CN111727963A - 一种防控疮痂病的载体菌剂复合物及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明为一种防控疮痂病的载体菌剂复合物及其制备方法，提供一种纳米黏土载体，其组成成份按照质量比包括：蒙脱石4‑6g：硅藻土14‑25g：壳聚糖60‑100mg：聚乙烯亚胺9‑13mg。本发明的载体菌剂复合物能充分发挥协同抗病作用，有效防控马铃薯疮痂病。另外该制备方法工艺简单，生产成本低。

Description

一种防控疮痂病的载体菌剂复合物及其制备方法
技术领域
本发明涉及马铃薯病害防控制剂技术领域，具体涉及疮痂病防控制剂技术领域。
背景技术
马铃薯是我国第四大主粮，对于保障我国粮食安全发挥了重要作用。近年来，由于土壤生态遭到破坏，导致疮痂病频发，且呈现逐年上升趋势，不仅大大影响马铃薯品质，而且降低商品性，成为制约马铃薯产业可持续发展的关键瓶颈问题。截至目前，疮痂病尚无有效防治方法，已成为世界难题。迫切需要通过科技创新建立一种有效防治方法。
发明内容
本发明的第一目的是提供一种纳米黏土载体，其特征在于，其组成成份按照质量比包括：蒙脱石4-6g：硅藻土14-25g：壳聚糖60-100mg：聚乙烯亚胺9-13mg。
进一步地，所述的蒙脱土为100目至400目。
进一步地，所述的硅藻土为胶体级的400目。
本发明的第二目的是提供一种载体菌剂复合物，包括纳米黏土载体和复合菌湿体，其按照质量比5:1。
进一步地，所述复合菌湿体的制备方法，包括：将胶冻样类芽孢杆菌(Bacillusmucilaginosus)CGMCC 1.3714和解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)AS1.10901分别于马铃薯固体培养基上活化3次；分别取1环加至同一个50ml马铃薯液体培养基中，28℃，摇床培养2天；发酵液经12,000r/min离心1min钟后，收集复合湿菌体。
本发明第三目的是提供一种纳米黏土载体的制备方法，包括：将100-400目蒙脱石与硅藻土(胶体级，400目)按照1-2:5-7的质量比混合均匀，加水配成浓度为10-20g/L的悬浊液；向悬浊液加冰醋酸直至溶液pH为5-6，加入壳聚糖20-80mg/L，于40℃、100-140rpm下搅拌10-60分钟；加入聚乙烯亚胺3-10mg/L，并于40℃、100-120rpm下搅拌10-20分钟，于50-80℃下干燥至恒重。
本发明第四目的是提供一种载体菌剂复合物的制备方法，包括如下步骤：将纳米黏土载体复合菌湿体按照质量比5:1混合，充分搅拌结合，室温干燥。
本发明的载体菌剂复合物能充分发挥协同抗病作用，有效防控马铃薯疮痂病。另外该制备方法工艺简单，生产成本低。
附图说明
图1是解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)和胶冻样类芽孢杆菌(Paenibacillus mucilaginosus)对疮痂病链霉菌(Streptomyces scabies)4.0076的抑菌效果图。
图2是解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)和胶冻样类芽孢杆菌(Paenibacillus mucilaginosus)对疮痂病链霉菌(Streptomyces scabies)4.1765的抑菌效果图。
图3是解粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)和胶冻样类芽孢杆菌(Paenibacillus mucilaginosus)对酸疮痂链霉菌(Streptomyces acidiscabies)4.1789的抑菌效果图。
