGGATTAGATAC CCTGGTAGTC CACGCCGTAA ACGATGAGTGCTAAGTGTTA GGGGGTTTCC GCCCCTTAGT GCTGCAGCTAACGCATTAAG CACTCCGCCT GGGGAGTACG GTCGCAAGACTGAAACTCAA AGGAATTGAC GGGGGCCCGC ACAAGCGGTGGAGCATGTGG TTTAATTCGA AGCAACGCGA AGAACCTTACCAGGTCTTGA CATCCTCTGA CAATCCTAGA GATAGGACGTCCCCTTCGGG GGCAGAGTGA CAGGTGGTGC ATGGTTGTCGTCAGCTCGTG TCGTGAGATG TTGGGTTAAG TCCCGCAACGAGCGCAACCC TTGATCTTAG TTGCCAGCAT TCAGTTGGGCACTCTAAGGT GACTGCCGGT GACAAACCGG AGGAAGGTGGGGATGACGTC AAATCATCAT GCCCCTTATG ACCTGGGCTACACACGTGCT ACAATGGACA GAACAAAGGG CAGCGAAACCGCGAGGTTAA GCCAATCCCA CAAATCTGTT CTCAGTTCGGATCGCAGTCT GCAACTCGAC TGCGTGAAGC TGGAATCGCTAGTAATCGCG GATCAGCATG CCGCGGTGAA TACGTTCCCGGGCCTTGTAC ACACCGCCCG TCACACCACG AGAGTTTGTAACACCCGAAG TCGGTGAGGT AACCTTTAGG AGTCAGCTCGCCCTATGAGA TTGTACCCGC CCCC

其中，SEQ ID No.2如下所示：

AGCTTGCTCC CTGATGTTAG CGGCGGACGG GTGAGTAACACGTGGGTAAC CTGCCTGTAA GACTGGGATA ACTCCGGGAAACCGGGGCTA ATACCGGATG GTTGTTTGAA CCGCATGGTTCAGACATAAA AGGTGGCTTC GGCTACCACT TACAGATGGACCCGCGGCGC ATTAGCTAGT TGGTGAGGTA ACGGCTCACCAAGGCGACGA TGCGTAGCCG ACCTGAGAGG GTGATCGGCCACACTGGGAC TGAGACACGG CCCAGACTCC TACGGGAGGCAGCAGTAGGG AATCTTCCGC AATGGACGAA AGTCTGACGGAGCAACGCCG CGTGAGTGAT GAAGGTTTTC GGATCGTAAAGCTCTGTTGT TAGGGAAGAA CAAGTGCCGT TCAAATAGGGCGGCACCTTG ACGGTACCTA ACCAGAAAGC CACGGCTAACTACGTGCCAG CAGCCGCGGT AATACGTAGG TGGCAAGCGTTGTCCGGAAT TATTGGGCGT AAAGGGCTCG CAGGCGGTTTCTTAAGTCTG ATGTGAAAGC CCCCGGCTCA ACCGGGGAGGGTCATTGGAA ACTGGGGAAC TTGAGTGCAG AAGAGGAGAGTGGAATTCCA CGTGTAGCGG TGAAATGCGT AGAGATGTGGAGGAACACCA GTGGCGAAGG CGACTCTCTG GTCTGTAACTGACGCTGAGG AGCGAAAGCG TGGGGAGCGA ACAGGATTAGATACCCTGGT AGTCCACGCC GTAAACGATG AGTGCTAAGTGTTAGGGGGT TTCCGCCCCT TAGTGCTGCA GCTAACGCATTAAGCACTCC GCCTGGGGAG TACGGTCGCA AGACTGAAACTCAAAGGAAT TGACGGGGGC CCGCACAAGC GGTGGAGCATGTGGTTTAAT TCGAAGCAAC GCGAAGAACC TTACCAGGTCTTGACATCCT CTGACAATCC TAGAGATAGG ACGTCCCCTTCGGGGGCAGA GTGACAGGTG GTGCATGGTT GTCGTCAGCTCGTGTCGTGA GATGTTGGGT TAAGTCCCGC AACGAGCGCAACCCTTGATC TTAGTTGCCA GCATTCAGTT GGGCACTCTAAGGTGACTGC CGGTGACAAA CCGGAGGAAG GTGGGGATGACGTCAAATCA TCATGCCCCT TATGACCTGG GCTACACACGTGCTACAATG GACAGAACAA AGGGCAGCGA AACCGCGAGGTTAAGCCAAT CCCACAAATC TGTTGTCAGT TCGGATCGCAGTCTGCAACT CGACTGCGTG AAGCTGGAAT CGCTAGTAATCGCGGATCAG CATGCCGCGG TGAATACGTT CCCGGGCCTTGTACACACCG CCCGTCACAC CACGAGAGTT TGTAACACCCGAAGTCGGTG AGGTTACGTC TTCGGAGCCA GCACGGTAGAGTTTGTCCTT TCCGTTGGGC

应用BLAST软件和DNAMAN软件等进行分析，将所测16SrDNA序列通过BLAST比对，能在GenBank中找到同源性非常高的相近菌株序列。与SZ-3和SZ-81菌株相似性最高的是Bacillus属菌种，同源性达到99％。根据MEGA5.10Beta2软件以UPGMA法构建系统发育树发现，菌株SZ-3和SZ-81与Bacillus methylotrophicus同属一个遗传分枝，亲缘关系十分接近，亲源性达到了99.2％和99.3％。结合形态学和生理生化性状的鉴定结果，可以确认分离到的菌株SZ-3和SZ-81均为甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)。上述菌株的保藏名称分别为甲基营养型芽孢杆菌SZ-3和甲基营养型芽孢杆菌SZ-81，分类命名分别为Bacillus methylotrophicus SZ-3和Bacillusmethylotrophicus SZ-81，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2013年9月25日，保藏编号分别为CGMCC No.8275和CGMCC No.8276。即，

一种甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)SZ-3，其特征在于，其保藏号为CGMCC No.8275；和

一种甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)SZ-81，其特征在于，其保藏号为CGMCC No.8276。

本发明的甲基营养型芽孢杆菌SZ-3在牛肉膏蛋白胨(NB)培养基上单细胞繁殖生长形成的菌落为圆形，四周光滑，乳白色，表面有光泽，质地干燥，具鞭毛；细胞形状为杆状；厌氧生长；革兰氏染色呈阳性；接触酶测定、脂肪酶反应为阳性；酪蛋白、酪氨酸反应为阳性；V-P试验和硝酸盐还原反应为阳性；能利用D-葡萄糖，D-木糖，L-阿拉伯糖，甘露醇，不能利用柠檬酸盐；能水解淀粉和明胶；菌株接入到含2％NaCl的NB培养液中发酵24h后混浊。甲基营养型芽孢杆菌SZ-81在牛肉膏蛋白胨(NB)培养基上单细胞繁殖生长形成的菌落为圆形，四周光滑，乳白色，表面有光泽，质地干燥，具鞭毛；细胞形状为杆状；厌氧生长；革兰氏染色呈阳性；接触酶测定、脂肪酶反应为阳性；酪蛋白、酪氨酸反应为阳性；V-P试验和硝酸盐还原反应为阳性；能利用D-葡萄糖，D-木糖，L-阿拉伯糖，甘露醇，不能利用柠檬酸盐；能水解淀粉和明胶；菌株接入到含5％NaCl的NB培养液中发酵24h后混浊。

