CN108130302B - 一种马铃薯专用抗病菌剂及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种马铃薯专用抗病菌剂，所述抗病菌剂包含芽孢杆菌和淡紫拟青霉；所述芽孢杆菌和淡紫拟青霉的重量比为6‑9:1；所述芽孢杆菌至少含有侧孢芽孢杆菌、甲基营养型芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、胶冻样类芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌中的三种。本发明制备的马铃薯专用抗病菌剂合理利用微生物间的相互作用，适应性强、稳定性好、对病原菌拮抗性强，能够高效拮抗马铃薯早疫病、疮咖病的病原菌，刺激植物生长、改善作物品质，从而达到增产、高产的目的。

Description

一种马铃薯专用抗病菌剂及其制备方法

技术领域

本发明属于农业和生物技术领域，具体涉及一种马铃薯专用抗病菌剂，适用于马铃薯早疫病和马铃薯疮痂病。

背景技术

马铃薯是我国重要的农作物之一，地位仅次于水稻、小麦和玉米，为我国第四大农作物。马铃薯的种植区域广泛，病害也较为复杂，其中由多种植物病原链霉菌引起的马铃薯早疫病和马铃薯疮痂病是马铃薯最普遍、最常见的病害。

马铃薯早疫病菌除危害马铃薯外，也危害茄子、辣椒、番茄等。早疫病主要危害叶片，发生严重时也危害叶柄和茎。叶片染病，病斑灰白色至黑褐色，圆形或近圆形，有时病斑发展扩大受叶脉限制而呈多角形。病斑具同心轮纹，潮湿时，病斑上生出黑色霉层。病斑多时互相融合成大的枯斑区，引起叶片局部或全部枯死。茎和叶柄染病，产生暗褐色稍凹陷、长条形或长梭形黑褐色病斑，有时有同心轮纹。有的块茎染病，皮下呈现淡褐色海绵状干腐。

马铃薯疮痂病为细菌性病害，病原菌是链霉菌，在适宜土壤中可永久存活。病菌侵入植株后，地上部分看不到症状，但薯块表面会出现疮痂。土壤干燥、通气性好、中性或碱性的地块易发病，发病后病菌能在土中长期残存。田间主要侵染薯块，块茎表面先产生褐色小点，扩大后形成褐色至棕褐色、圆形或不规则形的大斑块。病斑表面细胞大量木栓化，表现为粗糙的锈色疮痂状。后期病斑或呈裂出状、高出叶表面1-2mm的凸起疮痂，或呈内延和下陷、深入1-7mm的凹陷疮痂病。凹陷病斑多为暗褐或近黑色，病斑处组织似稻草黄褐色且略显半透明状。疮痂病发生后，病斑虽然仅限于皮层，但病薯不耐贮藏，外观难看，对马铃薯的品质影响很大，造成商品价值下降，经济损失严重，一般可减产10％-30％，部分地块甚至减产40％以上。由于其具有随水及其它方式传染的特征，防治不当或不及时将会造成更大的灾难性损失。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供一种马铃薯专用抗病菌剂，所述抗病菌剂包含芽孢杆菌和淡紫拟青霉；所述芽孢杆菌和淡紫拟青霉的重量比为6-9:1；所述芽孢杆菌至少含有侧孢芽孢杆菌、甲基营养型芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、胶冻样类芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌中的三种。

本发明马铃薯专用抗病菌剂，针对马铃薯容易感染的早疫病菌、疮痂病菌，通过微生物间的拮抗关系，挑选了对这两种病菌抗病效果较好的多种微生物枯草芽孢杆菌、甲基营养型芽孢杆菌、侧孢芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、淡紫拟青霉、胶冻样类芽孢杆菌。实验发现，当这些菌种以合理的比例复配，所得复合菌剂其抗早疫病菌、疮痂病菌效果好，能够显著降低马铃薯早疫病和疮痂病的发病率。