图4是解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)和胶冻样类芽孢杆菌(Paenibacillus mucilaginosus)对微白黄链霉菌(Streptomyces albidoflavus)4.3598的抑菌效果图。
图5是解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)和胶冻样类芽孢杆菌(Paenibacillus mucilaginosus)对疮痂病链霉菌(Streptomyces scabiei)4.0076、4.1765、酸疮痂链霉菌(Streptomyces acidiscabies)4.1789、微白黄链霉菌(Streptomyces albidoflavus)4.3598混合病原菌菌株的抑菌效果图。
图6是解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)和胶冻样类芽孢杆菌(Paenibacillus mucilaginosus)分别和疮痂病链霉菌(Streptomyces scabiei)4.0076、4.1765、酸疮痂链霉菌(Streptomyces acidiscabies)4.1789、微白黄链霉菌(Streptomyces albidoflavus)4.3598混合病原菌菌株共培养过程中的抑菌效果图。
图7是解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)和胶冻样类芽孢杆菌(Paenibacillus mucilaginosus)的不拮抗效果图。
具体实施方式
实施例1
1、两个单菌株制备方法：
1)菌株1为解淀粉芽孢杆菌菌株(保藏号为CGMCC No.1.10901)；菌株2为胶冻样类芽孢杆菌菌株(保藏号为CGMCC No.1.910)。
2)细菌培养方法
两个菌株分别在马铃薯固体培养基上活化3次。然后分别取1环于加至50ml马铃薯液体培养基，28℃，摇床培养2天。发酵液经12,000r/min离心1min钟后，单独收集各自的菌剂上清，各自的菌剂沉淀悬浮于等体积的无菌水中，制备各自的菌剂细胞悬液。同时菌剂菌液与菌剂上清液也一同用于试验。
2、四个病原菌
试验病原菌为疮痂病链霉菌(Streptomyces scabiei)4.0076、疮痂病链霉菌(Streptomyces scabiei)4.1765、酸疮痂链霉菌(Streptomyces acidiscabies)4.1789、微白黄链霉菌(Streptomyces albidoflavus)4.3598四种。
3、病原菌培养方法
1)马铃薯液体培养基(g/L)制备：马铃薯浸取液1L，葡萄糖20g，pH自然；马铃薯固体培养基则另外加入15g琼脂。
2)四种病原菌分别在马铃薯固体培养基上培养4－5天，28℃；用0.2ml无菌水刮取孢子和菌丝体，制成一定浓度的病原体悬液；要求100ul体积涂布平板时菌丝生长后可以铺满平板表面。
4、四种疮痂病原菌与两个单菌株的实验
1)病原菌培养方法
四种病原菌分别在马铃薯固体培养基上培养4－5天，28℃；用0.2ml无菌水刮取孢子和菌丝体，制成一定浓度的病原体悬液；要求100ul体积涂布平板时菌丝生长后可以铺满平板表面。
2)抑菌试验方法
四种病原菌各100ul分别涂布于八个平板(PDA)上，在平板局部点分别接10ul解淀粉芽孢杆菌和胶冻样类芽孢杆菌的菌剂菌液、菌剂上清和细胞悬浮液。28℃培养。3天以后观察。通过对疮痂病链霉菌(Streptomyces scabiei)4.0076和4.1765、酸疮痂链霉菌(Streptomyces acidiscabies)4.1789、微白黄链霉菌(Streptomyces albidoflavus)4.3598四种试验，发现解淀粉芽孢杆菌和胶冻样类芽孢杆菌的菌剂菌液、菌剂上清和细胞悬浮液都能有效抑制这些病原微生物生长。结果为两株菌剂对4种病原菌都有效果。