所述的牛肉膏蛋白胨(NB)培养基的配方为：牛肉膏3.0g，蛋白胨10.0g，NaCl5.0g，琼脂17g，水1000mL，pH6.8～7.2。

本发明的甲基营养型芽孢杆菌SZ-81，其特征在于，该菌株在牛肉膏蛋白胨(NB)培养基上单细胞繁殖生长形成的菌落为圆形，四周光滑，乳白色，表面有光泽，质地干燥，具鞭毛；细胞形状为杆状；厌氧生长；革兰氏染色呈阳性；接触酶测定、脂肪酶反应为阳性；酪蛋白、酪氨酸反应为阳性；V-P试验和硝酸盐还原反应为阳性；能利用D-葡萄糖，D-木糖，L-阿拉伯糖，甘露醇，不能利用柠檬酸盐；能水解淀粉和明胶；菌株接入到含5％NaCl的NB培养液中发酵24h后混浊。

根据本发明，所述的甲基营养型芽孢杆菌SZ-81的NB培养基的配方为：牛肉膏3.0g，蛋白胨10.0g，NaCl5.0g，琼脂17g，水1000mL，pH6.8～7.2。

本发明还涉及上述甲基营养型芽孢杆菌SZ-3或SZ-81在防治植物真菌病害中的应用，或在制备防治植物真菌病害的微生物制剂中的应用。所述植物优选为人参。其中，甲基营养型芽孢杆菌SZ-3优选用于防治引起人参的根腐病的腐皮镰孢菌(F.solani)、引起人参黑斑病的人参链格孢菌(A.panax)和引起人参菌核病的人参核盘菌(S.schinseng)中的一种或多种。所述甲基营养型芽孢杆菌SZ-81优选用于防治引起人参疫病的恶疫霉菌(Ph.cactorum)、引起人参锈腐病的毁灭柱孢菌(C.destructans)和引起人参黑斑病的人参链格孢菌(A.panax)中的一种或多种。本发明的甲基营养型芽孢杆菌SZ-3和SZ-81对人参还具有促生长作用。

本发明还涉及微生物制剂，含有甲基营养型芽孢杆菌SZ-3的全培养液培养物和甲基营养型芽孢杆菌SZ-3孢子，其可通过以下制备方法制备得到：

(1)将甲基营养型芽孢杆菌SZ-3的试管种接种于用1000mL三角瓶装的300mL NBP培养液中，在180r/min，30℃下培养36小时，获得发酵菌液；

(2)将发酵菌液在以种子罐体积10％接种于种子罐中的发酵培养液中发酵培养，溶氧量为15～18％，搅拌速度200rpm，种子罐的温度28～32℃，接种发酵菌液4小时后，每隔2小时对种子罐中的发酵液进行发酵质量检测，直到发酵液菌体生长比较饱满即将出现芽孢时，获得发酵菌种，种子罐中的发酵时间为14～18小时；

(3)将种子罐中发酵菌种的10％接种于发酵罐中的NBP培养液中发酵培养，溶氧量为15～18％，搅拌速度200rpm，发酵罐的温度28～32℃，接种发酵菌种4小时后，每隔2小时对发酵罐进行发酵质量检测，观察菌含量，直到发酵罐中发酵液中的最终培养物(包含菌和芽孢)生物量为10⁹cfu/mL以上、芽孢含量大于或等于95％时，立即将发酵液出罐，进行分装，获得SZ-3微生物制剂；发酵罐中的发酵时间为36～48小时。

根据本发明的微生物制剂，其特征在于，所述的NBP培养液的配方为：牛肉膏3.0g，蛋白胨10.0g，酵母浸膏5.0g，葡萄糖5.0g，NaCl5.0g，水1000mL，pH6.8～7.2；所述的发酵培养液的配方以重量百分比计为：玉米粉2.0％，豆饼粉1.5％，淀粉0.5％，酵母浸膏0.2％，NaCl8.0％，MgSO₄·7H₂O0.10％，余量为水，pH6.8～7.0。

根据本发明的微生物制剂，其特征在于，所述的NBP培养液如下配制：称取牛肉膏、蛋白胨、酵母浸膏、葡萄糖、NaCl放入1000mL水中，充分混匀后将pH调整至6.8～7.2，1000mL三角瓶中装量为300mL培养液，用双层封口膜封好三角瓶口，121℃湿热灭菌30分钟，冷却后备用。

所述的发酵培养液如下配制：在种子罐中加入所需的水，按比例加入玉米粉、豆饼粉、淀粉、酵母浸膏、NaCl、MgSO₄·7H₂O，充分搅拌，将发酵培养液pH调整到6.8～7.0，密封加料孔，用高温蒸汽灭菌2小时，冷却后立即接种。

根据本发明的的微生物制剂，其特征在于，在种子罐或发酵罐的发酵中，当出现较多泡沫时，加入消泡剂，所述的消泡剂为有机硅，加入量以种子罐或发酵罐中的泡沫不溢出为准；发酵罐发酵完成后，在发酵罐中加入占罐中液体总体积万分之二的苯甲酸防腐剂，搅拌均匀，再出罐进行分装。

本发明还涉及微生物制剂，含有甲基营养型芽孢杆菌SZ-81的全培养液培养物和甲基营养型芽孢杆菌SZ-81孢子，其可通过以下制备方法制备得到：

(1)将甲基营养型芽孢杆菌SZ-81的试管种接种于用1000mL三角瓶装的300mL NBP培养液中，在180r/min，30℃下培养36小时，获得发酵菌液；

(2)将发酵菌液在以种子罐体积10％接种于种子罐中的发酵培养液中发酵培养，溶氧量为15～18％，搅拌速度200rpm，种子罐的温度28～32℃，接种发酵菌液4小时后，每隔2小时对种子罐中的发酵液进行发酵质量检测，直到发酵液菌体生长比较饱满即将出现芽孢时，获得发酵菌种，种子罐中的发酵时间为14～18小时；

(3)将种子罐中发酵菌种的10％接种于发酵罐中的NBP培养液中发酵培养，溶氧量为15～18％，搅拌速度200rpm，发酵罐的温度28～32℃，接种发酵菌种4小时后，每隔2小时对发酵罐进行发酵质量检测，观察菌含量，直到发酵罐中发酵液中的最终培养物(包含菌和芽孢)生物量为10⁹cfu/mL以上、芽孢含量大于或等于95％时，立即将发酵液出罐，进行分装，获得SZ-81微生物制剂；发酵罐中的发酵时间为36～48小时。

根据本发明的含有SZ-81的微生物制剂，其特征在于，所述的NBP培养液的配方为：牛肉膏3.0g，蛋白胨10.0g，酵母浸膏5.0g，葡萄糖5.0g，NaCl5.0g，水1000mL，pH6.8～7.2；所述的发酵培养液的配方以重量百分比计为：玉米粉2.0％，豆饼粉1.5％，淀粉0.5％，酵母浸膏0.2％，NaCl8.0％，MgSO₄·7H₂O0.10％，余量为水，pH6.8～7.0。