优选地，所述芽孢杆菌由枯草芽孢杆菌、甲基营养型芽孢杆菌、侧孢芽孢杆菌组成，所述枯草芽孢杆菌、甲基营养型芽孢杆菌、侧孢芽孢杆菌组成质量比为3-4:2-3:1-2。

优选地，所述芽孢杆菌和淡紫拟青霉的重量比为8:1。

所述马铃薯专用抗病菌剂有效活菌数10-20亿个/克。

一种马铃薯专用抗病菌剂的制备方法，包括如下步骤：

S1.菌种活化：将芽孢杆菌、淡紫拟青霉菌种分别接斜面，培养30-48小时，然后各加入到无菌水中振荡25-30分钟，待均匀后用血球计数板计数，使各种菌的每毫升有效活菌数大于1×10¹¹个，得菌悬液；

S2.种子罐发酵：一级种子罐灭菌，装入培养基后再灭菌，菌悬液接入，通入无菌空气培养，得一级种子罐发酵菌液；二级种子罐灭菌，装入培养基后再灭菌，将一级种子罐发酵液接入二级种子罐，通入无菌空气和搅拌进行培养，得二级种子罐发酵液；

S3.生产发酵罐培养：先将发酵罐灭菌，装入培养基后再灭菌，按体积百分比5％～8％的接种量将二级种子罐发酵液接入发酵罐中通入无菌空气培养，得芽孢杆菌菌剂和淡紫拟青霉菌剂，各菌种活菌数每克10⁸个以上。

S4.复合菌剂制备：将S3制备的芽孢杆菌菌剂和淡紫拟青霉菌剂均匀混合，制得复合菌剂即马铃薯专用抗病菌剂；每克复合菌剂中有效活菌数10-20亿个，杂菌数<1％，含水量<10％。

S1所述菌种活化采用的培养基包括葡萄糖、淀粉、蛋白胨、KH₂PO₄，pH为6.0-8.0。

优选地，S2所述一级种子罐和二级种子罐采用的培养基为PDA培养基或高氏一号培养基；接种量为菌剂占总发酵培养基质量的3-5％。

S3所述培养条件：PDA培养基、温度25-30℃培养3-5天。

优选地，S3所述培养条件：PDA培养基、温度30℃培养4天。

所述马铃薯专用抗病菌剂用于防治马铃薯早疫病和马铃薯疮痂病。

本发明的有益效果：

本发明马铃薯专用抗病菌剂，针对马铃薯容易感染的早疫病菌、疮痂病菌，通过微生物间的拮抗关系，挑选了对这两种病菌抗病效果较好的多种微生物枯草芽孢杆菌、甲基营养型芽孢杆菌、侧孢芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、淡紫拟青霉、胶冻样类芽孢杆菌。实验发现，当这些菌种以合理的比例复配，所得复合菌剂其抗早疫病菌、疮痂病菌效果好。本发明能够高效拮抗马铃薯早疫病、疮咖病的病原菌，刺激植物生长、改善作物品质，从而达到增产、高产的目的。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进一步详细说明，但本发明要求的保护范围并不局限于实施例。

实施例1:

S1.菌种活化：将枯草芽孢杆菌、甲基营养型芽孢杆菌、侧孢芽孢杆菌、淡紫拟青霉微生物菌种分别接斜面，培养基为葡萄糖30g/L、淀粉15g/L、蛋白胨23g/L、NaCl 10g/L、KH₂PO₄0.5g/L，其余为蒸馏水；pH7.0。培养30小时，然后各加入到无菌水中振荡30分钟，待均匀后用血球计数板计数，使各种菌的每毫升有效活菌数大于1×10¹¹个，得菌悬液。