3)抑制混合菌生长试验方法
疮痂病链霉菌(Streptomyces scabies)4.0076、4.1765、酸疮痂链霉菌(Streptomyces acidiscabies)4.1789、微白黄链霉菌(Streptomyces albidoflavus)4.3598，4种病原菌各100ul涂布于同一PDA平板上，在平板局部分别点接10ul解淀粉芽孢杆菌和胶冻样类芽孢杆菌两个单种细菌。28℃培养。2天以后观察。结果为两株菌对四个混合病原菌都具有抑制效果。
4)共培养抑菌试验方法
疮痂病链霉菌(Streptomyces scabies)4.00764.1765酸疮痂链霉菌(Streptomyces acidiscabies)4.1789、微白黄链霉菌(Streptomyces albidoflavus)4.35984种病原菌各100ul与分别与10ul两株单菌剂各自涂布于PDA平板，28℃培养。2天以后观察。结果为两株细菌和四种病原菌在共生过程中，能够优先生长，其它四种菌生长受到明显抑制。
5)两株细菌混合试验方法
分别取2种单菌液交叉划线于PDA平板，28℃培养。2天以后观察。结果为两株细菌之间没有拮抗作用。
实施例2
1、制备纳米黏土载体
1)、将蒙脱石(100目)与硅藻土(胶体级，400目)按照1:5的质量比混合均匀，然后将该混合物加水配成浓度为10g/L的悬浊液。
2)、向(1)中得到的悬浊液加冰醋酸直至溶液pH为5，然后加入壳聚糖20mg/L，并于40℃下搅拌20分钟/100rpm，为蒙脱石/硅藻土表面修饰-NH2和-OH。
3)、向(2)中得到的悬浊液中加入聚乙烯亚胺3mg/L，并于40℃下搅拌100rpm10分钟，为蒙脱石/硅藻土表面修饰更多的-NH2，并于50℃下干燥至恒重，得到蒙脱石/硅藻土/壳聚糖/聚乙烯亚胺的纳米黏土载体。
2、制备解淀粉芽孢杆菌细胞悬液
1)马铃薯液体培养基(g/L)制备：马铃薯浸取液1L，葡萄糖20g，pH自然；马铃薯固体培养基则另外加入15g琼脂；
2)解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)AS 1.10901在马铃薯固体培养基上活化3次。
3)取1环于50ml马铃薯液体培养基，28℃，摇床培养2天。
4)发酵液经12,000r/min离心1min钟后，得解淀粉芽孢杆菌菌液。
5)将解淀粉芽孢杆菌菌液的上清和沉淀分开，得到解淀粉芽孢杆菌上清。
6)将解淀粉芽孢杆菌菌液的沉淀悬浮于同体积的无菌水中，得解淀粉芽孢杆菌细胞悬液。
3、制备胶冻样类芽孢杆菌细胞悬液
1)马铃薯液体培养基(g/L)制备：马铃薯浸取液1L，葡萄糖20g，pH自然；马铃薯固体培养基则另外加入15g琼脂；
2)胶冻样类芽孢杆菌(Bacillus mucilaginosus)CGMCC 1.3714在马铃薯固体培养基上活化3次。
3)取1环于50ml马铃薯液体培养基，28℃，摇床培养2天。
4)发酵液经12,000r/min离心1min钟后，分别收集上清和沉淀，沉淀悬浮于同体积的无菌水中，制备胶冻样类芽孢杆菌细胞悬液。
4、制备复合细菌菌液、复合上清和复合细胞悬浮液
将上述2、3制备好的解淀粉芽孢杆菌和胶冻样类芽孢杆菌的细菌菌液、上清和细胞悬浮液分别按照1:1的比例对应混合制备成复合细菌菌液、复合上清和复合细胞悬浮液。
5、抗菌实验