根据本发明的所述的微生物制剂，其特征在于，所述的NBP培养液是这样配制的：称取牛肉膏、蛋白胨、酵母浸膏、葡萄糖、NaCl放入1000mL水中，充分混匀后将pH调整至6.8～7.2，1000mL三角瓶中装量为300mL培养液，用双层封口膜封好三角瓶口，121℃湿热灭菌30分钟，冷却后备用；

所述的发酵培养液是这样配制的：在种子罐中加入所需的水，按比例加入玉米粉、豆饼粉、淀粉、酵母浸膏、NaCl、MgSO₄·7H₂O，充分搅拌，将发酵培养液pH调整到6.8～7.0，密封加料孔，用高温蒸汽灭菌2小时，冷却后立即接种。

根据本发明所述的微生物制剂，其特征在于，在种子罐或发酵罐的发酵过程中，当出现较多泡沫时，加入消泡剂，所述的消泡剂为有机硅，加入量以种子罐或发酵罐中的泡沫不溢出为准；发酵罐发酵完成后，在发酵罐中加入占罐中液体总体积万分之二的苯甲酸防腐剂，搅拌均匀，再出罐进行分装。

本发明还涉及微生物制剂，含有甲基营养型芽孢杆菌SZ-3和SZ-81的全培养液培养物和甲基营养型芽孢杆菌SZ-3和SZ-81的孢子，其可通过将上述SZ-3微生物制剂和上述SZ-81微生物制剂混合制备得到，二者的体积比为各占总体积的50％。或者通过以下制备方法制备得到：

(1)将甲基营养型芽孢杆菌SZ-3的试管种和甲基营养型芽孢杆菌SZ-81的试管种分别接种于用1000mL三角瓶装的300mL NBP培养液中，在180r/min，30℃下培养36小时，获得发酵菌液；

(2)将SZ-3发酵菌液和SZ-81发酵菌液以各占总体积的50％混合均匀后，在以种子罐体积10％接种于种子罐中的发酵培养液中发酵培养，溶氧量为15～18％，搅拌速度200rpm，种子罐的温度28～32℃，接种发酵菌液4小时后，每隔2小时对种子罐中的发酵液进行发酵质量检测，直到发酵液菌体生长比较饱满即将出现芽孢时，获得发酵菌种，种子罐中的发酵时间为14～18小时；

(3)将种子罐中发酵菌种的10％接种于发酵罐中的NBP培养液中发酵培养，溶氧量为15～18％，搅拌速度200rpm，发酵罐的温度28～32℃，接种发酵菌种4小时后，每隔2小时对发酵罐进行发酵质量检测，观察菌含量，直到发酵罐中发酵液中的最终培养物(包含菌和芽孢)生物量为10⁹cfu/mL以上、芽孢含量大于或等于95％时，立即将发酵液出罐，进行分装，获得SZ-3和SZ-81微生物制剂；发酵罐中的发酵时间为36～48小时。

上述NBP培养液的配方为：牛肉膏3.0g，蛋白胨10.0g，酵母浸膏5.0g，葡萄糖5.0g，NaCl5.0g，水1000mL，pH6.8～7.2。其制备方法为：称取牛肉膏、蛋白胨、酵母浸膏、葡萄糖、NaCl放入1000mL水中，充分混匀后将pH调整至6.8～7.2，1000mL三角瓶中装量为300mL培养液，用双层封口膜封好三角瓶口，121℃湿热灭菌30分钟，冷却后备用。

上述发酵培养液的配方以重量百分比计为：玉米粉2.0％，豆饼粉1.5％，淀粉0.5％，酵母浸膏0.2％，NaCl8.0％，MgSO₄·7H₂O0.10％，余量为水，pH6.8～7.0。制备方法为：在种子罐中加入所需的水，按比例加入玉米粉、豆饼粉、淀粉、酵母浸膏、NaCl、MgSO₄·7H₂O，充分搅拌，将发酵培养液pH调整到6.8～7.0，密封加料孔，用高温蒸汽灭菌2小时，冷却后立即接种。

在种子罐或发酵罐的发酵中，当出现较多泡沫时，可以加入消泡剂，所述的消泡剂为有机硅，加入量以种子罐或发酵罐中的泡沫不溢出为准；发酵罐发酵完成后，在发酵罐中加入占罐中液体总体积万分之二的苯甲酸防腐剂，搅拌均匀，再出罐进行分装。

通过上述发酵工艺得到的发酵液即为一种微生物杀菌剂。本发明的微生物制剂可以以稀释液的形式在人参真菌病害发病初期均匀地施加到土壤中，微生物制剂与水的稀释体积比为1:200。另外，稀释液中还可以添加助剂有机硅，有机硅与稀释液的体积比为1:5000。

含有甲基营养型芽孢杆菌SZ-81的全培养液培养物和甲基营养型芽孢杆菌SZ-81的孢子的微生物制剂如上所述的应用，其特征在于，所述真菌为腐皮镰孢菌(Fusarium.solani)、人参链格孢菌(Alternaria panax)和人参核盘菌(Sclerotiniaschinseng)中的一种或多种。

本发明的含有甲基营养型芽孢杆菌SZ-3和SZ-81的全培养液培养物和甲基营养型芽孢杆菌SZ-3和SZ-81的孢子的微生物制剂在防治人参真菌病害中的应用。优选地，可以同时防治引起人参的根腐病的腐皮镰孢菌(F.solani)、引起人参黑斑病的人参链格孢菌(A.panax)、引起人参菌核病的人参核盘菌(S.schinseng)、引起人参疫病的恶疫霉菌(Ph.cactorum)和引起人参锈腐病的毁灭柱孢菌(C.destructans)中的一种或多种，具有广谱性，且表现出比单一微生物制剂更好的防治效果。

根据本发明，在人参真菌病害发病初期，将所述微生物制剂的稀释液均匀地施加到土壤中，所述的稀释液中微生物制剂与水的稀释体积比为1:200。

根据本发明，其特征在于，所述的稀释液中还添加了助剂有机硅，所述助剂有机硅与稀释液的体积比为1:5000。

本发明的优点在于：保藏号为CGMCC No.8275和CGMCC No.8276的甲基营养型芽孢杆菌SZ-3和SZ-81均对分别由腐皮镰孢菌(F.solani)、人参链格孢菌(A.panax)、人参核盘菌(S.ginseng)、恶疫霉菌(Ph.cactorum)和毁灭柱孢菌(C.destructans)引起的人参的根腐病、黑斑病、菌核病、疫病和锈腐病均具有良好的防治效果，并且对人参具有促生长作用，无毒无致病性，对人畜安全，不污染环境。特别是，SZ-3和SZ-81的混合微生物制剂表现出比单一微生物制剂更好的防治效果。本发明的生防菌剂稀释后直接施加到土壤中对植物进行灌根处理即可发挥其杀菌作用，能显著改善人参根际环境中微生物群落的合理结构，形成一个生物多样化的人参根际土壤微生态环境，从而有效地、持久地控制人参真菌性病害的流行。