S2.种子罐发酵：一级种子罐灭菌，装入培养基后再灭菌，菌悬液接入，通入无菌空气培养，得一级种子罐发酵菌液；二级种子罐灭菌，装入培养基后再灭菌，将一级种子罐发酵液接入二级种子罐，通入无菌空气和搅拌进行培养，得二级种子罐发酵菌液；一级种子罐和二级种子罐采用的培养基为PDA培养基，一级种子罐和二级种子罐培养发酵的接种量为菌剂占总发酵培养基质量的3％。

S3.生产发酵罐培养：先将发酵罐灭菌，装入PDA培养基后再灭菌，按体积百分比5％的接种量将二级种子罐发酵液接入发酵罐，通入无菌空气，25℃培养5天。

S4.复合菌剂制备：将S3制备得到的枯草芽孢杆菌3kg、甲基营养型芽孢杆菌2kg、侧孢芽孢杆菌1kg、淡紫拟青霉1kg混合制得复合菌剂，各菌种活菌数每克10⁸个以上；每克复合菌剂中有效活菌数约10亿个，杂菌数<1％，含水量<10％。

实施例2:

S1.菌种活化：将枯草芽孢杆菌、甲基营养型芽孢杆菌、侧孢芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、淡紫拟青霉、胶冻样类芽孢杆菌八种微生物菌种分别接斜面，培养基为葡萄糖30g/L、淀粉15g/L、蛋白胨23g/L、NaCl 10g/L、KH₂PO₄0.5g/L，其余为蒸馏水；pH7.0。培养48小时，然后各加入到无菌水中振荡25分钟，待均匀后用血球计数板计数，使各种菌的每毫升有效活菌数大于1×10¹¹个，得菌悬液。

S2.种子罐发酵：一级种子罐灭菌，装入培养基后再灭菌，菌悬液接入，通入无菌空气培养，得一级种子罐发酵菌液；二级种子罐灭菌，装入培养基后再灭菌，将一级种子罐发酵液接入二级种子罐，通入无菌空气和搅拌进行培养，得二级种子罐发酵菌液；一级种子罐和二级种子罐采用的培养基为高氏一号培养基，一级种子罐和二级种子罐培养发酵的接种量为菌剂占总发酵培养基质量的5％。

S3.生产发酵罐培养：先将发酵罐灭菌，装入PDA培养基后再灭菌，按体积百分比8％的接种量将二级种子罐发酵液接入发酵罐，通入无菌空气，30℃培养3天。

S4.复合菌剂制备：将S3制备得到的枯草芽孢杆菌4kg、甲基营养型芽孢杆菌3kg、侧孢芽孢杆菌2kg、解淀粉芽孢杆菌2kg、地衣芽孢杆菌1kg、巨大芽孢杆菌1kg、淡紫拟青霉2kg、胶冻样类芽孢杆菌1kg混合制得复合菌剂，各菌种活菌数每克10⁸个以上；每克复合菌剂中有效活菌数约20亿个，杂菌数<1％，含水量<10％。

实施例3:

S1.菌种活化：将枯草芽孢杆菌、甲基营养型芽孢杆菌、侧孢芽孢杆菌、淡紫拟青霉微生物菌种分别接斜面，培养基为葡萄糖30g/L、淀粉15g/L、蛋白胨23g/L、NaCl 10g/L、KH₂PO₄0.5g/L，其余为蒸馏水；pH7.0。培养42小时，然后各加入到无菌水中振荡30分钟，待均匀后用血球计数板计数，使各种菌的每毫升有效活菌数大于1×10¹¹个，得菌悬液。

S2.种子罐发酵：一级种子罐灭菌，装入培养基后再灭菌，菌悬液接入，通入无菌空气培养，得一级种子罐发酵菌液；二级种子罐灭菌，装入培养基后再灭菌，将一级种子罐发酵液接入二级种子罐，通入无菌空气和搅拌进行培养，得二级种子罐发酵菌液；一级种子罐和二级种子罐采用的培养基为PDA培养基，一级种子罐和二级种子罐培养发酵的接种量为菌剂占总发酵培养基质量的4％。