1)取100ul四种病原菌即疮痂病链霉菌(Streptomyces scabiei)4.0076、疮痂病链霉菌(Streptomyces scabiei)4.1765、酸疮痂链霉菌(Streptomyces acidiscabies)4.1789、微白黄链霉菌(Streptomyces albidoflavus)4.3598；分别涂布于四个(PDA)平板上，在平板局部点接10ul复合菌液、复合上清、和复合细胞悬浮液。
2)28℃培养。3天以后观察。
3)通过对疮痂病链霉菌(Streptomyces scabiei)4.0076、疮痂病链霉菌(Streptomyces scabiei)4.1765、酸疮痂链霉菌(Streptomyces acidiscabies)4.1789、微白黄链霉菌(Streptomyces albidoflavus)4.3598四种试验，发现复合菌液、复合上清和复合细胞悬浮液都能有效抑制四种病原菌生长。
结果证明复合菌株对4种病原菌都有效果。
6、纳米黏土载体与复合菌剂协同抗病实验
1)复合菌湿体的制备方法：
将两个菌株分别于马铃薯固体培养基上活化3次。然后分别取1环加至同一个50ml马铃薯液体培养基中，28℃，摇床培养2天。发酵液经12,000r/min离心1min钟后，收集复合湿菌体。
2)载体菌剂复合物的制备：
将纳米黏土载体与复合菌湿体按照质量比5:1混合，充分搅拌结合，室温干燥，备用。
3)疮痂病防效统计实验方法：
处理组将载体菌剂复合物施到同一块已经播种马铃薯的且疮痂病危害严重的土壤中，与对照组做好记录，待薯块膨大，随机选取实验组与对照组各10个薯块，统计病情指数，记录平均值，计算协同抗病率。
防效(％) 对照组病情指数 实验组病情指数
10.880 8.889 18.298
实施例3
1、制备纳米黏土载体
1)、将蒙脱石(250目)与硅藻土(胶体级，400目)按照1.5:6的质量比混合均匀，然后将该混合物加水配成浓度为15g/L的悬浊液。
2)、向(1)中得到的悬浊液加冰醋酸直至溶液pH为5.5，然后加入壳聚糖50mg/L，并于40℃下搅拌(110rpm)40分钟，为蒙脱石/硅藻土表面修饰-NH2和-OH。
3)、向(2)中得到的悬浊液中加入聚乙烯亚胺6.5mg/L，并于40℃下搅拌(110rpm)15分钟，为蒙脱石/硅藻土表面修饰更多的-NH2，并于65℃下干燥至恒重，得到蒙脱石/硅藻土/壳聚糖/聚乙烯亚胺纳米纳米黏土载体。
2、制备解淀粉芽孢杆菌细胞悬液
1)马铃薯液体培养基(g/L)制备：
马铃薯浸取液1L，葡萄糖20g，马铃薯固体培养基则另外加入15g琼脂；
2)解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)AS 1.10901在马铃薯固体培养基上活化3次。
3)取1环于50ml马铃薯液体培养基，28℃，摇床培养2天。
4)发酵液经12,000r/min离心1min钟后，得解淀粉芽孢杆菌菌液。
5)将解淀粉芽孢杆菌菌液的上清和沉淀分开，得到解淀粉芽孢杆菌上清。
6)将解淀粉芽孢杆菌菌液的沉淀悬浮于同体积的无菌水中，得解淀粉芽孢杆菌细胞悬液。
3、制备胶冻样类芽孢杆菌细胞悬液
1)马铃薯液体培养基(g/L)制备：马铃薯浸取液1L，葡萄糖20g，pH自然；马铃薯固体培养基则另外加入15g琼脂。
2)胶冻样类芽孢杆菌(Bacillus mucilaginosus)CGMCC 1.3714在马铃薯固体培养基上活化3次；
3)取1环于50ml马铃薯液体培养基，28℃，摇床培养2天；
4)发酵液经12,000r/min离心1min钟后，得胶冻样类芽孢杆菌菌液。
5)将胶冻样类芽孢杆菌菌液的上清和沉淀分开，得到胶冻样类芽孢杆菌上清。
6)将胶冻样类芽孢杆菌菌液的沉淀悬浮于同体积的无菌水中，得胶冻样类芽孢杆菌细胞悬液。
4、制备复合菌液、复合上清和复合细胞悬浮液