附图说明

图1：本发明的甲基营养型芽孢杆菌SZ-3菌株对人参核盘菌(Sclerotiniaschinseng)菌丝的生长平板抑制作用。

图2：本发明的甲基营养型芽孢杆菌SZ-81菌株对毁灭柱孢菌(Cylindrocarpon destructan s)菌丝的生长平板抑制作用。

图3：本发明的甲基营养型芽孢杆菌SZ-81菌株对恶疫霉菌(Phytophthoracactorum)菌丝的生长平板抑制作用。

图4：本发明的甲基营养型芽孢杆菌SZ-3菌株对腐皮镰孢菌(Fusariumsolani)菌丝的生长平板抑制作用。

图5：本发明的甲基营养型芽孢杆菌SZ-81菌株对人参链格孢菌(Alternariapanax)菌丝的生长平板抑制作用。

图6：本发明的甲基营养型芽孢杆菌SZ-3菌株对人参链格孢菌(Alternariapanax)菌丝的生长平板抑制作用。

图7：混合发酵液对腐皮镰孢菌引起的人参根腐病的防治效果。

图8：混合发酵液对恶疫霉菌引起的人参疫病病的防治效果。

图9：混合发酵液对人参核盘菌引起的人参菌核病的防治效果。

图10：混合发酵液对毁灭柱孢菌引起的人参锈腐病的防治效果。

图11：混合发酵液对人参链格孢菌引起的人参黑斑病的防治效果。

图12：SZ-3对人参的促生长作用(A：空白，B：浇注SZ-3菌悬液)。

图13：SZ-81对人参的促生长作用(A：空白，B：浇注SZ-81菌悬液)。

具体实施方式

实施例1

甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)SZ-3和SZ-81的分离和保藏

该菌株自吉林省抚松县万良镇人参栽培基地多年生人参根际周围30cm以内的土壤分离得到，采集上述土壤样品，风干后过筛。称取样品10g，放入装有玻璃珠和90mL无菌水的三角瓶中，充分振荡10-30min，使样品与无菌水混合均匀，制得样品悬液，静置5min。在无菌条件下取1mL上清液，加入9mL0.05％SDS水溶液(十二烷基硫酸钠水溶液)，40℃保温20min，取1mL，加入9mL无菌水，按梯度依次制成10^-3、10^-4、10^-5的稀释液。分别吸取100μl各稀释液加入到牛肉膏蛋白胨(NB)平板上，采用平板稀释法均匀涂布，每处理3次重复，34℃培养箱培养1～2天。挑选单菌落转接到NB平板培养，长出菌落后，用接种环进行划线分离纯化，纯化菌株于4℃保存。上述牛肉膏蛋白胨(NB)培养基配方为：牛肉膏3.0g、蛋白胨10.0g、NaCl5.0g，琼脂17g，水1000mL，pH6.8～7.2。

分离、纯化获得的菌株SZ-3在牛肉膏蛋白胨(NB)培养基上单细胞繁殖生长形成的菌落为圆形，四周光滑，乳白色，表面有光泽，质地干燥，具鞭毛；细胞形状为杆状；厌氧生长；革兰氏染色呈阳性；接触酶测定、脂肪酶反应为阳性；酪蛋白、酪氨酸反应为阳性；V-P试验和硝酸盐还原反应为阳性；能利用D-葡萄糖，D-木糖，L-阿拉伯糖，甘露醇，不能利用柠檬酸盐；能水解淀粉和明胶；菌株接入到含2％NaCl的NB培养液中发酵24h后混浊。菌株SZ-81在牛肉膏蛋白胨(NB)培养基上单细胞繁殖生长形成的菌落为圆形，四周光滑，乳白色，表面有光泽，质地干燥，具鞭毛；细胞形状为杆状；厌氧生长；革兰氏染色呈阳性；接触酶测定、脂肪酶反应为阳性；酪蛋白、酪氨酸反应为阳性；V-P试验和硝酸盐还原反应为阳性；能利用D-葡萄糖，D-木糖，L-阿拉伯糖，甘露醇，不能利用柠檬酸盐；能水解淀粉和明胶；菌株接入到含5％NaCl的NB培养液中发酵24h后混浊。

上述2个菌株均于2013年9月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号分别为CGMCC No.8275和CGMCC No.8276分别命名SZ-3、SZ-81，分类命名为甲基营养型芽孢杆菌(Bacillusmethylotrophicus)。

实施例2

SZ-3和SZ-81菌株对人参真菌病害病原菌生长的抑制作用

采用滤纸片法分别测定菌株SZ-3、SZ-81对人参真菌病害病菌的拮抗作用：用直径8mm的打孔器将活化好的人参病原菌菌落制成相应尺寸的菌饼，无菌接种至马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)平板(直径90mm)的正中央，同时将4片直径为1cm的灭菌滤纸圆片粘于距平板中心25mm处的4个角点上。将菌株SZ-3和SZ-81分别制成菌悬液(浓度约为10⁸cfu/mL)，其中3片滤纸圆片每片点接20μL菌悬液，1片滤纸圆片点接20μL无菌水，作为处理组，每个处理重复3次；另在一块平板的4个角点的4片滤纸圆片上均分别点接20μL无菌水，作为对照组，均置于28℃培养箱培养6～7天，待对照组病原菌菌落长满平板，测量处理组病原菌菌落直径(单位：mm)，并按照如下公式计算抑菌率。每种病原菌重复3次，结果取平均值。

抑菌率(％)＝[(A－B)/(A－8)]×100％

注：A为对照组病原菌菌落直径，即90mm；B为处理组病原菌菌落直径。[0045]马铃薯葡萄糖(PDA)培养基的制备方法：称取去皮马铃薯200g、葡萄糖20g，加入水1000mL，调节pH为7.0。在沸水浴上加热20min，纱布过滤后定容到1000mL，加琼脂22g熔化后分装湿热灭菌(121℃，30min)。

上述菌悬液的制备方法：保藏的菌株SZ-3和SZ-80分别通过平板划线方式活化2天后，用接种环取3～4块直径1cm的细菌菌落，接入到200mL含50mL牛肉膏蛋白胨(NB)培养液的三角锥形瓶中，摇床32℃，180r/min培养48h后制成浓度约为10⁸cfu/mL的细菌菌悬液。牛肉膏蛋白胨(NB)培养液的配方为：牛肉膏3.0g、蛋白胨10.0g、NaCl5.0g，水1000mL，pH6.8～7.2。

结果如表1所示，菌株SZ-3对分别引起人参根腐病、黑斑病和菌核病的腐皮镰孢菌、人参链格孢菌和人参核盘菌)均具有明显的抑制作用；而菌株SZ-81对分别引起人参锈腐病、疫病和黑斑病的毁灭柱孢菌、恶疫霉菌和人参链格孢菌均具有明显的抑制作用。

表1菌株SZ-3、SZ-81对人参病原真菌的抑制作用

实施例3

甲基营养型芽孢杆菌SZ-3和SZ-81对人参病菌的拮抗活性实验

采用牛津杯法分别测定菌株SZ-3和SZ-81菌株对人参真菌病害病菌的拮抗活性：将SZ-3和SZ-81菌株分别制成菌悬液后收集(制备方法同实施例2)，在4℃条件下，12000r/min离心20min，收集上清液经0.22μm微孔滤膜过滤，所得滤液4℃保存备用。无菌条件下在PDA平板中央接种直径为8mm的人参病菌菌饼，然后将4个无菌牛津杯放于距平板中心约25mm的4个对称角点，每杯内滴加100μl滤液，每处理3次重复，28℃培养5天后测量抑菌带宽度。