S3.生产发酵罐培养：先将发酵罐灭菌，装入PDA培养基后再灭菌，按体积百分比6％的接种量将二级种子罐发酵液接入发酵罐，通入无菌空气，30℃培养4天。

S4.复合菌剂制备：将S3制备得到的枯草芽孢杆菌4kg、甲基营养型芽孢杆菌3kg、侧孢芽孢杆菌2kg、淡紫拟青霉1kg混合制得复合菌剂，各菌种活菌数每克10⁸个以上；每克复合菌剂中有效活菌数约15亿个，杂菌数<1％，含水量<10％。

实施例4:

S1.菌种活化：将枯草芽孢杆菌、甲基营养型芽孢杆菌、侧孢芽孢杆菌、淡紫拟青霉微生物菌种分别接斜面，培养基为葡萄糖30g/L、淀粉15g/L、蛋白胨23g/L、NaCl 10g/L、KH₂PO₄0.5g/L，其余为蒸馏水；pH7.0。培养30小时，然后各加入到无菌水中振荡30分钟，待均匀后用血球计数板计数，使各种菌的每毫升有效活菌数大于1×10¹¹个，得菌悬液。

S2.种子罐发酵：一级种子罐灭菌，装入培养基后再灭菌，菌悬液接入，通入无菌空气培养，得一级种子罐发酵菌液；二级种子罐灭菌，装入培养基后再灭菌，将一级种子罐发酵液接入二级种子罐，通入无菌空气和搅拌进行培养，得二级种子罐发酵菌液；一级种子罐和二级种子罐采用的培养基为高氏一号培养基，一级种子罐和二级种子罐培养发酵的接种量为菌剂占总发酵培养基质量的3％。

S3.生产发酵罐培养：先将发酵罐灭菌，装入PDA培养基后再灭菌，按体积百分比5％的接种量将二级种子罐发酵液接入发酵罐，通入无菌空气，30℃培养4天。

S4.复合菌剂制备：将S3制备得到的枯草芽孢杆菌3kg、甲基营养型芽孢杆菌2kg、侧孢芽孢杆菌2kg、淡紫拟青霉1kg混合制得复合菌剂，各菌种活菌数每克10⁸个以上；每克复合菌剂中有效活菌数约10亿个，杂菌数<1％，含水量<10％。

实施例5:

S1.菌种活化：将枯草芽孢杆菌、甲基营养型芽孢杆菌、侧孢芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、淡紫拟青霉、胶冻样类芽孢杆菌八种微生物菌种分别接斜面，培养基为葡萄糖30g/L、淀粉15g/L、蛋白胨23g/L、NaCl 10g/L、KH₂PO₄0.5g/L，其余为蒸馏水；pH7.0。培养30小时，然后各加入到无菌水中振荡30分钟，待均匀后用血球计数板计数，使各种菌的每毫升有效活菌数大于1×10¹¹个，得菌悬液。

S2.种子罐发酵：一级种子罐灭菌，装入培养基后再灭菌，菌悬液接入，通入无菌空气培养，得一级种子罐发酵菌液；二级种子罐灭菌，装入培养基后再灭菌，将一级种子罐发酵液接入二级种子罐，通入无菌空气和搅拌进行培养，得二级种子罐发酵菌液；一级种子罐和二级种子罐采用的培养基为PDA培养基，一级种子罐和二级种子罐培养发酵的接种量为菌剂占总发酵培养基质量的5％。

S3.生产发酵罐培养：先将发酵罐灭菌，装入PDA培养基后再灭菌，按体积百分比5％的接种量将二级种子罐发酵液接入发酵罐，通入无菌空气，25℃培养4天。

S4.复合菌剂制备：将S3制备得到的枯草芽孢杆菌3kg、甲基营养型芽孢杆菌2kg、侧孢芽孢杆菌1kg、解淀粉芽孢杆菌1kg、淡紫拟青霉1kg混合制得复合菌剂，各菌种活菌数每克10⁸个以上；每克复合菌剂中有效活菌数约10亿个，杂菌数<1％，含水量<10％。