将上述2、3制备好的解淀粉芽孢杆菌和胶冻样类芽孢杆菌的菌液、上清和细胞悬浮液分别按照体积比1:1的比例对应混合制备成复合细菌菌液、复合上清和复合细胞悬浮液。
5、抗菌实验
1)取100ul四种病原菌即疮痂病链霉菌(Streptomyces scabiei)4.0076和4.1765、酸疮痂链霉菌(Streptomyces acidiscabies)4.1789、微白黄链霉菌(Streptomyces albidoflavus)4.3598；分别涂布于四个(PDA)平板上，在平板局部点接10ul复合菌液、复合上清、和复合细胞悬浮液。
2)28℃培养。3天以后观察。
3)通过对疮痂病链霉菌(Streptomyces scabiei)4.0076和4.1765、酸疮痂链霉菌(Streptomyces acidiscabies)4.1789、微白黄链霉菌(Streptomyces albidoflavus)4.3598四种试验，发现复合菌液、复合上清和复合细胞悬浮液都能有效抑制四种病原菌生长。结果证明复合菌株对4种病原菌都有效果。
6、纳米黏土载体与复合菌剂协同抗病实验
1)复合菌湿体的制备方法：将两个菌株分别于马铃薯固体培养基上活化3次。然后分别取1环加至同一个50ml马铃薯液体培养基中，28℃，摇床培养2天。发酵液经12,000r/min离心1min钟后，收集复合湿菌体。
2)载体菌剂复合物的制备：将纳米黏土载体与复合菌湿体按照质量比5:1混合，充分搅拌结合，室温干燥，备用。
3)疮痂病防效统计实验方法：处理组将载体菌剂复合物施到同一块已经播种马铃薯的且疮痂病危害严重的土壤中，与对照组做好记录，待薯块膨大，随机选取实验组与对照组各10个薯块，统计病情指数，记录平均值，计算协同抗病率。
防效(％) 对照组病情指数 实验组病情指数
12.354 9.786 20.787
实施例4
1、制备纳米黏土载体
1)、将蒙脱石(400目)与硅藻土(胶体级，400目)按照2:7的质量比混合均匀，然后将该混合物加水配成浓度为20g/L的悬浊液。
2)、向(1)中得到的悬浊液加冰醋酸直至溶液pH为6，然后加入壳聚糖80mg/L，并于40℃下搅拌120rpm 60分钟，为蒙脱石/硅藻土表面修饰-NH2和-OH。
3)、向(2)中得到的悬浊液中加入聚乙烯亚胺10mg/L，并于40℃下搅拌120rpm 20分钟，为蒙脱石/硅藻土表面修饰更多的-NH2，并于80℃下干燥至恒重，得到蒙脱石/硅藻土/壳聚糖/聚乙烯亚胺纳米纳米黏土载体。
2、制备解淀粉芽孢杆菌细胞悬液
1)马铃薯液体培养基(g/L)制备：马铃薯浸取液1L，葡萄糖20g，pH自然；马铃薯固体培养基则另外加入15g琼脂；
2)解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)AS 1.10901在马铃薯固体培养基上活化3次。
3)取1环于50ml马铃薯液体培养基，28℃，摇床培养2天。
4)发酵液经12,000r/min离心1min钟后，得解淀粉芽孢杆菌菌液。
5)将解淀粉芽孢杆菌菌液的上清和沉淀分开，得到解淀粉芽孢杆菌上清。
6)将解淀粉芽孢杆菌菌液的沉淀悬浮于同体积的无菌水中，得解淀粉芽孢杆菌细胞悬液。
3、制备胶冻样类芽孢杆菌细胞悬液
1)马铃薯液体培养基(g/L)制备：马铃薯浸取液1L，葡萄糖20g，pH自然；马铃薯固体培养基则另外加入15g琼脂。
2)胶冻样类芽孢杆菌(Bacillus mucilaginosus)CGMCC 1.3714在马铃薯固体培养基上活化3次。
3)取1环于50ml马铃薯液体培养基，28℃，摇床培养2天。
4)发酵液经12,000r/min离心1min钟后，分别收集上清和沉淀，沉淀悬浮于同体积的无菌水中，制备胶冻样类芽孢杆菌细胞悬液。
4、制备复合细菌菌液、复合上清和复合细胞悬浮液