结果表明，SZ-3对人参核盘菌、腐皮镰孢菌和人参链格孢菌的抑菌带分别为13.8mm、6.2mm、10.1mm；SZ-81对人参链格孢菌、毁灭柱孢菌和恶疫霉菌的抑菌带分别为2.7mm、8.5mm、10.2mm，表明这两株菌对人参病菌具有明显的抑制效果(表2)。

表2甲基营养型芽孢杆菌SZ-3、SZ-81对人参病原真菌的拮抗活性

注：参考Vestberg法，“+”、“++”、“+++”分别表示抑菌带半径为<5mm、5-10mm、>10mm。

实施例4

甲基营养型芽孢杆菌SZ-3和SZ-81对人参的促生作用

分别制备SZ-3和SZ-81的菌株菌悬液(32℃、180r/m、48h，浓度约为10⁸cfu/mL，制备方法同实施例2)。将人参新林土：蛭石按照2:1比例配制基质，灭菌后填装于同体积花盆中。应用取于抚松万良县的3年生人参苗，小心抖落附着于根部的土壤，随机分组。将处理组人参苗分别浸泡于预先配置好的SZ-3和SZ-81菌悬液中，25-30min后取出，分别移栽于装有灭菌土的花盆中，分为SZ-3、SZ-81两组，每处理3盆，每盆5株。每组每盆各用SZ-3、SZ-81菌悬液(含菌量约为10⁸cfu/mL)的100倍无菌水稀释液30mL灌根，随机排列，温室保湿培养；对照组用无菌牛肉膏蛋白胨(NB)培养液浸苗，处理方式同上，每处理3盆，随机排列，温室保湿培养，分别浇灌30mL的无菌培养液(除不含有SZ-3和SZ-81外，其余成分与处理组相同)。待人参苗长至30天后，分别随机选取处理组和对照组各5株人参苗，小心将苗整株挖出，洗去根部泥土，测量其株高、根长、整株鲜重和根鲜重指标。然后180℃烘干至恒重，测整株干重和根干重。

室内盆栽测定结果表明(表3所示)，接种SZ-3和SZ-81于灭菌土种植人参时，人参植株株高、整株鲜重、根鲜重、根长、整株干重及根干重较无菌培养液均有不同程度的增加，证明菌株SZ-3和SZ-81对人参生长均具有明显的促进作用(如图11，12)。同时，也说明SZ-3和SZ-81对人参时安全的。

表3菌株SZ-3和SZ-81对人参生长的促进作用

实施例5

甲基营养型芽孢杆菌SZ-3与SZ-81在土壤中的定殖

将用利福平(300μg/mL)标记过的甲基营养型芽孢杆菌SZ-3和SZ-81分别接种于NB培养液，32℃，180r/min，摇床振荡24h，分别制成含菌量约为10⁸cfu/mL的标记菌株菌悬液。分别把自然土及灭菌土装于花盆中，每盆1kg土，各自向土壤中注入100mL标记过的甲基营养型芽孢杆菌SZ-3和SZ-81菌悬液拌土。室温下放置，每隔7天分离1次土壤内的细菌(土壤先经梯度稀释后，取10^-3、10^-4、10^-5的土壤稀释液进行平板涂布)，计算含菌量。结果表明，28天后自然土和灭菌土中SZ-3和SZ-81的定殖菌量均能达到10⁵cfu/g土以上。这说明SZ-3和SZ-81在土壤中均具有较强的定殖能力。

实施例6

SZ-3和SZ-81发酵菌液的制备

甲基营养型芽孢杆菌Bacillus methylotrophicus SZ-3和SZ-81的试管种分别接种于用1000mL三角瓶装的300mL NBP培养液中，在180r/min，30℃下培养36小时，获得发酵菌液。

NBP培养液的制备方法为：称取牛肉膏3.0g，蛋白胨10.0g，酵母浸膏5.0g，葡萄糖5.0g，NaCl5.0g，放入1000mL水中，充分混匀后将pH调整至6.8～7.2，1000mL三角瓶中装量为300mL培养液，用双层封口膜封好三角瓶口，121℃湿热灭菌30分钟，冷却后备用。

实施例7

甲基营养型芽孢杆菌SZ-3微生物制剂的制备

甲基营养型芽孢杆菌SZ-3微生物制剂含有甲基营养型芽孢杆菌SZ-3的全培养物和甲基营养型芽孢杆菌SZ-3的孢子，制备方法如下：

(1)将实施例6中培养好的SZ-3发酵菌液在以种子罐体积10％接种于种子罐中的发酵培养液中发酵培养，溶氧量为15～18％，搅拌速度200rpm，种子罐的温度28～32℃，接种发酵菌液4小时后，每隔2小时对种子罐中的发酵液进行发酵质量检测，直到发酵液菌体生长比较饱满即将出现芽孢时，获得发酵菌种，种子罐中的发酵时间为14～18小时；

(2)将种子罐中发酵菌种的10％接种于发酵罐中的NBP培养液中发酵培养，溶氧量为15～18％，搅拌速度200rpm，发酵罐的温度28～32℃，接种发酵菌种4小时后，每隔2小时对发酵罐进行发酵质量检测，观察菌含量，直到发酵罐中发酵液中的最终培养物(包含菌和芽孢)生物量为10⁹cfu/mL以上、芽孢含量大于或等于95％时，立即将发酵液出罐，进行分装，获得SZ-3微生物制剂；发酵罐中发酵时间为36～48小时。

上述NBP培养液的配方为：牛肉膏3.0g，蛋白胨10.0g，酵母浸膏5.0g，葡萄糖5.0g，NaCl5.0g，水1000mL，pH6.8～7.2；制备方法为：称取牛肉膏、蛋白胨、酵母浸膏、葡萄糖、NaCl放入1000mL水中，充分混匀后将pH调整至6.8～7.2，1000mL三角瓶中装量为300mL培养液，用双层封口膜封好三角瓶口，121℃湿热灭菌30分钟，冷却后备用；发酵培养液的配方以重量百分比计为：玉米粉2.0％，豆饼粉1.5％，淀粉0.5％，酵母浸膏0.2％，NaCl8.0％，MgSO₄·7H₂O0.10％，余量为水，pH6.8～7.0，制备方法为：在种子罐中加入所需的水，按比例加入玉米粉、豆饼粉、淀粉、酵母浸膏、NaCl、MgSO₄·7H₂O，充分搅拌，将发酵培养液pH调整到6.8～7.0，密封加料孔，用高温蒸汽灭菌2小时，冷却后立即接种。