对比例1-8

S1、S2、S3步骤与实施例1相同培养单种活性菌种，没有步骤S4。对比例1-8分别为制备的枯草芽孢杆菌、甲基营养型芽孢杆菌、侧孢芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、胶冻样类芽孢杆菌、淡紫拟青霉。

对比例9

S1、S2、S3步骤与实施例1相同。

S4.复合菌剂制备：将枯草芽孢杆菌6kg、甲基营养型芽孢杆菌3kg、侧孢芽孢杆菌2kg、淡紫拟青霉1kg混合制得复合菌剂，各菌种活菌数每克10⁸个以上；每克复合菌剂中有效活菌数约10亿个，杂菌数<1％，含水量<10％。

对比例10

S1、S2、S3步骤与实施例1相同。

S4.复合菌剂制备：将枯草芽孢杆菌4kg、甲基营养型芽孢杆菌3kg、侧孢芽孢杆菌2kg、淡紫拟青霉2kg混合制得复合菌剂，各菌种活菌数每克10⁸个以上；每克复合菌剂中有效活菌数约10亿个，杂菌数<1％，含水量<10％。

抗早疫病菌、疮痂病菌效果分析

测试实施例1-5和对比例1-10制备的抗病菌剂对茄链格孢菌、疮痂病链霉菌的抑制效果。测试方法：平板对峙培养法，先在无菌平板下方中央用记号笔做标记，然后在距离中央2cm，标记4个均匀分布的点，在无菌环境下，在平板中央接种茄链格孢菌、疮痂病链霉菌，在四个点处接种抗病菌剂，每个处理重复2次。在平板中央只接种茄链格孢菌、疮痂病链霉菌作为空白对照，在25℃培养一段时间，观察效果。测试结果如表1所示。计算方法：抑制率(％)＝(对照真菌的生长直径-拮抗菌作用后的真菌生长直径)/对照真菌的生长直径x100％。

表1抗早疫病菌、疮痂病菌效果分析表

马铃薯早疫病、疮痂病的防治效果测定

于2016年11月15月进行，地点为广州市白云区的广东省农科院的白云实验基地。种植模式为垄宽与行距分别为1.35m和0.70m，株间距0.17m，种植密度为5560株/667m²。播种前一天对种薯进行1.5％高锰酸钾浸泡消毒并切块。11月下旬播种，播种时施加入抗病菌剂的基肥，过程中再无追肥，2017年3月下旬收获。试验分处理组和空白对照组，约135m²，处理和空白对照间留一垄为保护行。2017年1月27日，用穴施的方法菌肥埋入马铃薯根际土壤，肥穴距根际15cm，每穴施肥5g。于2017年3月28日进行马铃薯采收，用随机取样方法采收面积为20m²的马铃薯，称重，计算产量，并对马铃薯早疫病、疮痂病发病薯块进行统计，并计算发病薯块占总贮藏薯块百分率。

表2抗早疫病菌、疮痂病菌效果分析表

表3对马铃薯的促生作用

从表1、表2、表3的实验数据可知，实施例1-5制备的复合抗病菌剂其抗早疫病菌、疮痂病菌效果优于对比例1-8单个菌种抗早疫病菌、疮痂病菌效果；且对比例9、10菌种复合比例不在本技术方案范围得到的复合抗病菌剂，其抗早疫病菌、疮痂病菌效果没有实施例1-5制备的复合抗病菌剂效果好。其中实施例4芽孢杆菌和淡紫拟青霉的重量比为8:1时，抗早疫病菌、疮痂病菌效果最好。这是因为芽孢杆菌对早疫病菌、疮痂病菌的防治效果好，当其含量高时抗病效果提高，但含量过高芽孢杆菌与淡紫拟青霉的协同效果降低，其抗病性能反而下降。因此，本发明从枯草芽孢杆菌、甲基营养型芽孢杆菌、侧孢芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、胶冻样类芽孢杆菌、淡紫拟青霉中挑选对这两种病菌抗病效果较好的多种微生物，当这些菌种以合理的比例复配，所得复合菌剂能产生协同作用，其抗早疫病菌、疮痂病菌效果优良。