将上述2、3制备好的解淀粉芽孢杆菌和胶冻样类芽孢杆菌的细菌菌液、上清和细胞悬浮液分别按照1:1的比例对应混合制备成复合细菌菌液、复合上清和复合细胞悬浮液。
5、抗菌实验
1)取100ul四种病原菌即疮痂病链霉菌(Streptomyces scabiei)4.0076和4.1765、酸疮痂链霉菌(Streptomyces acidiscabies)4.1789、微白黄链霉菌(Streptomyces albidoflavus)4.3598；分别涂布于四个(PDA)平板上，在平板局部点接10ul复合菌液、复合上清、和复合细胞悬浮液。
2)28℃培养。3天以后观察。
3)通过对疮痂病链霉菌(Streptomyces scabiei)4.0076和4.1765、酸疮痂链霉菌(Streptomyces acidiscabies)4.1789、微白黄链霉菌(Streptomyces albidoflavus)4.3598四种试验，发现复合菌液、复合上清和复合细胞悬浮液都能有效抑制四种病原菌生长。结果证明复合菌株对4种病原菌都有效果。
6、纳米黏土载体与复合菌剂协同抗病实验
1)复合菌湿体的制备方法：将两个菌株分别于马铃薯固体培养基上活化3次。然后分别取1环加至同一个50ml马铃薯液体培养基中，28℃，摇床培养2天。发酵液经12,000r/min离心1min钟后，收集复合湿菌体。
2)载体菌剂复合物的制备：将纳米黏土载体与复合菌湿体按照质量比5:1混合，充分搅拌结合，室温干燥，备用。
3)疮痂病防效统计实验方法：处理组将载体菌剂复合物施到同一块已经播种马铃薯的且疮痂病危害严重的土壤中，与对照组做好记录，待薯块膨大，随机选取实验组与对照组各10个薯块，统计病情指数，记录平均值，计算协同抗病率。
防效(％) 对照组病情指数 处理组病情指数
9.658 7.346 23.939

Claims (7)

1.一种纳米黏土载体，其特征在于，其组成成份按照质量比包括：蒙脱石4-6g：硅藻土14-25g：壳聚糖60-100mg：聚乙烯亚胺9-13mg。
2.依据权利要求1的纳米黏土载体，其特征在于，所述的蒙脱土为100目至400目。
3.依据权利要求1的纳米黏土载体，其特征在于，所述的硅藻土为胶体级的400目。
4.一种载体菌剂复合物，其特征在于，包括纳米黏土载体和复合菌湿体，其按照质量比5:1。
5.依据权利要求4所述的载体菌剂复合物，其特征在于，所述复合菌湿体的制备方法，包括：
将胶冻样类芽孢杆菌(Bacillus mucilaginosus)CGMCC 1.3714和解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)AS 1.10901分别于马铃薯固体培养基上活化3次；
分别取1环加至同一个50ml马铃薯液体培养基中，28℃，摇床培养2天；
发酵液经12,000r/min离心1min钟后，收集复合湿菌体。
6.一种纳米黏土载体的制备方法，其特征在于，包括：
将100-400目蒙脱石与硅藻土(胶体级，400目)按照1-2:5-7的质量比混合均匀，加水配成浓度为10-20g/L的悬浊液；
向悬浊液加冰醋酸直至溶液pH为5-6，加入壳聚糖20-80mg/L，于40℃、100-140rpm下搅拌10-60分钟；
加入聚乙烯亚胺3-10mg/L，并于40℃、100-120rpm下搅拌10-20分钟，于50-80℃下干燥至恒重。
7.一种载体菌剂复合物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
将纳米黏土载体复合菌湿体按照质量比5:1混合，充分搅拌结合，室温干燥。
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