实施例8

甲基营养型芽孢杆菌SZ-81微生物制剂的制备

甲基营养型芽孢杆菌SZ-81微生物制剂含有甲基营养型芽孢杆菌SZ-81的全培养物和甲基营养型芽孢杆菌SZ-81的孢子，制备方法如下：

(1)将实施例6中培养好的SZ-81发酵菌液在以种子罐体积10％接种于种子罐中的发酵培养液中发酵培养，溶氧量为15～18％，搅拌速度200rpm，种子罐的温度28～32℃，接种发酵菌液4小时后，每隔2小时对种子罐中的发酵液进行发酵质量检测，直到发酵液菌体生长比较饱满即将出现芽孢时，获得发酵菌种，种子罐中的发酵时间为14～18小时；

(2)将种子罐中发酵菌种的10％接种于发酵罐中的NBP培养液中发酵培养，溶氧量为15～18％，搅拌速度200rpm，发酵罐的温度28～32℃，接种发酵菌种4小时后，每隔2小时对发酵罐进行发酵质量检测，观察菌含量，直到发酵罐中发酵液中的最终培养物(包含菌和芽孢)生物量为10⁹cfu/mL以上、芽孢含量大于或等于95％时，立即将发酵液出罐，进行分装，获得SZ-81微生物制剂；发酵罐中发酵时间为36～48小时。

实施例9

甲基营养型芽孢杆菌SZ-3和SZ-81微生物制剂的制备

甲基营养型芽孢杆菌SZ-3和SZ-81微生物制剂含有甲基营养型芽孢杆菌SZ-3和SZ-81的全培养液培养物和甲基营养型芽孢杆菌SZ-3和SZ-81的孢子，制备方法如下：

(1)将实施例中培养好的SZ-3和SZ-81发酵菌液以各占总体积的50％混合均匀后，在以种子罐体积10％接种于种子罐中的发酵培养液中发酵培养，溶氧量为15～18％，搅拌速度200rpm，种子罐的温度28～32℃，接种发酵菌液4小时后，每隔2小时对种子罐中的发酵液进行发酵质量检测，直到发酵液菌体生长比较饱满即将出现芽孢时，获得发酵菌种，种子罐中的发酵时间为14～18小时；

(2)将种子罐中发酵菌种的10％接种于发酵罐中的NBP培养液中发酵培养，溶氧量为15～18％，搅拌速度200rpm，发酵罐的温度28～32℃，接种发酵菌种4小时后，每隔2小时对发酵罐进行发酵质量检测，观察菌含量，直到发酵罐中发酵液中的最终培养物(包含菌和芽孢)生物量为10⁹cfu/mL以上、芽孢含量大于或等于95％时，立即将发酵液出罐，进行分装，获得SZ-3和SZ-81微生物制剂；发酵罐中发酵时间为36～48小时。

实施例10

甲基营养型芽孢杆菌SZ-3和SZ-81对人参真菌病害的田间防治试验

人参根腐菌防治试验于2013年安排在吉林农业大学药用植物园人参实验田进行，试验用地为平原田块，土壤为林地土壤。人参于6月10日移栽，随机区组排列，每小区种有人参20株，4次重复。移栽前，处理组用实施例9制备的微生物制剂的200倍无菌水稀释液蘸根，根腐病发病初期开始灌根，每株灌上述200倍稀释液10mL，分别于6月20日和6月30日灌根两次。以10％多菌灵250倍无菌水稀释液为药剂对照，以无菌水为空白对照。6月20日、7月10日各调查一次病情指数，调查结果如表4。

人参锈腐病防治试验于2013年安排在吉林农业大学药用植物园人参实验田进行，试验用地为平原田块，土壤为林地土壤。人参于5月19日移栽。随机区组排列，每小区种有人参20株，4次重复。移栽前，处理组用实施例9制备的微生物制剂的200倍无菌水稀释液蘸根，人参开始发病时对人参灌根，每株灌上述200倍稀释液10mL，分别于5月29日和6月8日灌根两次。以50％多菌灵可湿性粉剂1000倍无菌水稀释液为药剂对照，以无菌水为空白对照。5月29日、6月18日各调查一次病情指数，调查结果如表4。

人参黑斑病防治试验于2013年安排在吉林农业大学药用植物园人参实验田进行，试验用地为平原田块，土壤为林地土壤。人参于7月5日移栽。随机区组排列，每小区种有人参20株，4次重复。人参开始发病时，对处理组人参喷施实施例9制备的微生物制剂的200倍无菌水稀释液，分别于7月15日和7月23日喷施两次。以阿米西达1500倍无菌水稀释液为药剂对照，以无菌水为空白对照。7月15日、8月1日各调查一次病情指数，调查结果如表4。

人参疫病防治试验于2013年安排在吉林农业大学药用植物园人参实验田进行，试验用地为平原田块，土壤为林地土壤。人参于7月5日移栽。随机区组排列，每小区种有人参20株，4次重复。人参开始发病时，对处理组人参喷施实施例9制备的微生物制剂的200倍无菌水稀释液，分别于7月15日和7月23日喷施两次。以50％咪鲜胺锰盐可湿性粉剂的1000倍无菌水稀释液为药剂对照，以无菌水为空白对照。7月15日、8月1日各调查一次病情指数，调查结果如表4。

人参菌核病防治试验于2013年安排在吉林农业大学药用植物园人参实验田进行，试验用地为平原田块，土壤为林地土壤。6月10日移栽，随机区组排列，每小区种有人参20株，4次重复。移栽前，处理组用实施例9制备的微生物制剂的200倍无菌水稀释液蘸根，菌核病发病初期开始灌根，每株灌上述200倍稀释液10mL，分别于6月20日和6月30日灌根两次。以40％菌核净可湿性粉剂500倍无菌水稀释液为药剂对照，以无菌水为空白对照。6月20日、7月10日各调查一次病情指数，调查结果如表4。

如上防效试验计算方法：病情指数＝[∑(病级株数×代表值)/(总株数×最高病级代表值)]×100，

相对防效(％)＝(对照病情指数－处理病情指数)/对照病情指数×100

如表4所示，甲基营养型芽孢杆菌SZ-3和SZ-81对人参的根腐病、锈腐病、黑斑病、疫病和菌核病均有较好的防效，防治效果与上述病害主用药剂相当或略优。

表4甲基营养型芽孢杆菌SZ-3和SZ-81微生物制剂对人参真菌性病害的防治效果试验

注：根腐病、黑斑病、菌核病、疫病和锈腐病的病原菌分别为腐皮镰孢菌(F.solani)、人参链格孢菌(A.panax)、人参核盘菌(S.schinseng)、恶疫霉菌(Ph.cactorum)和毁灭柱孢菌(C.destructans)。

实施例11

应用TaKaRa MiniBEST Bacterial GenomicDNA Extraction Kit Ver.2.0试剂盒(宝生物工程(大连)有限公司)方法提取DNA，自行合成的PCR引物序列为16S1F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG3′，16S1R：5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT3′。分别以SZ-3、SZ-81菌体基因组DNA为模板，经PCR反应扩增，经1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，各得到一条1500bp左右的特异性片段，测定该片段序列(采用TIANGEN凝胶回收试剂盒于生工生物工程(上海)股份有限公司测序)，结果表明，测得SZ-3、SZ-81菌株分别为1464bp、1420bp，具体如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示。应用BLAST软件和DNAMAN软件以及clustalx拼接软件进行分析，发现，SZ-3、SZ-81菌株测得的序列与甲基营养型芽孢杆菌的16srDNA部分序列同源性很高。根据MEGA5.0软件构建系统发育进化树发现，SZ-3、SZ-81与Bacillusmethylotrophicus同属一个遗传分枝，亲缘关系十分接近，亲源性达到了99.2-99.3％。结合形态学和生理生化性状的鉴定结果，可以确认试验分离到菌株SZ-3、SZ-81为甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)。