根据上述说明书的揭示和教导，本发明所属领域的技术人员还可以对上述实施方式进行变更和修改。因此，本发明并不局限于上面揭示和描述的具体实施方式，对发明的一些修改和变更也应当落入本发明的权利要求的保护范围内。此外，尽管本说明书中使用了一些特定的术语，但这些术语只是为了方便说明，并不对本发明构成任何限制。

Claims (8)

1.一种马铃薯专用抗病菌剂，其特征在于，所述抗病菌剂包含芽孢杆菌和淡紫拟青霉；所述芽孢杆菌和淡紫拟青霉的重量比为8:1；

所述芽孢杆菌由枯草芽孢杆菌、甲基营养型芽孢杆菌、侧孢芽孢杆菌组成，所述枯草芽孢杆菌、甲基营养型芽孢杆菌、侧孢芽孢杆菌组成质量比为3-4:2-3:1-2。

2.根据权利要求1所述马铃薯专用抗病菌剂，其特征在于，所述马铃薯专用抗病菌剂有效活菌数10-20亿个/克。

3.如权利要求1所述马铃薯专用抗病菌剂的制备方法，包括如下步骤：

S1.菌种活化：将芽孢杆菌、淡紫拟青霉菌种分别接斜面，培养30-48小时，然后各加入到无菌水中振荡25-30分钟，待均匀后用血球计数板计数，使各种菌的每毫升有效活菌数大于1×10¹¹个，得菌悬液；

S2.种子罐发酵：一级种子罐灭菌，装入培养基后再灭菌，菌悬液接入，通入无菌空气培养，得一级种子罐发酵菌液；二级种子罐灭菌，装入培养基后再灭菌，将一级种子罐发酵液接入二级种子罐，通入无菌空气和搅拌进行培养，得二级种子罐发酵液；

S3.生产发酵罐培养：先将发酵罐灭菌，装入培养基后再灭菌，按体积百分比5％～8％的接种量将二级种子罐发酵液接入发酵罐中通入无菌空气培养，得芽孢杆菌菌剂和淡紫拟青霉菌剂，各菌种活菌数每克10⁸个以上；

S4.复合菌剂制备：将S3制备的芽孢杆菌菌剂和淡紫拟青霉菌剂均匀混合，制得复合菌剂即马铃薯专用抗病菌剂；每克复合菌剂中有效活菌数10-20亿个，杂菌数<1％，含水量<10％。

4.根据权利要求3所述马铃薯专用抗病菌剂的制备方法，其特征在于，S1所述菌种活化采用的培养基包括葡萄糖、淀粉、蛋白胨、KH₂PO₄，pH为6.0-8.0。

5.根据权利要求3所述马铃薯专用抗病菌剂的制备方法，其特征在于，S2所述一级种子罐和二级种子罐采用的培养基为PDA培养基或高氏一号培养基；培养发酵的接种量为菌剂占总发酵培养基质量的3-5％。

6.根据权利要求3所述马铃薯专用抗病菌剂的制备方法，其特征在于，S3所述培养条件：PDA培养基、温度25-30℃培养3-5天。

7.根据权利要求3所述马铃薯专用抗病菌剂的制备方法，其特征在于，S3所述培养条件：PDA培养基、温度30℃培养4天。

8.权利要求1所述的马铃薯专用抗病菌剂的用途，其特征在于，所述马铃薯专用抗病菌剂用于防治马铃薯早疫病和马铃薯疮痂病。