以上各实施例不是对本发明的具体限制，只要根据权利要求限定的范围，在本专利的启示下，结合本领域的基本常识，将所述菌株用于人参真菌性病害的防治中，都属于本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)SZ-3，其特征在于，其保藏号为CGMCC No.8275。

优选地，其特征在于，该菌株在牛肉膏蛋白胨(NB)培养基上单细胞繁殖生长形成的菌落为圆形，四周光滑，乳白色，表面有光泽，质地干燥，具鞭毛；细胞形状为杆状；厌氧生长；革兰氏染色呈阳性；接触酶测定、脂肪酶反应为阳性；酪蛋白、酪氨酸反应为阳性；V-P试验和硝酸盐还原反应为阳性；能利用D-葡萄糖，D-木糖，L-阿拉伯糖，甘露醇，不能利用柠檬酸盐；能水解淀粉和明胶；菌株接入到含2％NaCl的NB培养液中发酵24h后混浊；

优选地，所述的NB培养基的配方为：牛肉膏3.0g，蛋白胨10.0g，NaCl5.0g，琼脂17g，水1000mL，pH6.8～7.2。

2.一种甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)SZ-81，其特征在于，其保藏号为CGMCC No.8276。

优选地，其特征在于，该菌株在牛肉膏蛋白胨(NB)培养基上单细胞繁殖生长形成的菌落为圆形，四周光滑，乳白色，表面有光泽，质地干燥，具鞭毛；细胞形状为杆状；厌氧生长；革兰氏染色呈阳性；接触酶测定、脂肪酶反应为阳性；酪蛋白、酪氨酸反应为阳性；V-P试验和硝酸盐还原反应为阳性；能利用D-葡萄糖，D-木糖，L-阿拉伯糖，甘露醇，不能利用柠檬酸盐；能水解淀粉和明胶；菌株接入到含5％NaCl的NB培养液中发酵24h后混浊；

优选地，所述的NB培养基的配方为：牛肉膏3.0g，蛋白胨10.0g，NaCl5.0g，琼脂17g，水1000mL，pH6.8～7.2。

3.如权利要求1所述的甲基营养型芽孢杆菌SZ-3或者如权利要求2所述的甲基营养型芽孢杆菌SZ-81在防治植物真菌病害中的应用，或在制备防治植物真菌病害的微生物制剂中的应用。

优选地，所述植物为人参。

甲基营养型芽孢杆菌SZ-3优选用于防治引起人参的根腐病的腐皮镰孢菌(Fusarium solani)、人参链格孢菌(Alternaria panax)和人参核盘菌(Sclerotiniaschinseng)中的一种或多种真菌。

优选地，所述甲基营养型芽孢杆菌SZ-81优选用于防治引起人参的根腐病的毁灭柱孢菌(Cylindrocarpon.destructans)、恶疫霉菌(Phytophthora cactorum)和人参链格孢菌(Alternaria panax)中的一种或多种真菌。

4.一种微生物制剂，其特征在于，含有权利要求1的甲基营养型芽孢杆菌SZ-3的全培养液培养物和甲基营养型芽孢杆菌SZ-3的孢子。

5.如权利要求4所述的微生物制剂，其特征在于，其是通过以下制备方法制备得到的：

(1)将如权利要求1所述的甲基营养型芽孢杆菌SZ-3的试管种接种于用1000mL三角瓶装的300mL NBP培养液中，在180r/min，30℃下培养36小时，获得发酵菌液；

(2)将发酵菌液在以种子罐体积10％接种于种子罐中的发酵培养液中发酵培养，溶氧量为15～18％，搅拌速度200rpm，种子罐的温度28～32℃，接种发酵菌液4小时后，每隔2小时对种子罐中的发酵液进行发酵质量检测，直到发酵液菌体生长比较饱满即将出现芽孢时，获得发酵菌种，种子罐中的发酵时间为14～18小时；

(3)将种子罐中发酵菌种的10％接种于发酵罐中的NBP培养液中发酵培养，溶氧量为15～18％，搅拌速度200rpm，发酵罐的温度28～32℃，接种发酵菌种4小时后，每隔2小时对发酵罐进行发酵质量检测，观察菌含量，直到发酵罐中发酵液中的最终培养物(包含菌和芽孢)生物量为10⁹cfu/mL以上、芽孢含量大于或等于95％时，立即将发酵液出罐，进行分装，获得SZ-3微生物制剂；发酵罐中的发酵时间为36～48小时。

优选地，所述的NBP培养液的配方为：牛肉膏3.0g，蛋白胨10.0g，酵母浸膏5.0g，葡萄糖5.0g，NaCl5.0g，水1000mL，pH6.8～7.2；所述的发酵培养液的配方以重量百分比计为：玉米粉2.0％，豆饼粉1.5％，淀粉0.5％，酵母浸膏0.2％，NaCl8.0％，MgSO₄·7H₂O0.10％，余量为水，pH6.8～7.0。

更优选地，所述的NBP培养液是这样配制的：称取牛肉膏、蛋白胨、酵母浸膏、葡萄糖、NaCl放入1000mL水中，充分混匀后将pH调整至6.8～7.2，1000mL三角瓶中装量为300mL培养液，用双层封口膜封好三角瓶口，121℃湿热灭菌30分钟，冷却后备用；

优选地，所述的发酵培养液是这样配制的：在种子罐中加入所需的水，按比例加入玉米粉、豆饼粉、淀粉、酵母浸膏、NaCl、MgSO₄·7H₂O，充分搅拌，将发酵培养液pH调整到6.8～7.0，密封加料孔，用高温蒸汽灭菌2小时，冷却后立即接种。

特别优选地，在种子罐或发酵罐的发酵中，当出现较多泡沫时，加入消泡剂，所述的消泡剂为有机硅，加入量以种子罐或发酵罐中的泡沫不溢出为准；发酵罐发酵完成后，在发酵罐中加入占罐中液体总体积万分之二的苯甲酸防腐剂，搅拌均匀，再出罐进行分装。

6.一种微生物制剂，其特征在于，含有权利要求2的甲基营养型芽孢杆菌SZ-81的全培养液培养物和甲基营养型芽孢杆菌SZ-81的孢子。

7.如权利要求6所述的微生物制剂，其特征在于，其是通过以下制备方法制备得到的：

(1)将如权利要求2所述的甲基营养型芽孢杆菌SZ-81的试管种接种于用1000mL三角瓶装的300mL NBP培养液中，在180r/min，30℃下培养36小时，获得发酵菌液；

(2)将发酵菌液在以种子罐体积10％接种于种子罐中的发酵培养液中发酵培养，溶氧量为15～18％，搅拌速度200rpm，种子罐的温度28～32℃，接种发酵菌液4小时后，每隔2小时对种子罐中的发酵液进行发酵质量检测，直到发酵液菌体生长比较饱满即将出现芽孢时，获得发酵菌种，种子罐中的发酵时间为14～18小时；

(3)将种子罐中发酵菌种的10％接种于发酵罐中的NBP培养液中发酵培养，溶氧量为15～18％，搅拌速度200rpm，发酵罐的温度28～32℃，接种发酵菌种4小时后，每隔2小时对发酵罐进行发酵质量检测，观察菌含量，直到发酵罐中发酵液中的最终培养物(包含菌和芽孢)生物量为10⁹cfu/mL以上、芽孢含量大于或等于95％时，立即将发酵液出罐，进行分装，获得SZ-81微生物制剂；发酵罐中的发酵时间为36～48小时。

优选地，所述的NBP培养液的配方为：牛肉膏3.0g，蛋白胨10.0g，酵母浸膏5.0g，葡萄糖5.0g，NaCl5.0g，水1000mL，pH6.8～7.2；所述的发酵培养液的配方以重量百分比计为：玉米粉2.0％，豆饼粉1.5％，淀粉0.5％，酵母浸膏0.2％，NaCl8.0％，MgSO₄·7H₂O0.10％，余量为水，pH6.8～7.0。

更优选地，所述的NBP培养液是这样配制的：称取牛肉膏、蛋白胨、酵母浸膏、葡萄糖、NaCl放入1000mL水中，充分混匀后将pH调整至6.8～7.2，1000mL三角瓶中装量为300mL培养液，用双层封口膜封好三角瓶口，121℃湿热灭菌30分钟，冷却后备用。

优选地，所述的发酵培养液是这样配制的：在种子罐中加入所需的水，按比例加入玉米粉、豆饼粉、淀粉、酵母浸膏、NaCl、MgSO₄·7H₂O，充分搅拌，将发酵培养液pH调整到6.8～7.0，密封加料孔，用高温蒸汽灭菌2小时，冷却后立即接种。

特别优选地，在种子罐或发酵罐的发酵过程中，当出现较多泡沫时，加入消泡剂，所述的消泡剂为有机硅，加入量以种子罐或发酵罐中的泡沫不溢出为准；发酵罐发酵完成后，在发酵罐中加入占罐中液体总体积万分之二的苯甲酸防腐剂，搅拌均匀，再出罐进行分装。

8.一种微生物制剂，其特征在于，含有甲基营养型芽孢杆菌SZ-3和SZ-81的全培养液培养物和甲基营养型芽孢杆菌SZ-3和SZ-81的孢子。

优选地，所述生物制剂是通过以下制备方法制备得到的：将如权利要求4或5中任一项所述的微生物制剂和如权利要求6或7中任一项所述的微生物制剂混合，二者的体积比为各占总体积的50％。或者，所述生物制剂是通过以下制备方法制备得到的：

(1)将如权利要求1所述的甲基营养型芽孢杆菌SZ-3的试管种和如权利要求2所述的甲基营养型芽孢杆菌SZ-81的试管种分别接种于用1000mL三角瓶装的300mL NBP培养液中，在180r/min，30℃下培养36小时，获得发酵菌液；

(2)将SZ-3发酵菌液和SZ-81发酵菌液以各占总体积的50％混合均匀后，在以种子罐体积10％接种于种子罐中的发酵培养液中发酵培养，溶氧量为15～18％，搅拌速度200rpm，种子罐的温度28～32℃，接种发酵菌液4小时后，每隔2小时对种子罐中的发酵液进行发酵质量检测，直到发酵液菌体生长比较饱满即将出现芽孢时，获得发酵菌种，种子罐中的发酵时间为14～18小时；

(3)将种子罐中发酵菌种的10％接种于发酵罐中的NBP培养液中发酵培养，溶氧量为15～18％，搅拌速度200rpm，发酵罐的温度28～32℃，接种发酵菌种4小时后，每隔2小时对发酵罐进行发酵质量检测，观察菌含量，直到发酵罐中发酵液中的最终培养物(包含菌和芽孢)生物量为10⁹cfu/mL以上、芽孢含量大于或等于95％时，立即将发酵液出罐，进行分装，获得SZ-3和SZ-81微生物制剂；发酵罐中的发酵时间为36～48小时。

优选地，所述的NBP培养液的配方为：牛肉膏3.0g，蛋白胨10.0g，酵母浸膏5.0g，葡萄糖5.0g，NaCl5.0g，水1000mL，pH6.8～7.2；所述的发酵培养液的配方以重量百分比计为：玉米粉2.0％，豆饼粉1.5％，淀粉0.5％，酵母浸膏0.2％，NaCl8.0％，MgSO₄·7H₂O0.10％，余量为水，pH6.8～7.0。

更优选地，所述的NBP培养液是这样配制的：称取牛肉膏、蛋白胨、酵母浸膏、葡萄糖、NaCl放入1000mL水中，充分混匀后将pH调整至6.8～7.2，1000mL三角瓶中装量为300mL培养液，用双层封口膜封好三角瓶口，121℃湿热灭菌30分钟，冷却后备用；

还更优选地，所述的发酵培养液是这样配制的：在种子罐中加入所需的水，按比例加入玉米粉、豆饼粉、淀粉、酵母浸膏、NaCl、MgSO₄·7H₂O，充分搅拌，将发酵培养液pH调整到6.8～7.0，密封加料孔，用高温蒸汽灭菌2小时，冷却后立即接种。

特别优选地，在种子罐或发酵罐的发酵过程中，当出现较多泡沫时，加入消泡剂，所述的消泡剂为有机硅，加入量以种子罐或发酵罐中的泡沫不溢出为准；发酵罐发酵完成后，在发酵罐中加入占罐中液体总体积万分之二的苯甲酸防腐剂，搅拌均匀，再出罐进行分装。

9.如权利要求4-7中任一项所述的微生物制剂在防治人参真菌病害中的应用。

优选地，所述真菌为腐皮镰孢菌(Fusarium.solani)、人参链格孢菌(Alternaria panax)和人参核盘菌(Sclerotinia schinseng)中的一种或多种。

优选地，其特征在于，所述真菌为毁灭柱孢菌(Cylindrocarpon.destructans)、恶疫霉菌(Phytophthora cactorum)和人参链格孢菌(Alternaria panax)中的一种或多种。

还优选地，在人参真菌病害发病初期，将所述微生物制剂的稀释液均匀地施加到土壤中，所述的稀释液中微生物制剂与水的稀释体积比为1:200。

更优选地，所述的稀释液中还添加了助剂有机硅，所述助剂有机硅与稀释液的体积比为1:5000。

10.如权利要求8所述的微生物制剂在防治人参真菌病害中的应用。

优选地，所述真菌为腐皮镰孢菌(Fusarium.solani)、毁灭柱孢菌(Cylindrocarpon.destructans)、恶疫霉菌(Phytophthora cactorum)、人参链格孢菌(Alternaria panax)和人参核盘菌(Sclerotinia schinseng)中的一种或多种。

还优选地，在人参真菌病害发病初期，将所述微生物制剂的稀释液均匀地施加到土壤中，所述的稀释液中微生物制剂与水的稀释体积比为1:200。

更优选地，所述的稀释液中还添加了助剂有机硅，所述助剂有机硅与稀释液的体积比为1:5000。